I centrosomi Imaging in Fly Testicoli

Riepilogo

Imaging di proteine ​​centrosomica durante Drosophila spermatogenesi è un metodo efficace per identificare nuove proteine ​​critiche per la biologia cntrosoma nonché per chiarire la particolare funzione di giocatori noti in questo processo.

Abstract

Cntrosome sono conservati organelli basato microtubuli cui struttura e cambiamento drammaticamente durante il ciclo cellulare e la differenziazione cellulare funzionali. Centrosomi sono essenziali per determinare l'asse di divisione cellulare durante la mitosi e nucleazione ciglia durante l'interfase. L'identità delle proteine ​​che mediano questi cambiamenti dinamici rimane solo parzialmente noto, e la funzione di molte delle proteine ​​che sono state implicate in questi processi è ancora rudimentale. Studi recenti hanno dimostrato che la Drosophila spermatogenesi fornisce un potente sistema per identificare nuove proteine ​​cruciali per la funzione centrosoma e la formazione, nonché al fine di conoscere la particolare funzione di giocatori noti nei processi centrosoma-correlati. Drosophila è un consolidato modello genetico dell'organismo in cui i mutanti in centrosomica geni possono essere ottenuti facilmente e facilmente analizzati. Inoltre, i recenti progressi nella sensibilità e risoluzione del microscopio ottico esviluppo di robusti indicatori centrosomica geneticamente etichettati hanno trasformato la capacità di usare testicoli di Drosophila come un semplice e accessibile sistema modello per studiare centrosomi. Questo articolo descrive l'uso di marcatori centrosomica geneticamente etichettati per eseguire esami genetici per i nuovi mutanti centrosomica e al fine di conoscere la specifica funzione di nuovi geni identificati.

Introduzione

Testicoli Drosophila sono un sistema idoneo organo di studiare una varietà di processi cellulari e dello sviluppo e sono stati esaminati estesamente negli anni ^1-9. Questa manoscritto concentra sull'uso dei testicoli Drosophila per studiare centrosoma, un organello cellulare conservata. Come in altri sistemi, il centrosoma della funzione testicoli Drosophila in mitosi, meiosi, e ciliogenesis ^10. Centrosomi sono composti da una coppia di strutture basate microtubuli noti come centrioli circondati da una rete proteina complesso denominato materiale pericentriolar (PCM). La coppia centriolo è composto da un vecchio centriole madre e una giovane figlia centriolo. Come la cellula progredisce verso la mitosi, entrambi centrioli si separano, duplicare, e acquistano una grande quantità di PCM per formare infine due centrosomi distinti. Il centrosoma contenente la madre centriolo originale viene indicato come il centrosoma madre e il centrOsome contenente la figlia centriolo originale viene indicato come il centrosoma figlia.

Testicoli Drosophila sono ideali per studiare le basi molecolari della biologia cntrosoma mediante microscopia a fluorescenza per una serie di motivi.

