Био-слой интерферометрии для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий и аллостерические лиганда Effects

Резюме

Протоколы здесь описать кинетические анализы белок-белковых взаимодействий с Био-слоя интерферометрии. АТФ-синтаза F-Тип, который участвует в энергетическом обмене сотового, может быть запрещена по его ε-субъединицы у бактерий. Мы адаптировали Био-слоя интерферометрии для изучения взаимодействия каталитического комплекса с ингибиторной С-концевого домена ε в.

Аннотация

Мы описали использование био-слоя интерферометрии для изучения ингибирующие взаимодействия субъединицы ε с каталитического комплекса кишечной палочки АТФ-синтазы. Бактериальный F-типа СПС синтазы является целью новой, FDA утвержденных антибиотика по борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом. Понимание бактерии конкретные авто-ингибирование АТФ-синтазы в С-концевого домена субъединицы ε может обеспечить новые средства для целевой фермент для открытия антибактериальных препаратов. C-концевой домен ε претерпевает драматические конформационные изменения, когда фермент переходы между активными и неактивными государств, и лигандов каталитического-сайте может влиять, какие из конформации ε является преобладающим. В анализе измеряют кинетика связывания / диссоциации ε в с каталитического комплекса, так и косвенно измередавлениях сдвиг фермента с привязкой ε и из по-видимому, nondissociable тормозного конформации. Интерферометрии сигнал Био-слой не чрезмерно чувствительны к состава раствора, поэтому он также может быть использован для мониторинга аллостерические эффекты лигандов каталитического-сайте по конформационных изменений ε в.

Введение

Белок-белковые взаимодействия важны для многих биологических процессах, и метка свободной оптические методы, такие как поверхностного плазмонного резонанса (SPR) были использованы в пробирке для исследования кинетики связывания и диссоциации ^1. Большинство этикеток без методы иммобилизации один биомолекулы на поверхности датчика и использовать оптический сигнал для обнаружения связывающего партнера из раствора, как это связывает с иммобилизованным биомолекулы ^1. В то время как SPR является высоко чувствительным методом, он склонен к помехам из-за изменений показателя преломления раствора, протекающего через датчик ^2. Хотя это и не так чувствительны, как SPR, Био-слоя интерферометрии (BLI) менее подвержен влиянию изменений в образец композиции ^1,3. BLI использует волоконно-оптические биосенсоры, которые имеют собственный биосовместимого покрытия на кончике. Система, используемая здесь (Октет-RED96) содержит восемь спектрофотометры. Белый свет подается по трубам к ряду зондов, которые перемещаются на робота-манипулятора. Оптоволоконные датчики арэ подхвачена зондов и переехал в 96-луночный планшет с образцами. Одна из молекул-мишеней иммобилизуют на поверхности биосенсора. Тогда датчики перемещаются в лунки, содержащие привязки партнера в растворе. BLI контролирует ассоциацию связывающим партнером с иммобилизованным молекулы, а затем контролирует диссоциации после переезда датчиков к решению без обязательного партнера. Связывание молекул на поверхность биосенсора приводит к изменению оптической интерференции между световыми волнами, которые отражают обратно в спектрофотометров от внутренней поверхности и от внешнего интерфейса между датчиком и раствора. Эти изменения в помех может быть количественно и используется для определения кинетические показатели связывания и диссоциации, как показано в анимации, показанной на фиг.1.

Мы применили BLI измерить взаимодействие между каталитического комплекса бактериальной АТФ-синтазы и его ε-субъединицы, которая может автоматически ингибируют фермент. АТФ сиnthase является мембрана встраиваемый поворотный наномотор, который катализирует синтез и гидролиз АТФ ^4. Каталитический комплекс (F ₁₎ может быть выделено в растворимой форме, который работает в качестве АТФазы. Субъединицы ε имеет два домена: N-концевой домен (NTD) необходим для правильного монтажа и функциональной соединение фермента, но не взаимодействует непосредственно с каталитическими подразделений; С-концевой домен (CTD) может ингибировать фермент, взаимодействуя с несколько каталитические субъединицы ^5,6. Эта норма ε-опосредованной специфичен для бактериальных АТФ-синтазы и не наблюдается в митохондриальной гомолога. АТФ-синтаза стала мишенью для антибактериальных препаратов, как показывает недавнее утверждение FDA из bedaquiline для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза ^7. Таким образом, таргетинг тормозящее роль ε не соответствует лекарственных препаратов может дать антибактериальные, которые не угнетают митохондриальную АТФ-синтазы. С изолированной каталитического комплекса (F _1), εстановится разъединимый субъединицы. Тем не менее, с ε, связанного с F _1, εCTD может пройти значительное конформационные изменения, частично вставки в центральной полости фермента и формирование тормозное состояние, который вряд ли отделить непосредственно ^6,8. Мы используем BLI для измерения кинетики F ₁ / ε связывания и диссоциации, так и косвенно, изучить аллостерические эффекты каталитического сайт лигандов на конформации ε в.

