Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

Summary

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Abstract

אנו מתארים את השימוש בInterferometry Bio-השכבה ללמוד אינטראקציות מעכבות של ε למקטע עם מורכב הקטליטית של ה-ATP synthase Escherichia coli. ה-ATP synthase F-סוג חיידקים הוא היעד של אנטיביוטיקה חדשה, שאושרה על ידי ה-FDA כדי להילחם שבחפת עמידה לתרופות. הבנת חיידקים ספציפיים אוטומטי עיכוב של ה-ATP synthase ידי תחום בטרמינל C-של ε למקטע יכול לספק אמצעי חדש כדי למקד את האנזים לגילוי של תרופות אנטי בקטריאליים. תחום בטרמינל C-של ε עובר שינוי קונפורמציה דרמטי כאשר מעברי האנזים בין המדינות פעילות ולא פעילים, וligands קטליטי האתר יכולים להשפיע על איזה מהתצורות של ε הוא דומיננטי. צעדי assay קינטיקה של מחייב / הניתוק של ε עם מורכב קטליטי, ובעקיפין מאהsures המשמרת של ε בכריכת האנזים ומקונפורמציה המעכבת nondissociable כנראה. אות Interferometry Bio-השכבה אינה רגישה יתר על המידה להרכב פתרון, כך גם ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands קטליטי האתר על שינויי קונפורמציה של ε.

Introduction

אינטראקציות בין חלבונים חשובות לתהליכים ביולוגיים רבים, ושיטות אופטיות ללא תווית כמו Surface Plasmon תהודה (SPR) היו בשימוש במבחנה ללמוד קינטיקה של מחייב ודיסוציאציה ^1. רוב השיטות ללא תווית לשתק biomolecule אחד על משטח חיישן ולהשתמש אות אופטי לאיתור שותף מחייב מפתרון כפי שהוא מקשר עם biomolecule המשותק ^1. בעוד SPR הוא שיטה רגישה מאוד, הוא נוטה להפרעות כתוצאה משינויים במדד השבירה של הפתרון זורם על החיישן ^2. למרות שלא רגיש כמו SPR, Bio-שכבת Interferometry (BLI) הוא פחות מושפע משינויים בהרכב מדגם ^1,3. BLI משתמש biosensors סיבים האופטיים שיש להם ציפוי ביולוגית קניינית בקצה. המערכת משמשת כאן (שמינייה-RED96) מכילה שמונה הספקטרופוטומטרים. אור לבן מוזרם לשורה של בדיקות שתעבורנה על זרוע רובוטית. חיישנים אופטיים סיבי arדואר נאסף על ידי החלליות ועבר לצלחת 96 היטב המכילה דגימות. אחת ממולקולות המטרה הוא משותק על פני השטח biosensor. אז חיישנים מועברים לבארות המכילות שותף המחייב בתמיסה. BLI עוקב אחר קשר של השותף מחייב עם המולקולה המשותקת, ולאחר מכן עוקב אחר ניתוק לאחר שעבר את החיישנים לפתרון ללא שותף המחייב. הכריכה של מולקולות על פני השטח biosensor מובילה לשינויים בהפרעות אופטיות בין גלי אור המשקפים חזרה להספקטרופוטומטרים ממשטח פנימי ומתוך הממשק החיצוני בין החיישן ופתרון. שינויים אלה בהתערבות ניתן לכמת ומשמשים לקביעת שיעורים הקינטית של כריכה, דיסוציאציה, כפי שסוכם באנימציה של איור 1.

