タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

要約

ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。

要約

我々は、 大腸菌の ATP合成酵素の触媒複合体とサブユニットεの阻害相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法の使用を記載している。細菌のF型ATP合成酵素 薬剤耐性結核と闘うための新しい、FDA承認の抗生物質のターゲットである。サブユニットεのC末端ドメインによりATP合成酵素の細菌特有の自己阻害を理解することは、抗菌薬の発見のための酵素を標的とする新しい手段を提供することができます。 εのC末端ドメインは、アクティブ状態と非アクティブ状態、および触媒部位リガンドとの間の酵素の遷移が支配的であるεのコンフォメーションのどの影響を与えることができる劇的な構造変化を起こす。 εの結合/触媒複合体の解離、および間接的にMEAのアッセイは、動態sures明らかnondissociable阻害コンフォメーションとの間での酵素結合εのシフト。バイオレイヤー干渉信号は、溶液組成物に過度に敏感ではないので、それはまた、εのコンフォメーション変化に触媒部位リガンドのアロステリック効果をモニターするために使用することができる。

概要

タンパク質-タンパク質相互作用は、多くの生物学的プロセスのために重要であり、表面プラズモン共鳴（SPR）のようなラベルフリー光学的方法¹の^結合及び解離の動態を研究するためにインビトロで使用されてきた。ほとんどのラベルフリーの方法は、センサ表面上の1生体分子を固定化し、それが固定化された生体分子¹と会合するように溶液から結合パートナーを検出するための光信号を使用しています。 SPRは、高感度な方法であるが、それは、センサ²の上を流れる溶液の屈折率の変化による干渉を受けやすい。 SPRほど敏感ではないが、バイオレイヤー干渉法（BLI）が少ないサンプル組成^1,3の変化に影響される。 BLIは、先端に独自の生体適合性コーティングを有する光ファイババイオセンサーを使用しています。 （オクテットRED96）ここで使用されるシステムは、8つの分光光度計が含まれています。白色光は、ロボットアームに移動したプローブの行にパイプされる。光ファイバセンサのアルeは、プローブによってピックアップされたサンプルを含む96ウェルプレートに移動した。標的分子の一つは、バイオセンサー表面上に固定化される。次いで、センサは、溶液中の結合パートナーを含むウェルに移動される。 BLIは固定化された分子と結合パートナーとの会合を監視してから、結合相手なしでソリューションにセンサーを移動した後に解離を監視します。バイオセンサー表面への分子の結合は、内面からとセンサと溶液との間の外部インタフェースからの分光光度計に戻って反映させる光波の間の光の干渉の変化につながる。干渉におけるこれらの変化を定量化し、 図1のアニメーションにまとめたように、結合および解離の速度論的速度を決定するために用いることができる。

私たちは、酵素を自動阻害することができる細菌のATP合成酵素とそのεサブユニットの触媒複合体の間の相互作用を測定するために、BLIを適用している。 ATP SYnthaseは、ATP ⁴の合成と加水分解を触媒膜に埋め込 ​​まれた回転ナノモーターである。触媒複合体（F _{1）は、ATP}アーゼとして機能する可溶性の形で単離することができる。サブユニットεは二つのドメインを持っている：N末端ドメイン（NTD）は適切な組み立てと、酵素の機能的結合のために必要であるが、触媒サブユニットと直接相互作用しない。C末端ドメイン（CTD）がと相互作用することによって酵素を阻害することができる複数の触媒サブユニット^5,6。このε媒介規制は細菌のATP合成酵素に特有のものであり、ミトコンドリアの相同体で観察されていません。薬剤耐性結核^7を治療するbedaquilineの最近のFDAの承認で示すように、ATP合成酵素は、抗菌薬のターゲットとして浮上している。これにより、創薬のためのεの阻害的役割を標的とすることは、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害しない抗菌剤を得ることができる。孤立した触媒錯体（F _1）、εと解離性サブユニットになる。しかし、F ₁に結合しているεで、εCTDは部分的に酵素の中央空洞内に挿入し、直接^6,8解離性は低い抑制状態を形成し、劇的な構造変化を受けることができる。我々は、触媒サイトがεのコンフォメーション上のリガンドのアロステリック効果を調べるために、間接的にFが₁ /ε結合と解離の反応速度を測定し、するBLIを使用しています。