1. La maggior parte delle proteine ​​di Drosophila che sono necessari per la biologia cntrosoma nei testicoli sono conservate tra eucarioti, suggerendo che le intuizioni alla biologia cntrosoma negli esseri umani e altre specie può essere acquisita studiando centrosoma in Drosophila testicoli ^1,11-14.
2. Esecuzione di analisi mutanti in Drosophila fornisce un vantaggio significativo in quanto, a differenza di molti altri modelli, mutazioni centrosomica in Drosophila non sono embrionali letali, consentendo così l'analisi genetica classica della funzione centrosoma. Questa caratteristica unica di Drosophila è dovuto alla presenza di contributo materno che persiste durante le fasi critiche di svi embrionalepment. ^1,11-14. Così, si può a) le mutazioni di studio che eliminano completamente la formazione cntrosoma e b) studiano il destino di un centrosoma normale che si è formata nei primi embrione mediante conferimento materna in un contesto mutante dopo il contributo materno è esaurito (il principio del metodo è descritto in ^11).
3. Transgeni funzionali con tag fluorescenti geneticamente codificati che etichettano il centrosoma sono disponibili. Molte di queste linee uso proprio promotore della proteina di guidare la trascrizione del transgene per evitare marcata iperespressione. Questo è particolarmente importante perché sovraespressione di proteine ​​si traduce spesso in artefatti che interferiscono con l'analisi della funzione cntrosoma ^1,11.
4. Il centriolo e cntrosoma sono unicamente lungo tutta Drosophila spermatogenesi, permettendo così l'analisi rapida e semplice del centrosoma da imaging.
5. Passaggi consecutivi nel spermatogenesi e cntrosoma biology sono organizzati cronologicamente lungo i testicoli, a partire dalla punta testicolo con i centrosomi delle cellule staminali spermatiche e termina sul fondo dei testicoli con ridotta dimensione centrosoma e l'attività in cellule spermatiche mature (figure 1 e 2). Questo permette una facile identificazione e l'analisi della funzione del centrosoma durante le diverse fasi di sviluppo dello sperma.
6. I testicoli sono facilmente sezionati da larve maschio, pupe e adulti ^27.
7. Durante la spermatogenesi, il centrosoma e le sue centrioli procedere attraverso compositivo multipla, stati funzionali per funzionare in mitosi, meiosi, e la formazione ciglio strutturale e. Durante questi processi, le assembla centrosoma, duplicati, migra, ancore a parti specifiche della cellula, matura, divide e crea un ciglio. Inoltre, centriolo del spermatid maturo dà luogo ad un precursore centriolar denominato PCL ^1. Anche nel spermatide maturo, centrosoma subisce un processo cALLED riduzione cntrosoma quale perde molti componenti del PCM e centriolo (figure 1 e 2). Così, gli studi nei testicoli permettono di affrontare molteplici aspetti della vita cntrosoma come ritenzione centrosoma nelle cellule staminali, centriolo duplicazione, la stabilità centriolo, allungamento centriolo, separazione centriolo e la segregazione, PCM reclutamento, ciliogenesis, la formazione PCL, la riduzione centrosoma, e astrale microtubuli nucleazione tra gli altri.
8. Infine, studi di biologia cntrosoma sono aiutati da altre caratteristiche ben note di Drosophila che ne hanno fatto un modello di organismo preferita per studi biologici. Questi includono un breve tempo di generazione, facilità di genetica, nonché mutagenesi casuale e sito-diretta.

Insieme, le caratteristiche sopra indicate di Drosophila testicoli offre un modello in cui il centrosoma può essere studiato mediante imaging facile, veloce e dettagliata. Le tecniche descrittein questo documento sono stati applicati per studiare molti aspetti della biologia centrosoma tra cui la formazione centriolo ^11, centriolo duplicazione ¹⁵ PCM assunzione ^16, regolamento cntrosoma ^17, e ciliogenesis ^18. Queste tecniche sono state applicate anche per studiare il centrosoma in altre aree della biologia quali la regolamentazione meiotic ^19, assemblaggio del fuso ^20, e l'attività centrosome nella divisione delle cellule staminali asimmetrica ²¹ tra molti altri.

Imaging dei testicoli nei comincia centrosoma con l'ottenimento di mosche che esprimono le proteine ​​centrosomica geneticamente con targhetta e isolando i testicoli da larve maschio, pupe, o mosche adulte. Queste mosche sono disponibili da diversi gruppi di ricerca ^{1,11,15,22-25.} I testicoli larvali contengono tutte le fasi della spermatogenesi prima della meiosi e sono utili quando si analizzano le mutazioni che sono letali nel pupa o adulto. Tuttavia, dopo l'orario di pupa o giovane adutesticoli lt sono i più robusti e contengono tutti i pre e post-meiotici fasi della spermatogenesi, rendendoli preferibili per l'analisi. Poiché il numero di spermatozoi diminuisce con l'età mosca, l'uso di testicoli adulto è anche adatto per studiare il centrosoma nel contesto dell'invecchiamento. ^26. Procedimento di testicolo isolamento da mosche adulte è stato precedentemente descritto ^27.

Imaging di centrosomi e la loro funzione in testicoli di Drosophila può essere raggiunto attraverso tre tracce correlate che vengono presentati qui (Figura 3). Selezione di cui traccia è più appropriata dipende dalla natura della domanda il ricercatore si rivolge.