יש לנו ליישם BLI למדוד אינטראקציות בין המתחם הקטליטית של ה-ATP synthase חיידקים ומקטע ε שלה, אשר יכול אוטומטית מעכב את האנזים. סאי ה-ATPnthase הוא nanomotor סיבובי מוטבע קרום שמזרז סינתזה והידרוליזה של ^4-ATP. קומפלקס קטליטי (F ₁₎ יכול להיות מבודד בצורה מסיסה שעובדת כATPase. יש ε המקטע שני תחומים: תחום N-המסוף (NTD) הוא דרוש להרכבה נכונה וצימוד תפקודי של האנזים, אך לא במגע ישיר עם יחידות משנה קטליטי; תחום בטרמינל C-(CTD) יכול לעכב את האנזים על ידי אינטראקציה עם יחידות משנה קטליטי מספר ^5,6. רגולציה בתיווך ε זה היא ספציפית לsynthases ה-ATP בקטריאלי ואינו נצפתה בhomologue המיטוכונדריה. ה-ATP synthase התפתחה כמטרה לתרופות אנטיבקטריאליות, כפי שמוצג על ידי אישור ה-FDA לאחרונה bedaquiline לטיפול שבחפת עמידה לתרופות ^7. לכן, מיקוד התפקיד המעכב של ε לגילוי סמים יכולים להניב antibacterials שלא לעכב את ה-ATP synthase המיטוכונדריה. עם המתחם המבודד קטליטי (F _1), εהופך למקטע קשור זה. עם זאת, עם ε חייב ₁ F, εCTD יכול לעבור שינוי קונפורמציה דרמטי, החדרה באופן חלקי לתוך החלל המרכזי של האנזים ולהרכיב מדינה מעכבת שלא סביר לנתק ישירות ^6,8. אנו משתמשים BLI למדוד קינטיקה של F ₁ / ε מחייב ודיסוציאציה, ובעקיפין, על מנת לבחון אפקטי allosteric של קטליטי אתר ligands על קונפורמציה של ε.

במערכת שלנו, ε נבחר לקיבוע על משטח החיישן מאז אות BLI (כמו SPR) הוא רגיש למסה של המולקולות מחייבות על פני השטח. מקטע ε הוא (~ 15 KDA) קטן יחסית למתחם העיקרי F ₁ (~ 347 KDA). לפיכך, אות BLI גדולה יותר תגרום מכריכה של ₁ F לε המשותק. על מנת לפקח דיסוציאציה F _1, אשר יכול להיות מאוד איטי, ε חייב להיות חזק משותק. לכן בחרנו biotinylate; ולשתק אותו על biosensors streptavidin מצופה. ניתן biotinylated חלבונים על ידי שינוי (i) אקראי של lysines פני השטח ^9, (ii) תגובה של ציסטאין ילידים מהונדס או ייחודי עם מגיב ביוטין-maleimide ¹⁰ או (iii) גנטי הוספת הפפטיד יוטין-acceptor ספציפי שbiotinylated אנזימים במהלך בביטוי vivo של החלבון מתויג ^11. במערכת שלנו, ε הוא biotinylated באמצעות שיטה (iii) ^8. ברגע שε-מתויג ביוטין הוא משותק על חיישני streptavidin, BLI יכול למדוד את הכריכה וניתוק של ₁ F כי כבר מדולדל של ε למקטע (F ₁ (-ε)). לניסויים שתוארו כאן, מבחני ראשוניים שנעשו כדי לקבוע כמויות סבירות של חלבון biotinylated כדי לשתק בחיישנים. זה יכול להשתנות, בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון ושותף המחייב שלה, אבל המטרה היא לקבוע כמות מזערית של חלבון לא משותקיםכובע מספק (i) מקובל אות לרעש לכריכת קינטיקה עם ריכוז נמוך של שותף המחייב (להלן K _D) וכן (ii) עיוות מינימאלית של כריכת קינטיקה עם ריכוז להרוות-קרוב של שותף המחייב. כמו כן, הרכב של biotinylation עשוי להשתנות (אך להימנע> ביוטין / חלבון mol mol 1), ולכן חלק assay הראשוני עשוי להיות נחוץ לכל מנה חדשה של חלבון biotinylated כדי לאשר שאות BLI עקבית יכולה להיות מושגת בחוסר התנועה בstreptavidin מצופה חיישנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תכנות המכשיר לAssay BLI

הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת מראש כדי לאפשר את המנורה כדי להתחמם, זה הכרחי כדי למזער את הרעש ולהיסחף באותות אופטיים במהלך הניסוי. הגדר את הטמפרטורה הרצויה באמצעות כרטיסיית המכשיר לprewarm מדגם בעל הצלחת. ואז להגדיר את עיצוב הניסיון בתוכנת רכישת נתונים. בחר "ניסוי החדש קינטיקס" בכרטיסייה אשף הניסוי. זה מציג תפריט עם לשוניות עם כל הצעדים שחייבים להיות מוגדר.

