Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Summary

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Abstract

Centrosomes הם נשמרים האברונים מבוססי microtubule מבנו ותפקודו שינוי באופן דרמטי לאורך מחזור התא והתמיינות תאים. Centrosomes הם חיוני כדי לקבוע את ציר חלוקת תאים במהלך מיטוזה וכדי nucleate cilia בשלבי ביניים. זהותם של החלבונים המתווכים שינויים הדינמיים אלה נותר ידועים רק באופן חלקי, ותפקודם של רבים מהחלבונים שהיו מעורבים בתהליכים אלה הוא עדיין בסיסי. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי זרע דרוזופילה מספק מערכת רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לתפקוד והיווצרות centrosome כמו גם לקבל תובנות לתוך הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליכים הקשורים לcentrosome. דרוזופילה היא אורגניזם מודל גנטי שהוקם בו מוטציות ב ניתן להשיג בקלות גנים centrosomal בקלות ובנותחו. יתר על כן, ההתקדמות ברגישות וברזולוציה של מיקרוסקופ אורפיתוח של סמני centrosomal מתויגים גנטי חזקים הפכו את היכולת להשתמש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל פשוטה ונגישה ללמוד centrosomes. מאמר זה מתאר את השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים לבצע מסכי גנטיים למוטציות centrosomal חדשות ולקבל תובנות לתוך התפקיד הספציפי של גנים שזוהו לאחרונה.

Introduction

האשכים דרוזופילה הם מערכת איברים מתאימה ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים והתפתחותית וכבר נסקרו בהרחבה לאורך השנים ^1-9. כתב יד זה מתמקד בשימוש באשכי דרוזופילה ללמוד centrosome, אברון סלולארי שימור. כמו במערכות אחרות, centrosome של פונקצית האשכים דרוזופילה במיטוזה, מיוזה, וciliogenesis ^10. Centrosomes מורכב של זוג מבנים מבוסס microtubule המכונים centrioles המוקף ברשת חלבון מורכבת התייחסה לחומר pericentriolar כ( PCM). צמד centriole מורכב מcentriole אמא מבוגרת וcentriole בת צעירה יותר. כתא מתקדם לקראת מיטוזה, שני centrioles להפריד, לשכפל, ולרכוש כמות גדולה של PCM כדי ליצור סופו של דבר שני centrosomes מובחן. Centrosome מכיל centriole אמא המקורית שמכונה centrosome האמא וcentrosome מכיל centriole הבת המקורית שמכונה centrosome הבת.

האשכים דרוזופילה הם אידיאליים ללימוד הבסיס המולקולרי של הביולוגיה centrosome ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור מגוון רחב של סיבות.

1. רוב חלבוני דרוזופילה הנדרשים לביולוגיה centrosome באשכים הם נשמרים בין אאוקריוטים, המצביעים על כך תובנה רלוונטית לביולוגיה centrosome בבני אדם ומינים אחרים יכולה להיות שנרכשו על ידי לימוד centrosome בדרוזופילה אשכים ^1,11-14.
2. ביצוע ניתוח שעבר מוטציה בדרוזופילה מספק יתרון משמעותי שכן, שלא כמו דגמים רבים אחרים, מוטציות centrosomal בדרוזופילה אינן עובריים קטלניות, ובכך מאפשרות לניתוח גנטי קלאסי של תפקוד centrosome. תכונה ייחודית זו של דרוזופילה היא בשל נוכחותם של תרומה אימהית שנמשכת בשלבים הקריטיים של develo העובריpment. ^1,11-14. לכן, אפשר) מוטציות מחקר שמונעות לחלוטין היווצרות centrosome וב) ללמוד את גורלו של centrosome נורמלי שהוקם בעובר המוקדם על ידי תרומה אימהית בהקשר מוטציה לאחר התרומה האימהית מוצתה עד תום (העיקרון של השיטה מתואר ^ב11).
3. transgenes פונקציונלי עם תגי ניאון מקודדים גנטי שתווית centrosome זמין. רבים מקווים אלה להשתמש אמרגנו של החלבון לנהוג שעתוק של transgene כדי למנוע ביטוי יתר חזק. הדבר חשוב במיוחד משום שביטוי יתר של חלבונים לעתים קרובות תוצאות חפצים המפריעים לניתוח של תפקוד centrosome ^1,11.
4. Centriole וcentrosome הם ייחודי ארוך לאורך spermatogenesis דרוזופילה, ובכך מאפשר לניתוח מהיר וקל של centrosome ידי הדמיה.
5. צעדים רצופים בתאי זרע וב centrosomeiology מאורגן כרונולוגי לאורך האשכים, שמתחיל בקצה האשך עם centrosomes של תאי גזע זרע ומסתיים בחלק התחתון של האשכים עם גודל מופחת centrosome ופעילות בתאי זרע בוגרים (איורים 1 ו -2). זה מאפשר זיהוי קל וניתוח של פונקצית centrosome במהלך שלבים שונים של התפתחות זרע.
6. אשכים בקלות גזורים מזחלי זכר, גלמים, ומבוגרים ^27.
7. במהלך spermatogenesis, centrosome וcentrioles להמשיך דרך הלחנה מרובה, מבנית ותפקודיות מדינות לתפקד במיטוזה, מיוזה, והיווצרות cilium. במהלך תהליכים אלה, מרכיב centrosome, כפילויות, נודד, עוגנים לחלקים ספציפיים של התא, מתבגר, חילוק, ויוצר cilium. יתר על כן, centriole של spermatid הבוגר מוליד מבשר centriolar בשם PCL ^1. גם בspermatid הבוגר, centrosome עובר תהליך גalled הפחתת centrosome לפיה היא מאבדת את מרכיבים רבים של PCM וcentriole (איורים 1 ו -2). לפיכך, מחקרים באשכים לאפשר אחד כדי לטפל בהיבטים רבים של החיים centrosome כגון שמירת centrosome בתאי הגזע, שכפול centriole, יציבות centriole, התארכות centriole, הפרדה והפרדת centriole, גיוס PCM, ciliogenesis, היווצרות PCL, הפחתת centrosome, ו התגרענות microtubule האסטרלי בין יתר.
8. לבסוף, מחקרים של הביולוגיה centrosome נעזרים במאפיינים ידועים האחרים של דרוזופילה שהפכו אותו לאורגניזם מודל מועדף למחקרים ביולוגיים. אלה כוללים זמן דור קצר, קל גנטיקה, כמו גם mutagenesis האקראי ומכוון באתר.