Traccia A comporta l'imaging dei testicoli dal vivo. È il più rapido delle tre tracce, ma può essere applicato soltanto quando i campioni non devono essere conservati e quando immunoistochimica non è richiesto. In Traccia A, testicoli sono montati (intatto, forato o tagliare) su vetrinie accuratamente schiacciato sotto un coprioggetto per formare un singolo strato di cellule facilmente identificabili. Le cellule vengono poi visualizzati utilizzando sia microscopia a contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. L'uso di contrasto di fase è particolarmente importante per l'analisi dei testicoli Drosophila perché rivela informazioni cellulare che non è visibile con altre forme di illuminazione trasmessa e permette una rapida identificazione delle varie fasi di sviluppo dello sperma ^28,29 così. Tuttavia, Pista A ha due svantaggi principali. In primo luogo, l'integrità morfologica delle cellule è spesso compromessa una volta che i testicoli sono rotti. Secondo, le cellule non fissate a volte si muovono entro il campione, rendendo l'imaging di strati multipli confocali in una regione determinata difficile. Per promuovere l'analisi di specifici tipi cellulari, testicoli possono essere forati o tagliati in modo da dirigere il modo rotture testicolo tale che schiacciando sotto il minimo coprioggetto agisce sulla morfologia del tipo cella di interesse.

Traccia B comporta la fissazione chimica dei testicoli. Questa pista richiede una quantità intermedia di tempo per la preparazione del campione e ha il vantaggio che campioni fissati possono essere salvate per una successiva analisi. Inoltre, fissazione serve a rendere strutture cellulari più rigida, riducendo al minimo il movimento del campione durante l'imaging. Tuttavia, la microscopia a contrasto di fase diventa molto meno informativo dopo la fissazione chimica, rendendo alcune fasi di sviluppo dello sperma difficili da identificare.

Traccia C è la più alta intensità di tempo, ma ha il vantaggio che le strutture cellulari sono fissi e immunoistochimica, permettendo la visualizzazione di proteine ​​che non sono disponibili con le opportune modifiche genetica. Ci sono molti anticorpi disponibili commercialmente e da vari gruppi di ricerca di immunoistochimica centrosomi e strutture centrosoma legati in testicoli di Drosophila.

Protocollo

1. Pista A. Preparazione dei testicoli in diretta

1. Preparare PBS sciogliendo 8,0 g di NaCl, KCl 0,2 g, 1,44 g di Na ₂ HPO _4, 0,24 g di KH ₂ PO ₄ in 800 ml di acqua distillata e portare il pH a 7,4. Portare il volume a 1 L e sterilizzare in autoclave.
2. Isolare testicoli come descritto in precedenza ^27.
3. Preparare buffer di colorazione DAPI diluendo 1 mg / ml magazzino a 1 mg / ml in PBS. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggere il tubo dalla luce e conservare a -20 ° C.
4. Dopo aver isolato i testicoli, immergere il campione in 6 ml di tampone colorazione DAPI sulla cima di un vetrino da microscopio in vetro con carica positiva per 10 min. Testicoli aderiscano bene alle commercialmente disponibili vetrini carichi positivamente, consentendo una facile manipolazione del campione. Diapositive caricate positivamente sono covalentemente modificate per impartire una carica positiva statica alla superficie del vetro. Simili rivestimento polilisina, questo favorisce l'interazione dei testicoli wi° La superficie del vetrino.
5. Lavare eccesso DAPI sostituendo il tampone colorazione due volte con 6 ml di PBS. Usare un pezzo di carta da filtro per allontanare il buffer dopo ogni lavaggio. Prestare attenzione per non rimuovere accidentalmente i testicoli con il buffer durante ogni lavaggio.
6. Aggiungere 6 ml di PBS al provino. La quantità di buffer utilizzato deve essere in funzione della dimensione del vetrino. I volumi previsti nel presente protocollo sono per un coprioggetto mm 18 x 18. Opzionale: Si consiglia di perforare testicoli vicino alla posizione relativa del tipo di cellula di interesse. Questo farà sì che la pressione minima su queste cellule durante la fase di schiacciamento, mantenendo così la loro integrità strutturale. Piercing dei testicoli può essere eseguita usando un forte, bisturi pulito.
7. Posizionare con cura il vetrino sulla parte superiore del campione.
8. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per garantire che il buffer non evapora dalle esemplare vivo mentre iminvecchiamento.
9. Usare un marcatore per designare la posizione dei testicoli per facilità nel posizionare il campione sul vetrino e procedere a imaging.
10. Lavare eccesso tampone colorazione DAPI sostituendo il tampone due volte con 6 ml di PBS. Usare un pezzo di carta da filtro per allontanare il buffer dopo ogni lavaggio. Fare attenzione a non rimuovere accidentalmente il campione con il buffer durante ogni lavaggio.