（SPR等）BLI信号が表面に結合する分子の質量に敏感であるので、我々のシステムにおいては、εは、センサ表面に固定化するために選択した。 εサブユニットは、メインF ₁複合体（〜347 kDa）の、小さな（〜15 kDa）の相対的です。このように、より大きなBLI信号が固定化されたεに、F ₁の結合からなります。非常に遅くなることが、F ₁解離を、監視するために、εは強く固定化されている必要があります。したがって、私たちは、ビオチン化することにしました、およびストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー上に固定。タンパク質は、表面リジン⁹の（I）のランダム変更、ビオチン-マレイミド試薬¹⁰または（iii）遺伝的に酵素的に中にビオチン化され、特定のビオチンアクセプターペプチドを付加した独自のネイティブまたはシステイン（II）の反応により、ビオチン化することができるタグ付けされた蛋白質¹¹のin vivo発現における 。我々のシステムでは、εは法^{（III）8を}使用してビオチン化する。ビオチンタグ化εストレプトアビジンセンサー上に固定化されると、BLI結合およびサブユニットε（F _{1（-ε））}を枯渇されたF ₁の解離を測定することができる。ここに記載の実験のために、予備的アッセイは、センサー上に固定化するためにビオチン化タンパク質の合理的な量を決定することは行われていた。これは、タンパク質の分子量およびその結合パートナーに応じて、変えることができるが、目標は、固定化タンパク質tの最小量を決定することである帽子は、（i）許容信号対雑音（K _D下）結合パートナーの濃度が低いと結合パートナーのほぼ飽和濃度との結合動態（II）の最小限の歪みで反応速度を結合するために用意されています。また、ビオチンの化学量論は一貫BLI信号は、ストレプトアビジン被覆上に固定化の間に達成することができることを確認するために変化する（ただし、> 1モルビオチン/モルタンパク質を避ける）ため、いくつかの初期のアッセイは、ビオチン化タンパク質のそれぞれ新しいロットのために必要とされてもよいセンサー。

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プロトコル

1。 BLIアッセイのための測定器のプログラミング

ランプがウォームアップしますので、事前に測定器を少なくとも1時間の電源をオンにし、これは、ノイズを最小限に抑え、実験中に、光信号のドリフトすることが必要である。サンプルプレートホルダーを予熱し、器具のタブを経由して所望の温度を設定します。そして、データ収集ソフトウェアで実験計画を設定します。実験ウィザード]タブにある「新しい動力学実験」を選択します。これは定義されている必要があり、すべての手順でタブ付きのメニューを提示します。

1.1。プレートの定義

96ウェルサンプルプレート上で使用される列を定義する。バッファ、固定化タンパク質または結合パートナーを含むように列を割り当てます。よく各協会のために、使用される結合パートナーの濃度を入力します。注： 図2に示されているプレートの定義が明確なアッセイのためのオプションがあります。

1.2。検定の定義

ontent ">アッセイに必要なすべてのステップを定義します。これらは、（i）ベースライン（数）、（II）読み込み、（III）協会と結合パートナー（IV）の解離が含まれています。その後、後述するように、個々のアッセイ工程をリンクその後、アッセイ段階と、それぞれの列をダブルクリックを選択して、サンプルプレート上のウェルの列。このプログラムは、アッセイ中に次のウェルの1つの列から移動するセンサー。

