Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Resumo

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Resumo

Descreve-se o uso de bio-camada de interferometria para estudar interacções inibidoras de subunidade ε com o complexo catalítico de Escherichia coli ATP sintase. Bacteriana tipo F ATP sintase é o alvo de um novo antibiótico, aprovado pela FDA para combater a tuberculose resistente a medicamentos. Compreender bactérias específicas auto-inibição da sintase do ATP pelo domínio C-terminal da subunidade ε poderia proporcionar um novo meio para a enzima alvo para a descoberta de medicamentos anti-bacterianos. O domínio C-terminal de ε sofre uma alteração conformacional dramática quando as transições de enzimas entre os estados activos e inactivos, e ligandos do local catalítico, que podem influenciar de conformações de ε é predominante. As medidas do ensaio de cinética de ε ligação / dissociação com o complexo catalítico, e indiretamente meamede a mudança de ε ligado a enzima para e a partir da conformação inibitória aparentemente nondissociable. O sinal de interferometria Bio-camada não é muito sensível para a composição da solução, de modo que também pode ser utilizado para monitorizar os efeitos alostéricos de ligandos do local catalítico de alterações conformacionais do ε.

Introdução

Interacções proteína-proteína são importantes para muitos processos biológicos, e métodos ópticos livre do rótulo como a superfície Plasmon Resonance (SPR) têm sido utilizados in vitro para estudar a cinética de ligação e de dissociação ^1. A maioria dos métodos sem rótulo imobilizar uma biomolécula em uma superfície do sensor e usar um sinal óptico para detectar um parceiro de ligação de solução, uma vez que se associa com a biomolécula imobilizada ^1. Enquanto SPR é um método altamente sensível, é propenso a interferências devido a mudanças no índice de refração da solução que flui sobre o sensor ^2. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, Bio-camada Interferometria (BLI) é menos afetado por mudanças na composição da amostra ^1,3. BLI usa biossensores de fibra óptica que têm um revestimento biocompatível proprietária na ponta. O sistema utilizado aqui (Octeto-RED96) contém oito espectrofotômetros. A luz branca é canalizada para uma linha de sondas que se movem em um braço robótico. Sensores de fibra óptica are captado pelas sondas e mudou-se para uma placa de 96 poços contendo amostras. Uma das moléculas alvo é imobilizado na superfície do biossensor. Em seguida, os sensores são movidos para cavidades contendo o parceiro de ligação em solução. BLI monitora associação do parceiro de ligação com a molécula imobilizada e depois monitora dissociação depois de se mudar os sensores de solução sem o parceiro de ligação. A ligação de moléculas de superfície do biossensor leva a alterações na interferência óptica entre ondas de luz que reflectem para trás para os espectrofotómetros a partir de uma superfície interna e externa a partir da interface entre o sensor e solução. Estas alterações na interferência pode ser quantificado e utilizado para determinar as taxas cinéticas de ligação e de dissociação, tal como resumido na animação da figura 1.

Temos aplicado BLI para medir as interacções entre o complexo catalítico da ATP sintase bacteriana e sua subunidade ε, o qual pode auto-inibir a enzima. ATP synthase é um nanomotor rotativo encaixado à membrana que catalisa a síntese e hidrólise de ATP ^4. O complexo catalítico (F ₁₎ pode ser isolado de uma forma solúvel que funciona como uma ATPase. Subunidade ε tem dois domínios: o domínio N-terminal (NTD) é necessário para a montagem correcta e acoplamento funcional da enzima, mas não interagem directamente com as subunidades catalíticas; do domínio C-terminal (CTD) pode inibir a enzima, interagindo com várias subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulação mediada por ε é específico para ATP sintases bacterianas e não se observa no homólogo mitocondrial. ATP sintase emergiu como um alvo para drogas antibacterianas, como mostrado pela recente aprovação do FDA bedaquiline no tratamento da tuberculose resistente aos medicamentos ^7. Assim, visando papel inibitório da ε para a descoberta da droga poderia render antibacterianos que não inibem a ATP sintase mitocondrial. Com o complexo catalítico isolado (F _1), εtorna-se uma subunidade dissociáveis. No entanto, com ε ligado a M _1, o εCTD pode sofrer uma alteração conformacional dramática, parcialmente inserção na cavidade central da enzima e formando um estado de inibição, que é pouco provável que se dissociam directamente ^6,8. Usamos BLI para medir cinética de F ₁ / ε ligação e dissociação, e indiretamente, para examinar os efeitos alostéricos do local catalítico ligantes na conformação de ε.