2. Traccia B. Preparazione dei testicoli fissi

1. Preparare tampone Fix diluendo 37% di soluzione di formaldeide magazzino in PBS ad una concentrazione finale di 3,7% di formaldeide in 1x PBS
2. Preparare buffer di colorazione DAPI diluendo 1 mg / ml DAPI magazzino a 1 mg / ml in PBS.
3. Immergere i testicoli in 6 microlitri goccia di PBS in cima ad una carica positiva vetrino per microscopio.
4. Orientare manualmente i testicoli in modo lineare o come altrimenti preferito.
5. Usare un pezzo di carta da filtro per evacuare la PBS e sostituirlo con 6 ml di Fixtampone per 5 min.
6. Usare un pezzo di carta da filtro per allontanare il buffer Fix e immergere il campione in 6 ml di tampone colorazione DAPI per 10 min.
7. Posizionare con cura un coprioggetto mm 18 x 18 sulla parte superiore del campione.
8. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per garantire che il buffer non evapora dal campione durante l'imaging.
9. Usare un marcatore per designare la posizione dei testicoli per facilità nel posizionare il campione sul vetrino e procedere a imaging.

3. Pista C. Preparazione di immunostained testicoli

Siliconizzazione Coverslip: Immergere più 18 x 18 millimetri vetrini in un piccolo vassoio contenente soluzione siliconatura e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente sotto una cappa aspirante. Assicurarsi che i coprioggetti sono completamente esposti e non sono impilati uno sopra l'altro.

1. Porre il campione in 5 ml goccia di PBS sul vetrino siliconato. Orientare iltesticoli come desiderato e perforare i testicoli con un bisturi affilato. Posizionare delicatamente una carica positiva vetrino da microscopio vetro sopra il vetrino, permettendo al PBS di diventare uniformemente disperse tra il vetrino e lo scivolo. Utilizzare un piccolo pezzo di carta da filtro per allontanare il tampone in eccesso tra il vetrino e scivolo. Come tampone viene rimosso dalla carta da filtro, l'aumento della pressione sarà schiacciare i testicoli. Molti i campioni devono essere preparati simultaneamente, come alcuni possono essere persi o danneggiati nel corso del protocollo. Un incisore vetro può essere utilizzato per etichettare i vetrini se saranno preparati contemporaneamente diversi tipi di campioni.
   1. Lavare il coprioggetti 3x per 1 min ciascuno in acqua, seguita da 3x per 1 min ciascuno in etanolo al 70%, e un lavaggio finale per 1 min in acqua. Lasciare i coprioggetti siliconati per asciugare sotto una cappa aspirante.
2. Cada i vetrini in azoto liquido e consentire il campione di congelare per 5-10 min.
3. Rimuovere i vetrini dalla liquid azoto utilizzando una grande pinza. Utilizzare un bisturi per rimuovere rapidamente il vetrino. I campioni devono rimanere sulla diapositiva. Fare attenzione a non spalmare il campione durante questo processo facendo scorrere il vetrino lungo la slitta.
4. Incubare i vetrini in metanolo prechilled in verticale per istologia vetro colorazione vaso a -20 ° C per 15 min.
5. Trasferire i vetrini in una vaschetta di colorazione Coplin di vetro contenenti acetone prechilled a -20 ° C per 30 sec.
6. Lavare i vetrini per 1 min in PBS a temperatura ambiente utilizzando un Coplin vetro colorazione vaso.
7. Preparare PBST-B completandola PBS con 0,1% Triton-X100 e l'1% di siero bovino Albume (BSA). 5% di siero normale dalle stesse specie ospite come anticorpo secondario (dal punto 3.14) può essere usata al posto di BSA per ridurre il rumore di fondo prodotto dal legame non specifico anticorpo secondario.
8. Incubare i vetrini per 10 minuti in PBST-B in una vaschetta di colorazione Coplin di vetro per per bloccare i siti non specifici.
9. Riempire i pozzetti dila camera umida con acqua. Umidità all'interno della camera di minimizzare l'evaporazione di soluzioni di anticorpi dai campioni durante le fasi di incubazione.
10. Preparare PBST-BR completandolo PBST-B con 100 pg / ml RNasi A. RNasi A degrada RNA nel campione e serve anche come un agente di bloccaggio supplementare assorbendo fortemente alla superficie del vetro.
    1. Inserire un pezzo di circa 1x1 cm di Parafilm sopra del campione per diffondere la soluzione di anticorpi uniformemente e proteggere la soluzione di anticorpi da evaporazione. Chiudere la camera umida ed incubare il campione in anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente.
11. Rimuovere i vetrini dal PBST-B. Usare un pezzo di carta da filtro per asciugare l'area del vetrino intorno al provino, prestando attenzione a non asciugare il campione stesso. Infine, posizionare il vetrino nella camera umida con il campione verso l'alto
12. Aggiungere delicatamente 100 ml di anticorpo primario diluito in PBST-BR in cima alla specImen (1:200 è generalmente una buona concentrazione di partenza per gli anticorpi non caratterizzati).
    1. Coprire il campione con circa 1 x 1 cm pezzo di Parafilm e chiudere la camera di umidità. Incubare la provetta in anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Aprire la camera di umidità e utilizzare pinze per rimuovere delicatamente la Parafilm dalla diapositiva. Incubare i vetrini per 5 min in PBST in un Coplin vetro colorazione vaso a temperatura ambiente per lavare. Ripetere questo processo per un totale di tre lavaggi.
14. Rimuovere i vetrini dal PBST-B e metterli nella camera umida con il campione verso l'alto. Aggiungere delicatamente 100 ml di anticorpo secondario diluito in PBST-BR sopra del campione.
15. Aprire la camera di umidità e utilizzare pinze per rimuovere delicatamente la Parafilm dalla diapositiva. Ancora una volta, lavare il 3x campione per 5 minuti ciascuna in PBST in una vaschetta di colorazione Coplin vetro seguita da 3x per 5 minuti ciascuno in PBS.
16. Utilizzare un Kimwipe e carta da filtro asciugare accuratamente la superficie del vetrino, facendo attenzione a evitare di toccare o asciugare il campione.
17. Aggiungere 6 ml di supporti di montaggio per esemplare, coprire con un coprioggetto pulito (non ricoperta di silicone), e il sigillo bordi con smalto.
18. Usare un marcatore per designare la posizione dei testicoli per facilità nel posizionare il campione sul vetrino e procedere a imaging.