В нашей системе ε была выбрана для иммобилизации на поверхности датчика с сигналом BLI (например, SPR) чувствителен к массе молекул связывания на поверхности. Ε-субъединица является малым (~ 15 кДа) относительно основного F ₁ комплекса (~ 347 кДа). Таким образом, большее сигнал BLI будет результатом связывания F ₁ с иммобилизованным ε. В целях мониторинга F ₁ диссоциации, которая может быть очень медленным, ε должны сильно обездвижен. Таким образом, мы приняли решение biotinylateИ иммобилизации его на покрытых стрептавидином биосенсоров. Белки могут быть биотинилированного по формуле (I) случайной модификации поверхностных лизина ^9, (II) реакции уникальной собственном или инженерии цистеина с биотин-малеимид реагента ¹⁰ или (III) генетически добавление определенного биотин-акцепторных пептид, который ферментативно биотинилированного в течение в естественных условиях экспрессии меченых белков ^11. В нашей системе ε биотинилируют методом (III) ^8. После того, как биотин-меченый ε обездвижен на датчики стрептавидином, BLI может измерить связывание и диссоциация F _1, который был обедненный субъединицы ε (F ₁ (-ε)). Для экспериментов, описанных здесь, предварительные анализы были сделаны, чтобы определить разумные объемы биотинилированной белка для иммобилизации на датчиках. Это может варьироваться в зависимости от молекулярной массы белка и его партнером по связыванию, но цель состоит в том, чтобы определить минимальное количество иммобилизованным белком тшапка обеспечивает (I) приемлемый сигнал-шум для связывания кинетики с низкой концентрацией партнером по связыванию (ниже K _D) и (II) минимальным искажением кинетику связывания с почти насыщение концентрации партнером по связыванию. Кроме того, стехиометрия биотинилирования могут различаться (но избежать> 1 моль биотин / моль белка), так что некоторые начальная анализа могут быть необходимы для каждого нового большого количества биотинилированного белка для подтверждения, что последовательный сигнал BLI может быть достигнуто в течение иммобилизации на покрытых стрептавидином датчики.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Программирование прибора к Пробирной BLI

Включите инструмент, по крайней мере один час в заранее дайте лампе прогреться, это необходимо, чтобы минимизировать шум и дрейф в оптический сигнал во время эксперимента. Установите требуемую температуру через вкладку приборной prewarm образца держатель пластин. Затем установите опытно-конструкторских в программном обеспечении сбора данных. Выберите "Новый Kinetics эксперимент» в вкладке Мастер эксперимента. Это представляет вкладками меню со всеми шагами, которые должны быть определены.

1.1. Тарелка Определение

Определение столбцов, которые будут использоваться на образце 96-луночного планшета. Связать столбцов, содержащих буфер, иммобилизованного белка или связывающего партнера. Для каждой ассоциации также ввести концентрацию св зывающегос партнера, который будет использоваться. Примечание: определение пластины показано на рисунке 2 имеет опции для различных анализов.

1.2. Анализ Определение

ontent "> Define все шаги, необходимые для анализа. ним относятся (I) Baseline (несколько), (II) Загрузка, (III) Ассоциации и (IV) диссоциация связывания партнера. Тогда, как описано ниже, ссылаются отдельные шаги анализа с колонны скважин на образец стекла выбрав шаг анализа, а затем двойным щелчком по соответствующей колонке. Это программы датчики должны быть перемещены из одной колонки скважин на следующий во время теста.