יחד, המאפיינים שצוינו לעיל של האשכים דרוזופילה מספק מודל שבו centrosome ניתן ללמוד על ידי הדמיה קלה, מהירה, ומפורטת. הטכניקות מתוארותבמאמר זה יושמו כדי לחקור היבטים רבים של הביולוגיה centrosome הכוללים השקעת centriole ^11, שכפול centriole ^15, גיוס PCM ^16, הרגולציה centrosome ^17, וciliogenesis ^18. טכניקות אלה גם יושמו ללמוד centrosome בתחומים אחרים של ביולוגיה כגון ויסות meiotic ^19, הרכבה ציר ^20, ופעילות centrosome בתאי גזע סימטרי חלוקת ²¹ בקרב רבים אחרים.

הדמיה של אשכים בהתחלות centrosome עם קבלת זבובים המבטאים חלבוני centrosomal גנטיים מתויגים ולבודד את האשכים מזחלי זכר, גלמים, או זבובים בוגרים. זבובים אלה זמינים ממספר קבוצות מחקר ^{1,11,15,22-25.} האשכים הזחל מכילים את כל השלבים של תאי זרע לפני מיוזה ושימושיים בעת ניתוח מוטציות שאינן קטלניים בגולם או מבוגר. עם זאת, גלמים המאוחר או אדיו צעיריםהאשכים LT הם חזקים ביותר ומכילים את כל מראש ופוסט meiotic השלבים של תאי זרע, ובכך הופכים אותם עדיפים לניתוח. מאז את מספר תאי זרע יורד ככל שהגיל לטוס, השימוש באשכים למבוגרים מתאים גם ללימוד centrosome בהקשר של הזדקנות. ^26. שיטה של בידוד אשך מזבובים בוגרים כבר תוארה בעבר ^27.

הדמיה של centrosomes ותפקודם באשכי דרוזופילה יכולה להיות מושגת באמצעות שלושה מסלולים נלווים שמוצגים כאן (איור 3). בחירת המסלול שהוא מתאים ביותר תלויה באופי השאלה החוקר הוא פונה.