4. Note Imaging

Imaging può essere raggiunto utilizzando un microscopio a luce normale posizione verticale o invertita o microscopio confocale. E 'importante che il microscopio essere equipaggiato con contrasto di fase, in particolare per l'imaging di testicoli vivi esemplari (traccia A). Questa caratteristica è recentemente diventata disponibile su microscopi confocali.

Quando i testicoli si rompono spontaneamente (Track A), la punta (staminali regione cellule) è di solito mantenuto intatto ed è facilmente identificabile, che fornisce un buon marcatore per individuare inizialmente e utilizzare per l'orientamento.

_content "> Centrioli sono abbastanza piccole strutture e le immagini devono pertanto essere prese utilizzando 63X o 100X obiettivi, un fattore di zoom di 4-6X, e una risoluzione di almeno 512 x 512 pixel quando possibile.

Risultati

Cntrosome subiscono più trasformazioni morfologiche e funzionali nel corso della spermatogenesi. Questa caratteristica della spermatogenesi rende testicoli un sistema utile per studiare vari aspetti della biologia cntrosoma. Un tale processo facilmente osservata è l'allungamento centrosoma. In spermatogoni, il marcatore centriolar ANA1-GFP segna l'(4a Figura) 0,6 micron lungo centriolo. Questo centriolo allunga durante la spermatogenesi e raggiunge una lunghezza di 2,5 micron di spermatidi quasi maturi. Poiché centrioli in Drosophila sperma sono unicamente lungo, di immagini può essere usato per fare dichiarazioni quantitative riguardanti l'allungamento cntrosoma (Fig. 4b). Analisi di lunghezza centriole può anche essere eseguita in uno sfondo mutante e vari mutanti sono stati identificati che altera la crescita centriolo (Figura 5). Esempi sono sempre presto (aly) e Cannonball (CAN), mutazioni che Arrest spermatogenesi prima dell'inizio della meiosi ^30, ma non bloccare centriolo di allungamento. In questi mutanti, centrioli del spermatocita maturo crescere a circa ~ 2,4 micron rispetto ai centrioli di cellule di controllo che raggiungono un massimo di 1,8 micron.