No nosso sistema, ε foi escolhido para a imobilização na superfície do sensor, uma vez sinal BLI (como SPR) é sensível à massa das moléculas de ligação à superfície. A subunidade ε é pequena (~ 15 kDa), em relação ao principal complexo F ₁ (~ 347 kDa). Assim, um sinal de BLI maior irá resultar da ligação de F ₁ a ε imobilizada. A fim de monitorar F ₁ de dissociação, o que pode ser muito lenta, ε deve ser fortemente imobilizada. Assim, optou-se por biotinilarE imobilizá-la em biossensores revestidas com estreptavidina. As proteínas podem ser biotinilada por (i) a modificação aleatória de lisinas da superfície ^9, (ii) a reacção de uma cisteína nativa única ou engenharia com um reagente biotina-maleimida ^{de 10} ou (iii) a adição de um péptido geneticamente biotina-receptor específico que é enzimaticamente biotinilado durante expressão in vivo da proteína marcada ^11. No nosso sistema, ε é biotinilado utilizando método (iii) ^8. Uma vez ε marcado com biotina, está imobilizado sobre sensores estreptavidina, BLI pode medir a ligação e dissociação do F ₁ que foi esvaziada da subunidade ε (F ₁ (-ε)). Para as experiências aqui descritas, os ensaios preliminares foram feitos para determinar quantidades razoáveis ​​de proteína biotinilada para imobilizar sobre os sensores. Isto pode variar, dependendo do peso molecular da proteína e do seu parceiro de ligação, mas o objectivo é o de determinar uma quantidade mínima de proteína imobilizada tchapéu fornece (i) aceitável sinal-ruído para a cinética de ligação com uma baixa concentração do parceiro de ligação (abaixo K _D) e (ii) uma distorção mínima de cinética de ligação com a concentração de quase saturação do parceiro de ligação. Além disso, a estequiometria de biotinilação pode variar (mas evitar> 1 mol biotina / proteína mol), de modo algum ensaio inicial pode ser necessário para cada novo lote de proteína biotinilada para confirmar que um sinal consistente BLI pode ser alcançada durante a imobilização da estreptavidina-revestida sensores.

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Protocolo

1. Programação do Instrumento de BLI Assay

Ligue o instrumento pelo menos uma hora de antecedência para permitir que a lâmpada para aquecer, o que é necessário para minimizar o ruído e deriva em sinal óptico durante o experimento. Regule a temperatura desejada por meio da guia instrumento para pré-aquecimento do suporte da placa de amostra. Em seguida, criar o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione "New Kinetics Experiment" na guia Assistente de Experiment. Isto apresenta um menu com abas com todos os passos que devem ser definidos.

1.1. Definição Placa

Definir as colunas para ser utilizado na chapa de amostra, de 96 poços. Atribuir colunas para conter buffer, proteína imobilizada ou parceiro de ligação. Para cada associação bem, introduzir a concentração de agente de ligação a ser usado. Nota: a definição da placa mostrada na Figura 2 tem opções para ensaios diferentes.

1.2. Definição Assay

EOR "> Definir as medidas necessárias para o ensaio. Estas incluem: (i) Base (vários), (ii) a carregar, (iii) associação e (iv) A dissociação do parceiro de ligação. Em seguida, como descrito abaixo, as etapas do ensaio ligação individuais com colunas de poços na placa de amostra, selecionando a etapa de análise e, em seguida, clicar duas vezes sobre a respectiva coluna. Este programa os sensores de ser movido de uma coluna de poços para o próximo durante o ensaio.