המסלול כולל הדמיה של אשכים בשידור חי. זה המהיר ביותר מבין שלושת המסלולים, אבל יכול להיות מיושם רק כאשר דגימות לא צריכה להישמר וכאשר immunostaining אינו נדרש. במסלול א ', אשכים הם רכובים (שלמים, פירסינג או לחתוך) בשקופיותומעך בזהירות מתחת coverslip כדי ליצור שכבה אחת של תאים לזיהוי בקלות. לאחר מכן התאים מדגימים בעזרת שני מיקרוסקופ שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. השימוש בשלב בניגוד חשוב במיוחד עבור הניתוח של האשכים דרוזופילה משום שהוא חושף מידע סלולארי שאינו גלוי עם צורות אחרות של תאורה משודרת ובכך מאפשר זיהוי מהיר של שלבים שונים של התפתחות זרע ^28,29. עם זאת, יש לעקוב אחר שני חסרונות עיקריים. ראשית, את השלמות הצורנית של תאים היא לעתים קרובות בסכנה ברגע שהאשכים מקרע. שנית, תאים מבולבל לעתים לנוע בתוך הדגימה, מה שהופך את ההדמיה של שכבות confocal מרובות בתוך אזור מוגדר קשה. על מנת לקדם את הניתוח של סוגי תאים ספציפיים, אשכים עשויים להיות פירסינג או לחתוך כדי לכוון את דרך קרעי האשך כזה שמועך תחת מינימאלי coverslip משפיע על המורפולוגיה של סוג התא של עניין.

מסלול ב 'כולל קיבוע כימי של האשכים. מסלול זה דורש סכום ביניים של זמן להכנת דגימה ויש לו היתרון כי דגימות קבועות ניתן לשמור לניתוח מאוחר יותר. יתר על כן, קיבוע משמש להכנת מבנים תאיים נוקשה יותר, צמצום תנועה של הדגימה במהלך הדמיה. עם זאת, במיקרוסקופ שלב בניגוד הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לאחר קיבוע כימי, מה שהופך כמה שלבים של התפתחות הזרע קשה לזהות.

מסלול C הוא הזמן האינטנסיבי ביותר, אבל יש יתרון הנוסף שמבנים הסלולר הם קבועים וimmunostained, המאפשר ההדמיה של חלבונים שאינם זמינים עם תגי הגנטיקה המתאימים. יש נוגדנים רבים זמינים באופן מסחרי והן מקבוצות מחקר שונות לimmunostaining centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome באשכי דרוזופילה.

Protocol

1. הכנת א אחר אשכים בשידור חי

1. הכן PBS על ידי המסת 8.0 גרם NaCl, 0.2 גרם KCl, 1.44 גרם Na ₂ HPO _4, 0.24 גרם KH ₂ PO ₄ ב800 מיליליטר של מים מזוקקים ולהתאים את ה-pH 7.4. תביא את הנפח לL 1 ולעקר ידי מעוקר.
2. לבודד את האשכים ^כ27 שתוארו קודם לכן.
3. הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול 1 מ"ג / מיליליטר מניות ל1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. השתמש בנייר אלומיניום כדי להגן על הצינור מפני אור ולאחסן ב -20 ° C.
4. לאחר בידוד האשכים, לטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות הזכוכית מיקרוסקופ ל10 דקות. אשכים לדבוק גם לשקופיות טעונות חיובי זמינות באופן מסחרי, המאפשרים מניפולציה קלה של הדגימה. שקופיות במטען חיובי קוולנטית שונו להקנות מטען חיובי סטטי למשטח הזכוכית. בדומה לציפוי polylysine, זה מקדם את האינטראקציה של wi האשכיםה פני השטח של השקופית.
5. שטוף DAPI העודף על ידי החלפת החיץ מכתים פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. השתמש בזהירות כמו שלא להסיר בטעות את האשכים יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה.
6. הוסף 6 μl של PBS לדגימה. הסכום של חיץ המשמש צריך להיות מותאם לגודל של coverslip. הכרכים הניתנים בפרוטוקול זה הם עבור coverslip מ"מ 18 x 18. אופציונאלי: מומלץ לנקב את האשכים קרובים את המיקום היחסי של סוג התא של עניין. זה יבטיח כי יש לחץ מינימאלי על תאים אלה במהלך השלב למעוך, ובכך שמירה על שלמותם. פירסינג של האשכים יכול להתבצע באמצעות סכין מנתחים חדים, נקי.
7. בזהירות במקום coverslip על גבי הדגימה.
8. חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן דגימת החיה בעת imהזדקנות.
9. השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה.
10. לשטוף חיץ מכתים DAPI עודף על ידי החלפת החיץ פעמיים עם 6 μl של PBS. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם החיץ לאחר כל שלב כביסה. היזהר שלא להסיר בטעות הדגימה יחד עם החיץ במהלך כל שטיפה.