Figura 1. Spermatogenesi e Biologia cntrosoma. A) sviluppo delle cellule staminali e spermatogoni. Tutti gli spermatozoi provengono da cellule staminali si trovano sulla punta apicale dei testicoli. Ogni Stem Cell divide asimmetricamente per formare una Stem Cell che eredita il centrosoma madre e un spermatogonio progenitore che eredita il centrosoma figlia ^31. Come forma spermatogoni, diventano circondati da 2 celle cisti, che continuano a circondare i spermatociti e spermatidi in tutta la spermatogenesi. Spermatogoni dividere 4 volte per produrre 16 spermatogoni, contenenti ciascuna due centrioli. B) Sviluppo di spermatociti e meiosi. Durante lo sviluppo spermatocita, centrioli duplicati una volta di più per generare quattro centrioli organizzati in due coppie per cellula e 64 centrioli per cisti. Fase iniziale dello sviluppo spermatocita, ogni centriolo sposta alla membrana plasmatica, banchine ad esso, e si allunga per formare una struttura simile a una ciglio primario ^18,32-34. In maturi spermatociti, lunghezza centriolo raggiunge ~ 1.8 micron. I centrosomi svolgono un ruolo essenziale nella meiosi. Durante la meiosi I, le coppie centriolo che sono ancora attaccati alla mossa membrana plasmatica verso il centro della cellula e creano cellule invaginazioni di membrana a loro punta distale. Il PCM intorno ai centrioli cresce, nucleates microtubuli astrali, e colocalizza con il polo del mandrino. Durante la transizione a meiosi II, la coppia centriolo separa in modo che solo un singolo centriolo è present per ogni polo mandrino. C) spermiogenesi. Alla fine della meiosi II, il Primo Turno spermatide ha un unico centriolo attaccato alla membrana plasmatica invaginato. Un grande derivato mitocondriale rotonda si trova vicino al nucleo e poi inizia ad allungarsi lungo la crescente axoneme in successive spermatidi rotondi. Durante la spermatogenesi, le forme axoneme e allunga all'interno del citoplasma. Inoltre, una nuova struttura centriolar conosciuto come il PCL (prossimale Centriolo piace) appare vicino al centriolo preesistente ^1. Alla fine della spermatogenesi, le cellule condividono una cisti comune separano gli uni dagli altri per diventare pienamente maturo spermatozoi mobili. I diagrammi di spermatocita sviluppo (B) e spermiogenesi (C) rappresentano solo una cellula su 16 spermatociti e spermatidi 64, rispettivamente, per cisti, e non rappresentano le cellule cisti. Clicca qui per vederer figura.

Figura 2. La Drosophila testicoli. Una sovrapposizione di un contrasto di fase e fluorescenza GFP al microscopio di un testicolo intero-mount che esprimono il marcatore pan-centriolar Ana-1-GFP. Un'area distinta corrispondente a pannelli 1-3 di figura 1 sono separati da una linea rossa tratteggiata A) Cellule Staminali e spermatogoni, B) spermatociti e meiosi, C) spermiogenesi.

Figura 3. Tracce Verso Imaging centrosomi in Drosophila testicoli.

Figura 4. Cntrosoma Allungamento durante la spermatogenesi. A) Ogni tappa mostra l'immagine di un contrasto di fase (a sinistra), immagine di fluorescenza (al centro), e l'immagine ingrandita del centrosoma (a destra). L'immagine a contrasto di fase dimostra la fase particolare cella in base alla posizione e morfologia della cellula, nucleo, nucleolo, e mitocondri. L'immagine di fluorescenza mostra DNA colorati con DAPI (blu). L'immagine mostra centrosoma centrosomi etichettati da Asterless-GFP (Asl, top images) e ANA1-GFP (ANA1, immagine in basso). Un cerchio bianco evidenzia la membrana cellulare in entrambe le immagini a contrasto di fase e fluorescenza. I cerchi bianchi tratteggiati e il cerchio grigio nell'immagine fluorescenza evidenziare la posizione del nucleo e nucleolo, rispettivamente. Giallo freccia punta alla Y-cromoalcuni loop. Rossa tratteggiata cerchi segnano i mitocondri. Fasi 1-6 si riferisce a ²⁹ e palchi 13-17 si riferisce alla descrizione delle fasi di cellulari in ^32. Fase 1: Primaria spermatocita. Identificato come una piccola cellula una punta del testicolo. Fase 2a: Polar spermatocita. Identificato dalla presenza di un tappo mitocondri su un lato del nucleo. Fase 3: apolare spermatocita. Identificata dalla sua dimensione relativa maggiore del spermatocita primaria e la mancanza di un tappo mitocondri. Fase 4: Primary spermatocita. Identificato dalla comparsa di tutti: tutti i 3 loop del cromosoma Y. Fase 5: Mature Primario spermatocita. Grande spermatocita prodotta nella spermatogenesi, individuato da un ulteriore aumento della dimensione nucleare. Fase 6: Premeiotic Primario spermatocita. Loop del cromosoma Y disintegrano e il nucleo scompare. Tappa 13: Cipolla stage spermatide. Cellule rotonde contenenti nucleo altrettanto dimensioni e mitocondri. Fase 17: Tardo spermatide. Identificato come un spermatid allungata che rimane parte di un Bundle di 64 spermatidi con nuclei trovati vicino alla base dei testicoli., nuclei sono leggermente più ampia rispetto spermatidi maturi trovati in vescicola seminale. Bar Scala, 10 micron e 1 micron. B) Il grafico raffigura media e deviazione standard per ogni fase come misurato da Asterless-GFP (blu) e ANA1-GFP (green). Nella fase 6, (verde) le medie e le deviazioni standard Asterless-GFP (blu) e ANA1-GFP si sovrappongono e solo Asterless-GFP (blu) è evidente. A partire Tappa 13, Asterless-GFP non decora l'intera centriolo e le misurazioni non sono stati determinati (ND).