1.1. הגדרת פלייט

הגדר את העמודות כדי לשמש על צלחת מדגם 96 היטב. הקצאת עמודות להכיל חיץ, חלבון משותק או שותף מחייב. לכל עמותה גם, הזן את הריכוז מחייב שותף לשמש. הערה: יש לו את הגדרת הצלחת שמוצגת באיור 2 אפשרויות למבחנים שונים.

1.2. הגדרת assay

ontent "> הגדר את כל נחוצים עבור assay הצעדים. אלה כוללים Baseline (ט) (מספר), (ii) טוען, (iii) התאחדות וכן (iv) דיסוציאציה מחייב שותף. ואז, כפי שיתואר להלן, לקשר צעדי assay פרט עם עמודות של בארות על צלחת המדגם על ידי בחירת צעד assay ולאחר מכן לחיצה כפולה על העמודה המתאימה. תוכניות זה החיישנים שעברו מטור אחד של בארות למשנהו במהלך assay.

1. Baseline
   להתחיל בצעד קצר בסיסי (≥ 60 שניות), עם חיישנים במאגר assay (איור 2, טור 1), להקים אותות BLI ראשוניים בצלחת 96 היטב.
2. טוען (לשתק את חלבון biotinylated על החיישנים)
   הקצאת חיישנים לבארות שיכילו חלבון biotinylated (איור 2, עמודת 2). השתמש בפונקצית הסף כדי להשיג רמה קבועה מראש של מחייב (ראה מבוא). הגדר את אפשרות הסף, כך שכל החיישנים יהיו מהלךד לטור הבא של בארות, כאשר כל אחד מהחיישנים מגיע לסף.
3. Baseline
   כולל צעד בסיסי אחר במאגר (איור 2, טור 3, בדרך כלל> 5 דקות) כדי לשטוף חלבוני biotinylated nonimmobilized מהחיישנים ולהקים אותות בסיס חדשים, יציבים. עבור מבחני מחייב / ניתוק בסיסיים בלבד (כמו באיור 3), כולל צעד נוסף בסיסי (60 שניות) עם חיישנים בבארות חדשות של חיץ (איור 2, טור 4) לפני השלב האגודה.
4. האגודה (של השותף מחייב את החלבון המשותק)
   עבור assay בסיסי מחייב / דיסוציאציה (כמו באיור 3), בחר טווח ריכוזים של שותף מחייב לשמש לחיישנים / בארות שונות (איור 2, בטור 5). התאם את זמן צעד, כך שלפחות ריכוז להרוות של שותף המחייב צריך גישת שיווי משקל מחייב אות. עבורassay כדי לבדוק את השפעות allosteric של ligands הקטן על ניתוק של מתחם חלבונים (כמו באיור 5), בחר ריכוז אחד גבוה של שותף מחייב (~ פי 10 מעל המוערך K _D) לשימוש בכל בארות העמותה.
5. דיסוציאציה (של שותף המחייב)
   עבור assay בסיסי מחייב / ניתוק בלבד (כמו באיור 3), לייעד את החיישנים כדי לחזור לעמודת 4 (איור 2), אותו בארות המאגר כמשמש לבסיס הנוסף לפני האגודה. עבור assay כדי לבחון השפעות allosteric של ligands הקטן, במקום לייעד חיישנים כדי לעבור לעמודה 6 (איור 2), שבו כל אחד גם יכול להכיל חיץ בתוספת ligands allosteric שונה.

1.3. הקצאת חיישן

לציין את מיקומם במגש החיישן שיכיל חיישני prewetted עבור assay. זהה את כל עמדות ריקות מאז הניסוי FAIl אם אין חיישנים נאספים.

1.4. ניסוי ביקורת

דמיינו את כל הצעדים המתוכננים כדי לבדוק טעויות ולחזור כדי לתקן אותם.