2. מסלול ב 'הכנת אשכים קבועים

1. הכן את חיץ תקן על ידי דילול 37% מניות פתרון פורמלדהיד ב PBS לריכוז סופי של פורמלדהיד .3.7% ב 1x PBS
2. הכן את חיץ מכתים DAPI על ידי דילול מניות 1 מ"ג / מיליליטר DAPI עד 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS.
3. לטבול את האשכים בירידת μl 6 של PBS על גבי מטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית.
4. באופן ידני לכוון את האשכים באופן ליניארי או אחרת מועדף.
5. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם PBS ולהחליף אותו עם 6 μl של תקןחיץ במשך 5 דקות.
6. השתמש בפיסת נייר סינון לפתיל משם חיץ תקן ולטבול את הדגימה ב6 μl של חיץ מכתים DAPI 10 דקות.
7. בזהירות במקום coverslip מ"מ 18 x 18 על גבי הדגימה.
8. חותם את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור כדי להבטיח שהמאגר לא מתאדה מן הדגימה בזמן ההדמיה.
9. השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה.

3. מסלול ג הכנת אשכי immunostained

siliconization coverslip: לטבול את coverslips מ"מ מרובה 18 x 18 במגש קטן המכיל פתרון siliconizing דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר מתחת למכסת מנוע קטר. ודא כי coverslips נחשפים באופן מלא ולא נערם על גב אחד את השני.

1. מניחים את הדגימה ב5 טיפת μl של PBS על coverslip siliconized. אוריינטאשכים כרצויים ולנקב את האשכים באמצעות אזמל חד. מניח בעדינות במטען חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית מעל coverslip, המאפשר PBS להפוך מפוזר באופן שווה בין coverslip והשקופיות. השתמש בפיסה קטנה של נייר סינון לפתיל משם עודפי החיץ בין coverslip והשקופיות. כחיץ הוסר על ידי נייר הסינון, העלייה בלחץ תהיה למחוץ את האשכים. צריכה להיות מוכנות דגימות רבות בו זמנית, כפי שחלקם עשוי להיות אבד או ניזוקו במהלך הפרוטוקול. חרט זכוכית ניתן להשתמש כדי לתייג את השקופיות אם סוגים שונים של דגימות יהיו מוכנים בו זמנית.
   1. שטוף את coverslips 3x דקות 1 כל אחד במים, ואחריו 3x דקות 1 כל אחד ב70% אתנול, ולשטוף סופי ל1 דקות במים. לאפשר את coverslips siliconized אוויר יבש מתחת למכסת מנוע קטר.
2. זרוק את השקופיות לתוך חנקן נוזלי ולאפשר את הדגימה להקפאה ל5-10 דק '.
3. הסר את השקופיות מliquid חנקן באמצעות מלקחיים גדולים. השתמש באזמל כדי להסיר את coverslip במהירות. הדגימה צריכה להישאר בשקופית. היזהר שלא למרוח את הדגימה במהלך תהליך זה על ידי הזזה coverslip לאורך השקופיות.
4. דגירה השקופיות במתנול prechilled בצנצנת מכתים Coplin הזכוכית ב -20 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
5. העברת השקופיות לצנצנת מכתים Coplin זכוכית המכילה אצטון prechilled ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
6. שטוף את שקופיות דקות 1 ב PBS בטמפרטורת חדר באמצעות צנצנת מכתים Coplin זכוכית.
7. הכן PBST-B על ידי השלמת PBS עם 0.1% Triton-X100 ו1% סרום חלבון שור (BSA). 5% בסרום נורמלי מאותו מין המארח כנוגדנים משני (משלב 3.14) עשוי לשמש במקום BSA כדי להפחית את רעשי רקע המופקים משני נוגדנים ספציפיים מחייב.
8. דגירה השקופיות עבור 10 דקות בPBST-B בצנצנת מכתים Coplin זכוכית לחסום אתרים ספציפיים.
9. מלא את הבארות שלתא הלחות עם מים. לחות בתוך החדר תהיה למזער את האידוי של פתרונות נוגדן מהדגימה במהלך שלבי הדגירה.
10. הכן PBST-BR ידי להשלים PBST-B עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר RNase א RNase מדרדרת RNA בדגימה ומשמש גם כסוכן חסימה נוסף על ידי קליטה חזקה למשטח הזכוכית.
    1. הנח חתיכת סנטימטר כ 1x1 של Parafilm על גבי הדגימה כדי להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה ולהגן על פתרון נוגדנים ממתאדים. סגור את תא הלחות ודגירת הדגימה בנוגדן הראשוני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
11. הסר את השקופיות מPBST-B. השתמש בפיסת נייר סינון לייבש את האזור של השקופית סביב הדגימה, תוך שימוש בזהירות לא לייבש את הדגימה עצמו. לבסוף, במקום להחליק בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה
12. בעדינות להוסיף של נוגדן ראשוני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR על גבי המפרטimen (1:200 הוא בדרך כלל ריכוז התחלה טוב לנוגדני uncharacterized).
    1. כסה את הדגימה עם פיסת 1 סנטימטר x 1 כ של Parafilm ולסגור את תא הלחות. דגירה הדגימה בשני נוגדנים במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
13. פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. דגירה השקופיות במשך 5 דקות בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית בטמפרטורת חדר לשטוף. חזור על תהליך זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
14. הסר את השקופיות מPBST-B ולמקם אותם בתא הלחות עם הדגימה פונה כלפי מעלה. בעדינות להוסיף של נוגדנים משני 100 μl בדילול מלא בPBST-BR בחלק העליון של הדגימה.
15. פתח את תא הלחות ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות Parafilm מהשקופיות. שוב, לשטוף 3x הדגימה במשך 5 דקות כל אחד בPBST בצנצנת מכתים Coplin זכוכית ואחריו 3x עבור 5 דקות כל אחד ב-PBS.
16. השתמש Kimwipe ונייר סינון כדי לייבש היטב את פני השטח של השקופית, להיות זהיר, כדי למנוע מגע או ייבוש הדגימה.
17. הוסף 6 μl של מדיה הרכבה לדגימה, מכסה בcoverslip נקי (לא מצופה סיליקון), ואת חותם קצוות עם לק.
18. השתמש סמן כדי לייעד את העמדה של האשכים על מנת להקל באיתור הדגימה בשקופית ולהמשיך להדמיה.