1. ベースライン
   96ウェルプレート中で、最初のBLIシグナルを確立するために、アッセイ緩衝液中のセンサ（ 図2、列1）を用いて、短い基線工程（≥60秒）で始まる。
2. （センサー上のビオチン化タンパク質を固定化する） ロード
   ビオチン化タンパク質（ 図2、列2）が含まれていますウェルにセンサーを割り当てます。 （概要を参照）の結合の所定のレベルを達成するために、しきい値関数を使用します。すべてのセンサーは、移動になるように、しきい値オプションを設定センサのいずれかが閾値に達したウェルの次の列にdを。
3. ベースライン
   センサーから離れて非固定化タンパク質を洗浄し、新しい、安定したベースライン信号を確立するために、バッファ内の別のベースラインのステップ（通常は> 5分、図2、列3）を挙げることができる。のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、会合工程前にバッファの新しいウェル内のセンサー（ 図2、列4）で余分なベースラインステップ（60秒）が含まれています。
4. （固定化タンパク質への結合相手の） 協会
   （ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、異なるセンサ/ウェル（ 図2、カラム5）に使用される結合パートナーの濃度範囲を選択する。結合パートナーの少なくとも飽和濃度が信号を結合平衡に近づく必要がありますように、ステップ時間を調整します。のために（ 図5のように）タンパク質-タンパク質複合体の解離の小さなリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイは、すべてのアソシエーションウェルにおける使用のための結合パートナー（〜10倍推定K _Dを超える）単一の高濃度を選択する。
5. （結合相手の） 解離
   のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、第4欄（ 図2）、アソシエーションの前に余分なベースラインのために用いたのと同じ緩衝液をウェルに戻すためのセンサを指定する。小さ ​​なリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイのために、代わりに列6だけでなく、それぞれがバッファプラス異なるアロステリックリガンドを含むことができます（ 図2）に移動するようにセンサーを指定します。

1.3。センサ割り当て

アッセイのための予備湿潤センサーが含まれますセンサートレイ内の位置を示している。実験はFAIになるので空の位置を同定Lないセンサーがピックアップされていない場合。

1.4。レビュー実験

間違いをチェックし、それらを修正する戻って、すべての計画された手順を視覚化する。

1.5。走行実験

データファイルの場所など、必要な詳細を入力します。実験のために所望の温度を入力します。センサーは、まだプレウェッティングが必要な場合は、実験開始を遅らせるためのオプションを選択します。最終的には、一度にすべてのサンプル調製は、（ステップ2）が完了し、サンプルプレートとセンサートレイの両方は、機器にロードされ、分析を実行するために[Go]ボタンをクリックします。

2。試料調製

1. 適切なアッセイ緩​​衝液を準備します。 （pHを8.0に調整するために添加） - （（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸3）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ-メタン）、50mMのKCl、20mMのMOPS：バッファは、 図3および図5に示す実験に使用した。 BSA（ウシ血清アルブミン、遊離脂肪酸、0.5を含むすべてのアッセイ工程のためのビオチン化タンパク質または結合パートナーのすべての希釈は、センサーへのタンパク質の非特異的な結合を最小限にするためのバッファでの）mg / mlの最終的な。
2. （概要を参照）適切な濃度にアッセイ緩​​衝液中でビオチン化タンパク質（ε）を希釈します。
3. アッセイ緩衝液中の結合パートナー（F _{1（-ε））（、}使用する濃度の範囲のための議論を参照のこと）の希釈液を準備します。
4. それらの保護スクロースコーティングを除去するために、少なくとも10分間、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーを予め湿ら。センサートレイからセンサ内蔵ラックを取り外し、トレイの底に96ウェルプレートを挿入し、トレイ上の配向ノッチにプレートの一角をスライドさせる。センサの列が使用されるためには、96ウェルプレートのカラムにウェルあたりのアッセイ緩​​衝液200μlを加える。 （スロットのタブ付き）正しい方向にトレイにセンサーのラックを返します。
5. ステップ1でのプログラミング時に割り当てられたとして、O井戸を埋める図2のようにアッセイ緩衝液又は適当なタンパク質希釈物fのサンプルプレート。彼らは、光信号のノイズの原因となりますので、気泡を導入することは避けてください。 （I）ビオチン化タンパク質または（ii）結合パートナーのいずれかを省略した1以上の基準井戸があります。
6. ステージのスロットに挿入され、トレイのタブで、（左）機器のドアを開き、ステージにセンサートレイを挿入します。プレートホルダー（右）にサンプルプレートを挿入し、プレートホルダーに示されるように、プレートは、平らで正しい向きに装着されていることを確認してください。ドアを閉じ、データ収集プログラム（ステップ1.5）からアッセイを開始する。