1.5. הפעל ניסוי

הזן את פרטים דרושים, ובכלל זה מיקום של קבצי הנתונים. הזן את הטמפרטורה הרצויה לצורך הניסוי. אם חיישנים עדיין דורשים prewetting, בחר את האפשרות לדחות את תחילת הניסוי. לבסוף, לאחר כל הכנת המדגם היא מלאה (שלב 2) והן את צלחת המדגם ומגש חיישן נטענות במכשיר, לחץ על כפתור Go כדי להפעיל את assay.

2. לדוגמא הכנה

1. הכן את חיץ assay מתאים. המאגר משמש לניסויים מוצגים באיורים 3 ו -5: 20 מ"מ מגבים (3 - חומצה (N-morpholino) propanesulfonic), טריס (טריס (hydroxymethyl) אמינו מתאן) (הוסיפו לכדי להתאים את pH 8.0), 50 מ"מ KCl. כולל ארגון ה-BSA (אלבומין בסרום שור, חומצות שומן חופשי, 0.5מ"ג / מיליליטר סופי) במאגר עבור כל שלבי assay ולתמיד דילולים של חלבון biotinylated או השותף מחייב למזער ספציפי מחייב של חלבונים לחיישנים.
2. לדלל את חלבון biotinylated (ε) במאגר assay לריכוז מתאים (ראה מבוא).
3. הכן דילולים של שותף המחייב (F ₁ (-ε)) במאגר assay (ראה דיון לטווח של ריכוזים להשתמש).
4. Prewet חיישני streptavidin המצופה לפחות 10 דקות כדי להסיר ציפוי סוכרוז המגן שלהם. הסר את המדף המכיל חיישן ממגש החיישן ולהכניס את צלחת 96 היטב בחלקו התחתון של המגש, הזזה פינה אחת של הצלחת לתוך החריץ המכוון על המגש. לטור של חיישנים כדי לשמש, להוסיף 200 μl של חיץ assay לכל טוב באותה עמודה של צלחת 96 היטב. להחזיר את המתלה של חיישנים למגש בכיוון הנכון (עם כרטיסיות בחריצים).
5. כפי שהוקצה במהלך תכנות בשלב 1, למלא בארות oו צלחת המדגם עם חיץ assay או דילולים החלבון המתאימים, כמו באיור 2. למנוע החדרת בועות, כפי שהם יכולים לגרום לרעש באותות אופטיים. כולל בארות התייחסות אחת או יותר שמשמיטות או חלבון (i) biotinylated או (ii) שותף מחייב.
6. פתח את הדלת של המכשיר והכנס את מגש החיישן על הבמה (משמאל), עם הכרטיסיות של המגש מוכנסות לתוך החריצים של הבמה. הכנס את צלחת המדגם לבעל הצלחת (מימין); לוודא כי הצלחת יושבת שטוחה ובכיוון הנכון, כפי שמצוין על בעל הצלחת. סגור את הדלת ולהתחיל assay מתכנית רכישת נתונים (שלב 1.5).

3. עיבוד נתונים

1. לאחר assay יש לרוץ, לפתוח את תוכנת ניתוח נתונים ולטעון את התיקייה המכילה את הנתונים. לחץ על הלשונית "עיבוד" כדי לראות תפריט צעד חכם עיבוד (בצד השמאל) ואת הנתונים הקינטית הגלם, עם כל חיישן (AH) שהוקצה בצבע שונה (ראהאיור 3).
2. תחת "נתונים לבחירה", לחץ על הכפתור "חיישן לבחירה". על "מפת פלייט לדוגמא", לייעד את הבארות לחיישני 1 או 2 שליטה (G, H בassay של איור 3) כמו בארות התייחסות. בתפריט העיבוד, סמן את תיבת "חיסור" ובחר באפשרות "הפניה ולס" להחסיר אות ייחוס (בודדת או בממוצע) מהאותות של כל חיישן אחר.
3. יישר את כל העקבות לY = 0 על ידי שימוש בצעד "יישור Y הציר". בחר "Baseline" כצעד היישור (זה להיות הבסיס האחרון לפני השלב האגודה). עבור "טווח זמן", הזן שעברה 10 שניות של בסיס ש( כלומר 50-60 שניות לתחילת מחקר 60-sec, כמו באיור 3).
4. סמן את תיבת "Inter-צעד תיקון" כדי למזער משמרות אות בין צעדי האיגוד ודיסוציאציה. בחר ליישר קו בסיס או דיסוציאציה.
5. בחר פונקצית סינון Savitzky-Golay ברוב המקרים ולחץ על "נתונים בתהליך!" כדי להמשיך. ראייה לבדוקעיבודים הסופיים (פנל ימני תחתון). עם מבחני המיועדים לניתוח נתונים הגלובלי (כמו באיור 4), אם עקבות אות מראות שינוי משמעותי בין האיגוד וצעדי דיסוציאציה, לשנות את הבחירה של דיסוציאציה או Baseline ל" תיקון אינטר הצעד "ולעבד מחדש את הנתונים לפני שתמשיך לנתונים ניתוח.