4. הערות הדמיה

הדמיה יכולה להיות מושגת באמצעות זקופה או הפוכה מיקרוסקופ אור רגילה או מיקרוסקופ confocal. זה חשוב שיהיה מצויד במיקרוסקופ שלב בניגוד, במיוחד עבור ההדמיה של דגימות אשכים חיים (מסלול א '). תכונה זו הפכה זמינה לאחרונה על מיקרוסקופים confocal.

כאשר האשכים לפרוץ באופן ספונטני (המסלול א '), הקצה (נובע אזור תא) נשמר בדרך כלל בשלמות, והוא קל לזיהוי, המספק סמן טוב בתחילה לאתר ולהשתמש לשם התמצאות.

_content "> Centrioles הם מבנים קטנים למדי ויש לקחת תמונות ולכן באמצעות 63X או 100X יעדים, גורם זום של 4-6X, ורזולוציה של לפחות 512 x 512 פיקסלים במידת האפשר.

תוצאות

Centrosomes לעבור טרנספורמציות מורפולוגיות ופונקציונליות מרובות במהלך spermatogenesis. תכונה זו של תאי זרע הופכת את האשכים מערכת שימושית ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה centrosome. תהליך נצפה בקלות אחד כזה הוא התארכות centrosome. בspermatogonia, סמן centriolar Ana1-GFP מסמן (איור 4 א) 0.6 מיקרומטר centriole הארוך. centriole זה מתארך במהלך spermatogenesis ומגיע באורך של 2.5 מיקרומטר בspermatids כמעט בוגר. מאז centrioles בזרע דרוזופילה הוא ארוך באופן ייחודי, הדמיה יכולה לשמש כדי להפוך את ההצהרות כמותיים לגבי התארכות centrosome (איור 4). ניתוח של אורך centriole יכול גם להתבצע ברקע מוטציה ומוטציות שונות זוהו לשנות צמיחת centriole (איור 5). דוגמאות לכך הן תמיד מוקדם (aly) ותותח (יכול), מוטציות שarresתאי זרע לא לפני תחילת המיוזה ³⁰ אך לא לחסום את התארכות centriole. במוטציות האלה, centrioles של spermatocyte הבוגר לגדול לכ ~ מיקרומטר 2.4 בהשוואה לcentrioles של תאי שליטה בי להגיע למקסימום של 1.8 מיקרומטר.