Figura 5. Anormalmente lunghi Centrioli in Fase 6 spermatociti di Aly e possono mutanti. AC) al microscopio luce dei testicoli interi e pannello fluorescente del rappresentante cntrosoma laBeled da ANA1-GFP. Si noti la forma anomala dei testicoli in aly e può mutanti, che deriva da una mancanza di spermatidi in conseguenza di un arresto meiotico. D) Il grafico raffigura deviazione media standard, e la distribuzione di dati di lunghezza centriole in wild-type, aly e può . Numero di campioni per ogni punto dati è tra parentesi. Barra della scala, 1 micron.

Discussione

Studiare la biologia centrosome nei testicoli fly mediante marcatori centrosomica geneticamente taggati è un metodo utile per valutare la funzione e l'attività cntrosoma sia in un contesto wild-type e mutante. In particolare, la pista A è adatto per lo screening rapido di anomalie centrosomica come malformazione, misegregation, instabilità o lunghezza anomala nel tentativo di identificare nuovi mutanti. Inoltre, spermatidi ciglia in preparazioni vivi rimangono mobili per circa 15 min dopo la dissezione e l'uso di testicoli vivi in ​​pista A consente anche di motilità gestire facilmente. Poiché l'attività di spermatozoi mobili ciglia è direttamente correlata alla funzionalità cntrosoma, saggi possono essere eseguiti per determinare gli effetti di varie mutazioni centrosomica sulla funzione ciliare. Traccia B può essere usato per osservazioni più specifiche soprattutto quando i dati statistici è richiesta come per contare il numero di centrioli per cella e o numero di celle per cisti. Traccia C è più useful per le osservazioni dettagliate che richiedono la colorazione con anticorpi. Gli esempi includono l'etichettatura di un particolare tipo di cellule, come le cellule staminali, colorazione di una proteina che non ha un tag disponibili come tubulina acetilata, o per verificare l'assenza o mislocalization di una proteina in un mutante.

Quando l'imaging centrosomi e strutture centrosoma-correlati, utilizzando marcatori geneticamente con targhetta piuttosto che gli anticorpi non è solo sperimentalmente più facile, ma anche fornisce risultati più affidabili e riproducibili. Pertanto, l'uso di proteine ​​centrosomica geneticamente contrassegnate è un metodo affidabile per le analisi quantitative meccanicistici e che richiedono un grande insieme di dati. Ad esempio, l'uso di marcatori centrosomica geneticamente-tag è stato particolarmente utile per la quantificazione di lunghezza centriole. Tale analisi ha rivelato che varie mutazioni possono essere classificati in due categorie in base al variabilità in lunghezza centriolo. Una categoria comprende le mutazioni che change lunghezza centriolo ma non incidono sulla deviazione standard ¹ e l'altra categoria comprende le mutazioni che colpiscono sia la lunghezza centriolo e la deviazione standard di lunghezza ^11. Tali dati quantitativi in ​​grado di fornire indicazioni utili nella funzione di particolari geni centrosomica. Centrosomica mutanti che presentano la lunghezza centriolo difettoso con un aumento della deviazione standard possono essere dovuti a una destabilizzazione di struttura centriolar. Tuttavia, lunghezza centriolo difettoso con un normale errore standard può indicare che la mutazione non strutturalmente destabilizzare centriolo ed è più probabile che sia dovuto ad un cambiamento di meccanismo di regolazione controllo lunghezza centriolo. A causa di incongruenze nella immunoistochimica, analisi quantitative sono difficili con l'uso di marcatori anticorpali da solo.