1. Linha de Base
   Começar com uma breve etapa de linha de base (≥ 60 seg), com os sensores em tampão de ensaio (figura 2, coluna 1), para estabelecer os sinais de BLI iniciais na placa de 96 poços.
2. Carregando (imobilizando a proteína biotinilada sobre os sensores)
   Atribuir os sensores para os poços que contêm a proteína biotinilada (figura 2, coluna 2). Use a função de limite para atingir um nível pré-determinado de ligação (ver Introdução). Defina a opção de limite para que todos os sensores estarão movimentod para a próxima coluna de poços, quando qualquer um dos sensores atinge o limiar.
3. Linha de Base
   Incluir uma outra etapa de referência em tampão (Figura 2, a coluna 3, normalmente> 5 minutos), para lavar as proteínas biotiniladas nonimmobilized a partir dos sensores e os sinais de referência estabelecer novos, estáveis. Para os ensaios de ligação de base / dissociação apenas (como na Figura 3), incluir um passo adicional de linha de base (60 seg) com sensores em novos poços de tampão (Figura 2, coluna 4), ​​antes do passo de associação.
4. Associação (do parceiro de ligação à proteína imobilizada)
   Para um ensaio de ligação de base / dissociação (como na Figura 3), seleccionar um intervalo de concentrações de agente de ligação a ser usadas para diferentes sensores / poços (figura 2, coluna 5). Ajustar o tempo de passo, de modo que pelo menos uma concentração de saturação do agente de ligação deve aproximar-se do equilíbrio de sinal de ligação. Para umaensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes na dissociação do complexo proteína-proteína (tal como na Figura 5), seleccionar uma única concentração elevada de agente de ligação (~ 10 vezes superior ao estimado K _D) para a utilização em todos os poços de associação.
5. A dissociação (do parceiro de ligação)
   Para um ensaio de ligação de base / dissociação única (como mostrado na Figura 3), pode designar os sensores para voltar à coluna 4 (Figura 2), os mesmos poços como tampão utilizados para a linha de base extra antes de associação. Para um ensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes, em vez designam sensores para mover a coluna 6 (Figura 2), em que cada poço pode conter tampão mais diferentes ligandos alosticos.

1.3. Atribuição Sensor

Indicam os locais do tabuleiro sensor que irá conter sensores prewetted para o ensaio. Identificar todas as posições vazias desde o experimento fail se não sensores são apanhados.

1.4. Revisão Experiment

Visualize todas as medidas planejadas para verificar se há erros e voltar para corrigi-los.

1.5. Execute Experiment

Digite os detalhes necessários, incluindo a localização dos arquivos de dados. Digite a temperatura desejada para o experimento. Se os sensores ainda exigem prewetting, selecione a opção de adiar o início do experimento. Finalmente, uma vez que toda a preparação da amostra é completo (passo 2) e tanto a placa de amostra e sensor de bandeja são carregados no instrumento, clique no botão Go para executar o ensaio.

2. Preparação de Amostras

1. Preparar um tampão de teste apropriado. Tampão utilizada para as experiências mostradas nas Figuras 3 e 5: 20 mM de MOPS (ácido 3 - (N-morfolino) propanossulfónico), Tris (tris (hidroximetil) amino-metano) (adicionados para ajustar o pH a 8,0), KCl 50 mM. Incluir BSA (albumina de soro de bovino, de ácidos gordos livres-, 0,5mg / ml final) no tampão para todas as etapas do ensaio e para todas as diluições da proteína biotinilada ou parceiro de ligação para minimizar a ligação não específica de proteínas para os sensores.
2. Dilui-se a proteína biotinilada (ε) em tampão de ensaio até uma concentração apropriada (ver introdução).
3. Preparar diluições do parceiro de ligação (F ₁ (-ε)) em tampão de ensaio (ver discussão para a gama de concentrações de usar).
4. Prewet os sensores revestidos com estreptavidina durante pelo menos 10 minutos para remover o revestimento de protecção de sacarose. Retire o suporte contendo o sensor a partir da bandeja do sensor e inserir uma placa de 96 poços no fundo do tabuleiro, deslizando um canto da placa no entalhe de orientação sobre a bandeja. Para a coluna de sensores a utilizar, adicionar 200 ul de tampão de ensaio por po em que a coluna da placa de 96 poços. Retorne o rack de sensores para a bandeja na orientação correta (com guias em slots).
5. Conforme designado durante a programação na Etapa 1, preencha o poçosf a placa amostra com tampão de ensaio ou as diluições adequadas de proteína, como mostrado na Figura 2. Evite a introdução de bolhas, pois podem causar ruído no sinal óptico. Incluem um ou mais poços de referência que omitem ou (i) a proteína biotinilada ou (ii) o parceiro de ligação.
6. Abra a porta do aparelho e inserir o sensor de bandeja para o palco (à esquerda), com abas da bandeja inseridos nos slots do palco. Insira a placa de amostra no suporte da placa (à direita), certifique-se de que a placa está bem encaixada e na orientação correta, conforme indicado no suporte da placa. Fechar a porta e iniciar o ensaio de o programa de aquisição de dados (passo 1.5).