איור 1. תאי זרע וביולוגיה centrosome. א) פיתוח של תאי גזע וSpermatogonia. כל תאי הזרע שמקורם בתאי גזע נמצאו בקצה הקודקוד של האשכים. כל תא גזע מתחלק סימטרי כדי ליצור תאי גזע שיורש את centrosome אמו ואב זרע אב שיורש את centrosome בת ^{31 ב.} כצורת Spermatogonia, הם הופכים להיות מוקפים 2 תאי ציסטה, שממשיכים להקיף את Spermatocytes וSpermatids ברחבי spermatogenesis. פעמים פער Spermatogonia 4 לייצר 16 Spermatogonia, המכיל שתי centrioles. B) פיתוח Spermatocytes ומיוזה. במהלך פיתוח Spermatocyte, centrioles לשכפל פעם נוספת כדי לייצר ארבע centrioles מאורגן בשני זוגות לכל תא ו64 centrioles לציסטה. מוקדם במהלך התפתחות Spermatocyte, כל centriole עובר לקרום הפלזמה, רציפים לזה, ומתארך ליצור מבנה שדומה לcilium עיקרי ^18,32-34. בSpermatocytes הבוגר, אורך centriole מגיע ~ 1.8 מיקרומטר. Centrosomes לשחק תפקיד חיוני במיוזה. במהלך אני מיוזה, זוגות centriole שעדיין מחוברים למהלך קרום פלזמה לכיוון מרכז התא וליצור invaginations קרום תא בקצה הדיסטלי שלהם. PCM סביב centrioles גדל, nucleates microtubules האסטרלי, וcolocalizes עם מוט הציר. במהלך המעבר למיוזה השני, צמד centriole מפריד כך שרק centriole בודד presenלא בכל מוט ציר. C) Spermiogenesis. בסוף המיוזה השני, יש לו את סיבוב המוקדם Spermatid centriole אחד מצורף קרום הפלזמה invaginated. נגזר המיטוכונדריה עגולה גדול נמצא בקרבת הגרעין ומאוחר יותר מתחיל להאריך לאורך axoneme גדל בSpermatids העגול בהמשך. במהלך spermatogenesis, צורות axoneme ומתארך בתוך הציטופלסמה. בנוסף מבנה centriolar חדש המכונה PCL (הפרוקסימלי Centriole כמו) מופיע ליד centriole קיים מראש ^1. בסופו של תאי זרע, תאי שיתוף ציסטה נפוצה להפריד אחד מהשני כדי להפוך זרע נעים לבגרות מלאה. דיאגרמות של פיתוח Spermatocyte (B) וSpermiogenesis (C) מתארת ​​רק תא אחד מתוך 16 Spermatocytes ו64 Spermatids, בהתאמה לציסטה, ולא מתארת ​​את תאי ציסטה. לחץ כאן כדי להציג גדול דמות r.

איור 2. אשכי דרוזופילה. כיסוי של מיקרוסקופ שלב בניגוד וקרינת ה-GFP של אשך כל ההר המבטא את הסמן הפאן centriolar אנה-1-GFP. האזור נפרד המתאים ללוחות 1-3 של איור 1 מופרדים על ידי קו אדום מקווקו) בתאי גזע וSpermatogonia, B) Spermatocytes ומיוזה, C) Spermiogenesis.

איור 3. מסלולים לקראת centrosomes ההדמיה בדרוזופילה אשכים.

: לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 4. Centrosome התארכות במהלך spermatogenesis. א) כל שלב מציג תמונת שלב בניגוד (משמאל), תמונת הקרינה (באמצע), ותמונה מוגדלת של centrosome (מימין). תמונת שלב בניגוד מדגימה את שלב תא המסוים המבוסס על המיקום והמורפולוגיה של התא, גרעין, הגרעינון, ומיטוכונדריה. תמונת הקרינה תערוכות DNA מוכתם בDAPI (כחול). תמונת centrosome תערוכות centrosomes מתויג על ידי Asterless-GFP (ASL, תמונות למעלה) וAna1-GFP (Ana1, תמונה למטה). עיגול לבן מדגיש את קרום התא בשני תמונות שלב בניגוד וקרינה. העיגולים לבנים המקווקו והעיגול האפור בתמונה הקרינה להדגיש את עמדתו של הגרעין והגרעינון, בהתאמה. נקודות חץ צהובה לY-כרומוכמה לולאות. אדום מקווקו חוגים לסמן את המיטוכונדריה. השלבים 1-6 מתייחס ^ל29 ושלבי 13-17 מתייחס לתיאור של שלבי תא ^ב32. שלב 1: היסודי Spermatocyte. זוהה כתאים קטנים קצה של האשך. 2a שלב: פולאר Spermatocyte. שזוהה על ידי נוכחותו של כובע מיטוכונדריה בצד אחד של הגרעין. שלב 3: Apolar Spermatocyte. זוהה על ידי הגודל הגדול יחסית שלה מאשר spermatocyte וחוסר כובע מיטוכונדריה העיקריים. שלב 4: היסודי Spermatocyte. שזוהה על ידי המראה של כל: כל 3 לולאות כרומוזום Y. שלב 5: למבוגרים ראשוניים Spermatocyte. Spermatocyte הגדול ביותר המיוצר בתאי זרע שנוצר על ידי עלייה נוספת בגודל גרעיני. שלב 6: Premeiotic הראשי Spermatocyte. לולאות כרומוזום Y להתפורר והגרעין נעלם. שלב 13: בצל שלב Spermatid. תא עגול המכיל גרעין ומיטוכונדריה שווה בגודלן. שלב 17: spermatid המאוחר. זוהה כspermatid מוארך שנשאר חלק מbundlדואר של 64 spermatids עם גרעינים שנמצאו ליד הבסיס של האשכים., גרעינים הם מעט רחבים יותר מבוגר spermatids נמצא בשלפוחית ​​הזרע. ברים סולם, 10 מיקרומטר ו1 מיקרומטר. B) גרף מתאר סטייה עבור כל שלב ממוצעת וסטנדרטית, כפי שנמדד על ידי Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP (ירוק). בשלב 6, Asterless-GFP (כחול) וAna1-GFP ממוצעים (ירוקים) וסטיות תקן החפיפה וAsterless-GFP בלבד (כחול) הוא נראית לעין. החל מהשעה 13 השלב, Asterless-GFP לא לקשט את כל centriole ומדידות לא נקבעו (ND).