4. ניתוח נתונים

לחץ על הלשונית "ניתוח" בניתוח נתונים כדי להתחיל. הערה: בדוגמא על השלבים להלן לניתוח הגלובלי של עקומות מחייב / ניתוק מרובים (כמו באיור 3).

1. ל" צעד כדי לנתח ", בחר איגוד ודיסוציאציה. עבור "דגם", בחר 1:1. הערה: אפשרויות מוגבלות אחרות זמינות.
2. ל" התאמה ", לבחור גלובלי (מלא). עבור "קיבוץ לפי" בחר צבע (כמו בגרף). בחר _{"מקסימום} R לא צמוד על ידי חיישן" כדי לאפשר התאמה עצמאית של _{מקסימום} R (תגובת אות מקסימלי על להרוות מחייב של הנקובtner לחלבון המשותק). הערה: אנחנו עושים את זה עבור רוב מבחני, כמו חיישנים להשתנות מעט בכמות החלבון המשותקת (ראה איור 3, טוען).
3. בטבלה המוצגת, ודא שיש כל עקבות החיישן להיות מנותחים באותו צבע, ולכן הם ינותחו כמערכת גלובלית. במידת צורך, בחר חיישן אחד או יותר עקבות להשמיט ממדידה העולמית: תחת העמודה "כלול", לחץ לחיצה ימנית על מיקום החיישן הרצוי ובחר "תכלול ולס".
4. לחץ על "Curves Fit!" כדי להתחיל את ניתוח רגרסיה ליניארית. לבחון את התוצאות מתאימות, הכוללות כיסוי (i) של עקומות רגרסיה עם עקבות נתוני חיישן (כמו באיור 4), (ii) מגרשים של שאריות הולמת, וכן (iii) טבלה עם ערכי פרמטרים שנקבעו (קבועי קצב, R _{מקסימום,} K _D) ונתונים סטטיסטיים (סטיות התקן עבור פרמטרים, צ'י בריבוע, R ^2).
5. תחת "יצוא נתונים", לשמור את התוצאות מתאימות על ידי לחיצה על "יצוא טבלה ל. קובץ CSV". לgrapהינג או ניתוח נוסף של הנתונים / עקומות מצוידות בתוכנה אחרת, לחץ על "התאמת תוצאות יצוא" כדי לשמור את הנתונים של כל חיישן ועקומה מצויד בקובץ טקסט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

זמן אמת מחייב וקינטיקה BLI הניתוק מוצגות באיור 3. ניסוי זה נעשה עם חיץ assay בעמותה ודיסוציאציה. ניסוי זה החל בצעד בסיסי 10 דקות מאז החיישנים היו prewet רק לזמן קצר. בשלב בא, ε biotinylated הועמס על החיישנים. אין ניתוק לגילוי של ε התרחש לאורך כל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מכשירים זמינים כעת עבור BLI לאפשר תפוקה משמעותית וגמישות במבחנים לאינטראקציות biomolecular. דגימות פתרון שונות הם ויתרו בבארות של צלחת microtiter שחורה, ומערכת של חיישני BLI מקבילים מתוכנתות לנוע קדימה ואחורה בין העמודים של בארות על הצלחת. הדגימות הם עוררו על ידי טלטול מסלולית לא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available