1. Базовая линия
   Начните с краткого базового стадии (≥ 60 сек), с датчиками в буфере для анализа (рис. 2, колонка 1), чтобы установить начальные сигналы BLI в 96-луночный планшет.
2. Загрузка (иммобилизации биотинилированного белка на датчиками)
   Связать датчики для скважин, которые будут содержать биотинилированного белка (рис. 2, столбец 2). Используйте пороговую функцию для достижения заданного уровня связывания (см. введение). Установите пороговое опцию, чтобы все датчики будут двигатьсяD к следующей колонке скважин, когда один из датчиков достигает порога.
3. Базовая линия
   Включите другой базовый шаг в буфере (рис. 2, столбец 3; обычно> 5 мин), чтобы смыть nonimmobilized биотинилированных белков от датчиков и установить новые, стабильные базовые сигналы. Для основных связывания / диссоциации анализов только (как на рисунке 3), включают в себя дополнительный базовый этап (60 сек) с датчиками в новых скважин буфера (рис. 2, столбец 4) перед стадией ассоциации.
4. Association (от партнера по связыванию с иммобилизованным белком)
   Для основного связывания / диссоциации анализа (как на рисунке 3), выбрать диапазон концентраций связывающего партнера, которые будут использоваться для различных датчиков / скважин (рис. 2, столбец 5). Отрегулируйте время шага, так что по крайней мере насыщающей концентрацией связывающим партнером должны подходить равновесия связывания сигнал. Дляанализ, чтобы проверить аллостерические эффекты малых лигандов на диссоциации белок-белкового комплекса (как на рисунке 5), выбрать один высокую концентрацию связывающего партнера (~ 10 раз выше расчетной K _D) для использования во всех ассоциации скважин.
5. Диссоциация (связывающего партнера)
   Для основного связывания / диссоциации анализа только (как на рисунке 3), обозначения датчиков, чтобы вернуться в колонке 4 (рис. 2), и тот же буфер скважин, которые использовались для дополнительного базового перед Ассоциацией. Для анализа, чтобы проверить аллостерические эффекты малых лигандов, вместо обозначения датчиков, чтобы перейти к колонке 6 (рис. 2), где каждую лунку может содержать буфер плюс различные аллостерические лигандов.

1.3. Датчик Назначение

Укажите расположение в лотке датчика, который будет содержать prewetted датчики для анализа. Определить пустые позиции, так как эксперимент будет FAIл, если нет датчики не взял.

1.4. Обзор Эксперимент

Представьте все запланированные действия, чтобы проверить на наличие ошибок и вернуться, чтобы исправить их.

1.5. Запустите эксперимент

Введите необходимые детали, в том числе расположение файлов данных. Введите желаемую температуру для эксперимента. Если датчики по-прежнему требуют предварительное увлажнение, выберите опцию задержать началом эксперимента. Наконец, когда все пробоподготовки завершена (шаг 2) и оба образца пластины и лоток датчик загружаются в прибор, нажмите кнопку Go, чтобы запустить анализ.

2. Подготовка образцов

1. Подготовка соответствующего буфера для анализа. Буфер используется для экспериментов, представленных на рисунках 3 и 5: 20 мМ MOPS (3 - (N-морфолино) пропансульфокислота), Трис (трис (гидроксиметил)-амино-метана) (для доведения рН до 8,0), 50 мМ KCl. Включите BSA (бычий сывороточный альбумин, жирных кислот бесплатно, 0,5мг / мл окончательный) в буфере для анализа всех этапах и во всех разведений биотинилированного белка или партнером по связыванию для минимизации неспецифического связывания белков с датчиками.
2. Развести биотинилированный белок (ε) в буфере для анализа до соответствующей концентрации (см. введение).
3. Приготовить разведения связывающим партнером (F ₁ (-ε)) в буфере для анализа (см. Обсуждение для диапазона концентраций для использования).
4. Предварительно смочите Стрептавидин покрытием датчики для по крайней мере 10 минут для удаления их защитной сахарозы покрытие. Снимите датчик содержащих стойку из лотка датчика и вставить 96-луночный планшет с в нижней части лотка, раздвижные один угол пластины в ориентировочной выемкой на подносе. Для столбец датчиков, которые будут использоваться, добавьте 200 мкл буфера для анализа на лунку в этом столбце 96-луночный планшет. Вернуться стойку датчиков к лотку в правильной ориентации (с вкладками в слотах).
5. По поручению во время программирования в шаге 1, заполнить скважин ое образец пластина с буфером для анализа или соответствующих разведений белка, как показано на рисунке 2. Избегайте введения пузыри, так как они могут вызвать шум в оптический сигнал. Включают один или более опорных скважин, которые не задавать (I) биотинилированного белка или (II) св зывающегос партнера.
6. Откройте дверцу прибора и вставьте лоток датчика на сцену (слева), с вкладками в лотке, вставленных в пазы сцене. Вставьте образец пластины в держателе (справа); убедитесь, что пластины сидит плоской и в правильной ориентации, как указано на держателе. Закройте дверь и начали проводить анализ из программы сбора данных (шаг 1.5).