איור 5. Centrioles באופן חריג לזמן בשלב מוטאנטים 6 Spermatocytes של aly ויכול. AC) מיקרוסקופ אור של אשכים כולו ולוח ניאון של la centrosome נציגbeled ידי Ana1-GFP. שים לב לצורה נורמלית של האשכים בaly ויכול מוטציות, הנובעת ממחסור בspermatids כתוצאה ממעצר meiotic. ד) גרף מתאר ממוצע, סטיית תקן, והפצת נתונים של אורך centriole בwild-type, אליי ויכול . מספר לדוגמא עבור כל נקודת נתונים הוא בסוגריים. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר.

Discussion

לומד ביולוגיה centrosome באשכים לטוס באמצעות סמנים גנטי centrosomal מתויגים הוא שיטה יעילה להערכת תפקוד ופעילות centrosome בשני הקשר wild-type ו מוטציה. בפרט, המסלול מתאים לסינון מהיר של ליקויים centrosomal כגון מום, misegregation, חוסר יציבות, או אורך חריג במאמץ לזהות מוטציות חדשות. יתר על כן, cilia spermatid בהכנות חיות יישאר ניעה כ 15 דקות לאחר הנתיחה והשימוש באשכים חיים במסלול א 'מאפשר גם תנועתיות זרע להיות לטפל בקלות. מאז הפעילות של cilia ניעתי זרע קשור באופן ישיר לתפקוד centrosome, ניתן לבצע מבחני כדי לקבוע את ההשפעות של מוטציות centrosomal שונות על תפקוד הריסים. מסלול ב 'יכול לשמש לתצפיות ספציפיות יותר במיוחד כאשר הנתונים סטטיסטיים נדרשים כגון לספירת מספר centrioles לכל תא ואו מספר התאים לציסטה. מסלול C הוא הכי useful לתצפיות מפורטות הדורשות צביעה עם נוגדנים. דוגמאות כוללות תיוג של סוג תא מסוים, כגון תאי גזע, מכתים של חלבון שאין לו תג זמין כגון טובולין acetylated, או כדי לאמת את העדר או mislocalization של חלבון שבעבר מוטציה.

כאשר ההדמיה centrosomes ומבנים הקשורים בcentrosome, באמצעות סמנים גנטי מתויגים ולא נוגדנים היא לא רק באופן ניסיוני קלה יותר, אלא גם מספק תוצאות חזקות יותר ושחזור. לכן, השימוש בחלבוני centrosomal גנטי מתויגים הוא גישה אמינה לניתוחים מכניסטית וכמותיים הדורשים סט נתונים גדול. לדוגמא, השימוש בסמנים גנטי centrosomal מתויגים כבר בעל ערך במיוחד עבור כימות של אורך centriole. ניתוח כזה גילה כי מוטציות שונות יכולות להיות מסווגת לשתי קטגוריות המבוססות על ההשתנות באורך centriole. קטגוריה אחת כוללת מוטציות שchanאורך centriole ge אך אינו משפיע על סטיית תקן ¹ והקטגוריה השנייה כולל מוטציות שמשפיעות הן אורך centriole וסטיית התקן באורך ^11. נתונים כמותיים מסוג זה יכול לספק תובנות שימושיות לפונקציה של גנים centrosomal מסוימים. מוטציות centrosomal כי תערוכת אורך centriole פגום עם עלייה בסטיית התקן עשויות להיות בשל התערערות מבנה centriolar. עם זאת, אורך centriole פגום עם שגיאה סטנדרטית רגילה עשוי להצביע על כך שהמוטציה אינה מבנית לערער centriole ויש יותר סיכוי להיות בגלל שינוי במנגנון ויסות שליטה אורך centriole. בשל חוסר עקביות בimmunostaining, ניתוחים כמותיים קשים עם השימוש בסמני נוגדן לבד.