3. Informática

1. Após o ensaio foi executado, abra o software de análise de dados e carregar a pasta que contém os dados. Clique na aba "Processamento" para ver um menu passo a passo de Processamento (à esquerda) e os dados cinéticos matérias, com cada sensor (AH) atribuída uma cor diferente (verFigura 3).
2. Em "Seleção de dados", clique no botão "Sensor Seleção". Sobre a "Amostra Prata Map", designar os poços para 1 ou 2 sensores de controle (G, H em ensaio da Figura 3), como poços de referência. No menu Processamento, marque a caixa "subtração" e selecione "Wells referência" para subtrair sinal de referência (simples ou média) de sinal de todos os outros sensores.
3. Alinhe todos os vestígios de Y = 0 usando a etapa "Alinhar eixo Y". Selecione "linha de base", como a etapa de alinhamento (sendo esta a última linha de base antes da etapa Association). Para o "Intervalo de tempo", digite os últimos 10 segundos do que da linha de base (ou seja, 50-60 seg para 60 seg linha de base, como na Figura 3).
4. Marque a caixa "Inter-passo Correção" para minimizar as mudanças de sinal entre as etapas de associação e dissociação. Selecione alinhar a linha de base ou dissociação.
5. Selecione a função de filtração Savitzky-Golay na maioria dos casos e clique em "Dados do Processo" para prosseguir. Inspecione visualmenteos dados finais processados ​​(painel inferior direito). Com ensaios destinados a análise de dados global (como na Figura 4), ​​se os traços de sinal mostram uma mudança significativa entre Associação e etapas de dissociação, altere a seleção de dissociação ou a linha de base para a "Correção Inter-passo" e reprocessar os dados antes de prosseguir para dados Análise.

4. Análise de Dados

Clique na guia "Análise" in Análise de Dados para começar. Nota: o exemplo os passos indicados a seguir são para a análise global de múltiplas curvas de ligação / dissociação (como na Figura 3).

1. Para o "Passo a analisar", escolha associação e dissociação. Para o "Modelo", selecione 01:01. Nota: outras opções disponíveis são limitados.
2. Para a "montagem", escolha Global (completa). Para o "Group By", selecione Cor (como no gráfico). Selecione "R _max desvinculado por Sensor" para permitir montagem independente de R _max (resposta de sinal máxima sobre saturando ligação do partner à proteína imobilizada). Nota: fazemos isso para a maioria dos ensaios, como sensores de variar um pouco na quantidade de proteína imobilizada (veja a Figura 3, Loading).
3. Na tabela apresentada, certifique-se todos os vestígios de sensores a serem analisados ​​têm a mesma cor, então eles vão ser analisados ​​como um conjunto global. Se necessário, selecione uma ou mais sensores traça omitir de montagem mundial: na coluna "Incluir", clique com o botão direito sobre a posição do sensor desejado e selecione "Excluir Wells".
4. Clique em "Curvas em forma!" para iniciar a análise de regressão não-linear. Examine os resultados de ajuste, que incluem (i) sobreposição das curvas de regressão com vestígios de dados de sensores (como na Figura 4), ​​(ii) parcelas de resíduos de montagem, e (iii) uma tabela com os valores dos parâmetros determinados (constantes de velocidade, R _max, K _D) e estatísticas (erros padrão para os parâmetros, Qui-quadrado, R ^2).
5. Em "Exportar Dados", salve os resultados ajustados, clicando em "Exportar tabela csv para.". Para graphing ou uma análise mais aprofundada de dados / curvas equipadas com outro software, clique em "Exportar Resultados de montagem" para salvar os dados de cada sensor e curva ajustada em um arquivo de texto.

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Resultados

Ligação em tempo real e da cinética de dissociação BLI são mostrados na Figura 3. Esta experiência foi feita com tampão de ensaio de associação e dissociação. Esta experiência foi iniciada com um passo da linha de base de 10 minutos uma vez que os sensores foram prewet apenas brevemente. Em seguida, ε biotinilado foi carregado sobre os sensores. No dissociação detectável de ε ocorreu em todas as etapas restantes, como visto a partir da curva de referência (G) que não tinha parceiro d...

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Discussão

Instrumentos actualmente disponíveis para BLI permitir a produção e flexibilidade significativa nos ensaios para interacções biomoleculares. Várias amostras de solução são dispensados ​​em poços de uma placa de microtitulação preto, e um conjunto de sensores BLI paralelas são programados para se mover para trás e para a frente entre as colunas de poços na placa. As amostras são agitadas por agitação orbital durante todo o ensaio. O sistema utilizado aqui tem oito sensores e usa uma placa de amostra...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available