3. Обработка данных

1. После анализа побежал, откройте программное обеспечение анализа данных и загрузите папку, содержащую данные. Перейдите на вкладку "Обработка", чтобы увидеть поэтапного меню обработки (слева) и необработанные кинетические данные, с каждого датчика (АГ) назначен другой цвет (см.Рисунок 3).
2. В разделе "Выбор данных", нажмите кнопку "Выбор датчика". На "Образец плиты карты», обозначения лунок для 1 или 2 датчиков контроля (G, H в анализе рисунке 3) как опорных скважин. В меню обработки, установите флажок "вычитание" и выберите "Reference Уэллс" вычесть опорного сигнала (одно-или усредненную) от сигнала любой другой датчика.
3. Совместите все следы, чтобы Y = 0, используя шаг "Выровнять Ось Y". Выберите "Базовая линия" в качестве шага выравнивания (проведение этой последней базовой перед стадией Association). Для "Time Range", введите последний 10 сек этого исследования (т.е. 50-60 сек для 60-сек базовой линии, как показано на рисунке 3).
4. Установите флажок "Интер-шаг Коррекция", чтобы минимизировать сигнала сдвиги между шагов ассоциации и диссоциации. Выберите выровнять по базовой линии или диссоциации.
5. Выберите функцию фильтрации Савицкого-Голея в большинстве случаев и нажмите "обрабатывать данные!" , чтобы продолжить. Осмотритеокончательные обработанные данные (нижняя правая панель). С анализов, предназначенных для глобального анализа данных (как на рисунке 4), если сигнал следы показывают значительный сдвиг между Ассоциацией и шаги диссоциации, изменить выбор диссоциации или базовый уровень для "Интер-ступенчатой ​​коррекции" и перерабатывать данные, прежде чем приступить к данным Анализ.

4. Анализ данных

Перейдите на вкладку "Анализ" в анализе данных, чтобы начать. Примечание: пример шаги ниже для глобального анализа множества кривых связывания / диссоциации (как показано на рисунке 3).

1. Для "Шаг к Анализ", выберите ассоциации и диссоциации. Для "Модели" выберите 1:1. Примечание: другие ограниченные варианты.
2. Для "Место", выберите Глобальная (Full). Для "Группировка по" выберите цвет (как на графике). Выберите "R _макс несвязанных по датчику", чтобы позволить независимую установку R _макс (максимальная ответный сигнал на насыщая связывания наравнеtner с иммобилизованным белком). Примечание: мы делаем это для большинства анализов, а датчики незначительно отличаться в размере белка, иммобилизованного (см. рисунок 3, загрузка).
3. На столе, показанной, убедитесь, что все следы датчик для анализа имеют тот же цвет, так что они будут проанализированы в качестве глобального набора. При необходимости выберите один или несколько датчиков отслеживает, чтобы исключить из глобального фитинга: в столбце "Включить", щелкните правой кнопкой мыши на нужную позицию датчика и выберите "Исключить Уэллс".
4. Нажмите кнопку "Fit Curves!" чтобы начать нелинейного регрессионного анализа. Изучите подходящие результаты, которые включают (I) наложение кривых регрессии со следами данных датчиков (как на рисунке 4), (II) земельные фитинговых остатков и (III) таблицу с определенными значениями параметров (констант скоростей, R _{Макс, KD)} и статистика (стандартные ошибки для параметров, ^{хи-квадрат,} R2).
5. В разделе "Data Export", сохранить подходящие результаты, нажав кнопку "Экспорт таблицы в. CSV-файла". Для GRAPХин или дальнейший анализ данных / оснащенных кривых с другим программным обеспечением, нажмите кнопку "Экспорт Подгонка результаты", чтобы сохранить данные каждого сенсора и оборудованы кривую в текстовом файле.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Связывания в режиме реального времени и диссоциация BLI кинетика показано на рисунке 3. Этот эксперимент был проведен с буфером для анализа в ассоциации и диссоциации. Этот эксперимент был начат с базовым шагом 10 мин, так как датчики были Предварительно смочите лишь вкратце. Дал...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Имеющиеся в настоящее время приборы для BLI позволит существенно пропускную способность и гибкость в анализах на биомолекулярных взаимодействий. Различные образца раствора, распределяют в лунки черного микротитрационного планшета, а также набор параллельных датчиков BLI запрограммир?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available