3。データ処理

1. 分析の実行後、データ解析ソフトウェアを起動し、データを格納しているフォルダをロードします。各センサで、（左の）段階的な処理メニューと生動態データを見るために「処理」タブをクリックします（A〜H）の異なる色が割り当てられます（図3）。
2. 「データの選択」の下に、「センサーの選択」ボタンをクリックしてください。 「サンプルプレートマップ」上で、参考井戸として1または2制御センサ（G、 図3の測定ではH）のための井戸を指定します。 Processingメニューの「引き算」チェックボックスをオンにし、他のすべてのセンサの信号から（シングルまたは平均した）基準信号を減算する「リファレンス·ウェルズ」を選択します。
3. 「整列Y軸」の手順を使用して、Y = 0にすべてのトレースの位置を合わせます。アライメント工程（これは会合工程前の最後のベースラインである）などの「ベースライン」を選択します。 「時間範囲」については、そのベースライン（ 図3のように、60秒のベースラインのすなわち 、50〜60秒）の最後の10秒を入力します。
4. 会合および解離のステップとの間の信号シフトを最小限に抑えるために「インターステップ補正」チェックボックスをオンにします。ベースラインまたは解離合わせる]を選択します。
5. ほとんどの場合、サビツキー·ゴーレイフィルタ機能を選択し、クリックして "プロセスデータを！"続行します。視覚的に検査最終処理されたデータ（右下のパネル）。信号トレースは、結合と解離ステップの間には有意な変化を示している場合（ 図4のように）グローバルデータ解析のために意図されたアッセイと、「インターステップ補正」の解離またはベースラインの選択を変更し、データへ進む前に、データを再処理する分析。

4。データ解析

開始するにはデータ解析の「分析」タブをクリックします。注：以下の例の手順は、（ 図3のように）複数の結合/解離曲線のグローバル分析のためのものです。

1. 「分析するステップ」の場合は、会合および解離を選択します。 「モデル」については、午前1時01分]を選択します。注：その他の制限されたオプションが使用可能です。
2. 「フィッティング」については、（フル）グローバル]を選択します。 」とは、基」の（グラフのように）色を選択します。 （R _maxの独立したフィッティングを可能にするために「センサーによってリンクされていないのR _マックス 」 _を選択してPARの結合を飽和させる時に最大信号応答固定化タンパク質へtner）。注：センサーが固定されたタンパク質の量が多少異なるように、我々は（ 図3、ロードしています）、ほとんどのアッセイのためにこれを行う。
3. 示すテーブルに、分析しようとするすべてのセンサーのトレースが同じ色を持っているので、彼らはグローバルセットとして分析されることを確認してください。必要に応じて、1つ以上のセンサーがグローバルフィッティングから省略するためのトレースを選択します。「含む」列の下に、所望のセンサの位置を右クリックし、「ウェルズの除外」を選択します。
4. 「フィットカーブを！」をクリック非線形回帰分析を開始します。 、決定されたパラメータ値（速度定数、R _マックスでは、（i）（ 図4のように）センサデータのトレースで回帰曲線を重ね、フィッティング残差の（II）のプロット、及び（iii）表が含まフィッティング結果を調べるK _D）と統計パラメータについて（標準誤差、カイ二乗、R ^2）。
5. 「データのエクスポート」の下で、「CSVファイルへのエクスポート表」をクリックして、フィッティング結果を保存します。 grapを用興または他のソフトウェアとのデータ/装着曲線の更なる分析は、テキストフ​​ァイル内の各センサーのデータと近似曲線を保存する「エクスポートフィッティング結果」をクリックしてください。

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結果

リアルタイム結合および解離動態BLIを図3に示す。この実験は、会合および解離アッセイ緩​​衝液で行った。センサーは短時間だけを予め湿らされていたので、この実験は、10分のベースラインのステップを開始した。次に、ビオチン化εは、センサにロードした。 εの検出可能な解離は結合パートナーが追加されていなかった基準曲線（G）から見て、残りのすべての工程を通?...

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ディスカッション

BLIのための現在利用​​可能な機器は、生体分子の相互作用のためのアッセイにおいて有意なスループットと柔軟性を可能にします。種々の溶液試料は黒色マイクロタイタープレートのウェルに分配され、平行BLIセンサのセットは、プレート上のウェルの列の間を前後に移動するようにプログラムされる。サンプルは、アッセイを通じて軌道振とうにより撹拌する。ここで使用されるシステ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available