Centrosome הוא מבנה גדול ומורכב חלבוניים ורבים מהחלבונים שלה נמצאים רק בתוך הפנים שלה. שימוש centrosomal גנטי מתויגסמנים ולא הנוגדנים מאפשר לתייג באופן עקבי ברכיבים פנימיים של centrosome שאפיטופים עשויים להיות נגיש בדרך אחרת לסמני נוגדן. לדוגמא, מחקרי לוקליזציה של Bld10 באמצעות נוגדנים מוצאים את החלבון להיות מועשרים בקצות דיסטלי ופרוקסימלי של centriole ^13, בעוד Bld10-GFP מציג התפלגות אחידה יותר ^1. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון את רמת ביטוי של חלבון גנטי בתיוג מסוים, כמו זה יכול להשפיע על חלוקת חלבון. לוקליזציה של Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעה תחת אנדוגני מוגבל לקצוות הפרוקסימלי של centriole ^1,16,35 מצד השני, Sas-4-GFP ו-SAS-6-GFP הביעו תחת אמרגן היוביקוויטין חזק הם נקודתיים לאורך כל אורכו של ^12,14 centriole. שיקול חשוב נוסף הוא ההשפעה של התג הגנטי על תפקוד חלבון. ניתוח אם חלבונים גנטיים מתויגים הם פונקציונליים יכול להיות tesטד על ידי החדרת החלבון המהונדס לתוך רקע מוטציה ובודק אם החלבון המהונדס מציל פנוטיפ מוטנטי.

קיבוע של האשכים דרוזופילה יכול להתבצע באמצעות מגוון של fixatives הכימי. כאן, אנו מתארים קיבעון עם שני פורמלדהיד (מסלול ב ') ומתנול אצטון (המסלול C). עם זאת, גם מקבע ניתן להשתמש לסירוגין ומאז fixatives השונים עלול לשבש כימי אפיטופים נוגדנים מקומיים, מבחר של המקבע המתאים לimmunostaining חייב להיקבע באופן ניסיוני. Fixatives ותנאי הדגירה הבאים בדרך כלל מועסקים: פורמלדהיד .3.7%, 5 דקות בטמפרטורת חדר; מתנול, 15 דקות ב -20 מעלות צלזיוס; אצטון, 10 דקות ב -20 ° C; מתנול, 15 דקות ב -20 ° C. אחרי אצטון, 30 שניות ב-20 מעלות צלזיוס; אתנול, 20 דקות ב -20 ° C. למרות קיבעון עם אצטון, מתנול, אתנול ואינו דורש צעד permeabilization מורחב עבור immunostaining, wi קיבעוןפורמלדהיד ה צריך להיות מלווה דגירה 1 שעות בPBST-B בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא ומאפשר גישת נוגדנים לאפיטופים תאיים. יתר על כן, fixatives מסוים הם מתאים יותר לאנטיגנים מסוימים. לדוגמא, פונקציות פורמלדהיד גם לקיבוע של חלבונים קטנים, ואילו מתנול ואצטון הם מתאימים היטב לקיבעון של קומפלקסים מולקולריים גדולים ^36.

Immunostaining של האשכים דרוזופילה כבר תואר בעבר על קיום מבני הכרומטין וmicrotubule שלד תא ^29,37. כאן (המסלול C), ההליך כבר מותאם לניתוח של מבני centrosomal המכילים חלבונים גנטיים מתויגים. אנו מספקים תיאור מפורט של הליך זה כדי להנחות את האנשים שהם חסרי ניסיון בעבודה באשכי דרוזופילה. הליך זה כולל גם שינויים כדי לשפר את השימור ומורפולוגיה של אשכים, כגון על ידי שימוש שלiliconized coverslips ומטען חשמלי חיובי שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Positively Charged Slides	AZER Scientific	EMS200A+
Feather Microscalpel	Electron Microscopy Sciences	72045-30
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Boston Bioproducts	BM-220
18x18 mm coverslips number 1.5	VWR	48366 205
Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100 ml
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284-100ML
BSA	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
RNAse A	5 prime	2900142
Filter paper	Whatman	1001-055
Glass engraver	Dremel	290-01
TCS SP5 confocal microscope	Leica
Mounting Media	Electron Microscopy Sciences	17985-10
Immuno Stain Moisture Chamber, Black	Electron Microscopy Sciences	62010-37
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap	Electron Microscopy Sciences	70315