Il centrosoma è una grande, complessa struttura proteica e molte delle sue proteine ​​si trovano solo al proprio interno. Utilizzando centrosomica geneticamente tagmarcatori piuttosto gli anticorpi permette di etichettare in modo coerente i componenti interni del centrosoma cui epitopi può essere altrimenti inaccessibili ai marcatori anticorpali. Per esempio, studi di localizzazione di BLD10 utilizzando anticorpi trova la proteina sia arricchito alle estremità distali e prossimali del centriolo ^13, mentre BLD10-GFP mostra una distribuzione più uniforme ^1. Tuttavia, è anche importante considerare il livello di espressione di una particolare proteina geneticamente-tag, come questo può influenzare la distribuzione della proteina. Localizzazione dei Sas-4-GFP e SAS-6-GFP espresso sotto il loro endogena è limitata alle estremità prossimali dei centriolo ^1,16,35 D'altra parte, Sas-4-GFP e SAS-6-GFP espresso sotto il promotore forte ubiquitina sono localizzati lungo l'intera lunghezza del centriolo ^12,14. Un'altra considerazione importante è l'effetto della modifica genetica sulla funzione della proteina. Analizzare se le proteine ​​geneticamente etichettati sono funzionali può essere tesTED introducendo la proteina transgenica in uno sfondo mutante ed esaminando se la proteina transgenica salva il fenotipo mutante.

Fissazione dei testicoli Drosophila può essere eseguita utilizzando una varietà di fissativi chimici. Qui, descriviamo la fissazione sia con formaldeide (Track B) e metanolo, acetone (Track C). Tuttavia, o fissativo può essere usato in modo intercambiabile e da vari fissativi possono alterare chimicamente epitopi di anticorpi nativi, la selezione del fissativo appropriato per immunostaining deve essere determinato sperimentalmente. Le seguenti fissativi e condizioni di incubazione sono comunemente impiegati: 3,7% di formaldeide, 5 min a temperatura ambiente; metanolo, 15 min a -20 ° C; acetone, 10 min a -20 ° C; metanolo, 15 min a -20 ° C. seguito da acetone, 30 sec a -20 ° C; etanolo, 20 min a -20 ° C. Sebbene fissazione con acetone, metanolo, etanolo e non richiedono un passo permeabilizzazione estesa per immunoistochimica, la fissazione with formaldeide dovrebbe essere seguito da una incubazione 1 hr in PBST-B a temperatura ambiente per permeabilize membrane cellulari e consentire l'accesso anticorpi contro epitopi intracellulari. Inoltre, alcuni fissativi sono più adatti per particolari antigeni. Ad esempio, le funzioni di formaldeide bene per il fissaggio di piccole proteine, mentre metanolo e acetone sono particolarmente adatti per il fissaggio di grandi complessi molecolari ^36.

Immunostaining di Drosophila testicoli è stato descritto in precedenza per osservare le strutture della cromatina e il microtubulo citoscheletro ^29,37. Qui (Track C), la procedura è stata ottimizzata per l'analisi di strutture centrosomica contenenti proteine ​​geneticamente etichettati. Forniamo una descrizione dettagliata di questa procedura per guidare gli individui che non hanno esperienza nel lavorare in testicoli di Drosophila. Questa procedura prevede delle modificazioni per migliorare la conservazione e la morfologia dei testicoli, ad esempio utilizzando siliconized coprioggetto e carica positiva vetrini per microscopio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Positively Charged Slides	AZER Scientific	EMS200A+
Feather Microscalpel	Electron Microscopy Sciences	72045-30
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Boston Bioproducts	BM-220
18x18 mm coverslips number 1.5	VWR	48366 205
Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-100 ml
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Acetone	Fisher Scientific	A949-1
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T9284-100ML
BSA	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
RNAse A	5 prime	2900142
Filter paper	Whatman	1001-055
Glass engraver	Dremel	290-01
TCS SP5 confocal microscope	Leica
Mounting Media	Electron Microscopy Sciences	17985-10
Immuno Stain Moisture Chamber, Black	Electron Microscopy Sciences	62010-37
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap	Electron Microscopy Sciences	70315