Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Özet

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Özet

Biz, Escherichia coli ATP sintaz katalitik alt birim kompleksi ile ε önleyici etkileşimleri incelemek için Bio-interferometrisi tabaka kullanılmasını tarif eder. Bakteriyel F-tipi ATP sentaz ilaca dirençli tüberküloz mücadele için yeni bir FDA onaylı antibiyotik hedefidir. Alt birim ε C-terminal alanı ile ATP sintaz anlama bakteri spesifik oto-inhibisyon antibakteriyel ilaçların keşfi için enzim hedef için yeni bir yöntem sağlayabilir. Ε ait C-terminal alanı, aktif ve aktif olmayan durumlar ve katalitik site ligandlar arasındaki geçişler enzim baskın olduğu ε en konformasyonlarının hangi etkileyebilir dramatik bir konformasyonel değişime uğrar. Ε dolaylı olarak bir bağlayıcı / katalitik kompleksi ile ayrışma ve mea ait deney, kinetiksureler görünüşte nondissociable inhibitör konformasyon ve enzim bağlı ε kayması. Bio-tabaka Interferometri sinyal çözelti bileşiminde aşırı duyarlı değildir, bu yüzden de ε en şekilsel değişikliklere katalitik-sitesi ligandların allosterik etkilerini izlemek için kullanılabilir.

Giriş

Protein-protein etkileşimleri, birçok biyolojik sürecin önemli olan ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) gibi etiket içermeyen optik yöntemler ¹ bağlanması ve ayrışma kinetikleri incelemek için in vitro olarak kullanılmıştır. Çoğu etiket içermeyen yöntemleri, sensor yüzeyi üzerine hareketsiz bir biyomolekülün ve hareketsizleştirilmiş biyomolekülün ¹ ile ilişkilendiren olarak çözeltiden bir bağlanma partneri tespit etmek için bir optik sinyal kullanır. SPR, son derece hassas bir yöntem olmasına rağmen, bunun nedeni sensörün ² üzerinde akan solüsyonun kırılma endeksi değişikliklere girişime maruz kalır. SPR, Bio-katmanlı interferometrisi (BLI) gibi duyarlı değil az numune bileşiminde ^1,3 değişikliklerden etkilenir rağmen. BLI ucunda özel bir biyouyumlu kaplamaya sahip fiber optik biyohissedicilerin kullanır. (Sekizli-RED96) Burada kullanılan sistemi sekiz spektrofotmetrelere içerir. Beyaz ışık bir robot kol hareket prob bir satıra taşınıyor. Fiber optik sensörler are problar tarafından yakalandı ve numuneleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plakaya taşınır. Hedef moleküllerin bir biyoalgılayıcı yüzey üzerinde immobilize edilir. Daha sonra sensör çözelti içinde bağlanma ortağı ihtiva eden oyuklara taşınır. BLI hareketsizleştirilmiş molekül ile bağlanma partnerinin ilişki izler ve daha sonra bağlanma partneri olmadan çözeltisine hareket sensörleri sonra ayrışma izler. Biyosensör yüzeyine moleküllerin bağlayıcı bir iç yüzeyinden ve sensör ve çözüm arasındaki dış arayüzünden geri Spektrofotometrelerin yansımadı ışık dalgaları arasındaki optik girişime değişikliklere yol açar. Girişim bu değişiklikler, miktarı ve Şekil 1 'deki animasyon özetlendiği gibi, bağlayıcı ve ayrışma kinetik oranlarını belirlemek için kullanılabilir.

Biz katalitik bakteriyel ATP sentaz kompleksi ve enzim oto-inhibe olabilir onun ε alt birimi arasındaki etkileşimleri ölçmek için BLI uyguladık. ATP synthase sentezi ve ATP ⁴ hidrolizini katalize eden bir zara gömülü döner nanomotor olduğunu. Katalitik kompleksi (F _1), bir ATPaz olarak çalışan bir çözünür bir biçimde izole edilebilir. Alt-birim ε iki etki var N-terminal alanı (NTD) doğru montaj ve enzimin işlevsel bağlanması için gerekli olan ancak katalitik alt birimleri ile doğrudan etkileşim değildir, C-terminal sahası (CTD) ile etkileşerek enzimi inhibe Birden fazla alt birimler katalitik ^5,6. Bu, ε-aracılı düzenleme bakteri ATP sentaz özgüdür ve mitokondriyal homologunun gözlenmemektedir. Ilaca dirençli tüberküloz ⁷ tedavisinde bedaquiline son zamanlarda FDA onayı ile gösterildiği gibi, ATP sintaz, antibakteriyel ilaçlar için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Böylece, ilaç keşfi için ε inhibitör rolünü hedef mitokondriyal ATP sentezini inhibe yok antibakteriellerle verim verebilecek. İzole edilmiş katalitik kompleksi (F _1), ile, εçözünmeyen bir alt birim olur. Bununla birlikte, F ₁ bağlanmıştır ε ile εCTD kısmen enzimin orta boşluk içine sokulması ve doğrudan doğruya ^6,8 ayırmak mümkün olan önleyici durumunu oluşturan, dramatik bir konformasyonel değişikliği tabi olabilir. Biz katalitik site ε en konformasyonuna ligandları allosterik etkilerini incelemek için, dolaylı olarak F ₁ / ε bağlanma ve ayrışma kinetiği ölçmek ve BLI kullanın.

Sistemimizde, ε (SPR) gibi BLI sinyal yana algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirmek için seçildi yüzeyinde bağlayıcı moleküllerin kütlesinin duyarlıdır. Ε alt birim ana F ₁ kompleksi (~ 347 kDa), küçük (~ 15 kDa) görecelidir. Bu nedenle, daha büyük bir BLI sinyal hareketsizleştirilmiş ε, F ₁ bağlanmasını ortaya çıkar. Çok yavaş olabilir F ₁ ayrışma, izleme amacıyla, ε güçlü hareketsiz olması gerekir. Böylece biotinylate seçtiVe streptavidin kaplı biyosensör üzerinde hareketsiz. Proteinler yüzey lisin ⁹ (i) rastgele modifikasyon, bir biotin-maleimid maddesi ¹⁰ ya da (iii) genetik olarak enzimatik sırasında biyotinile belirli bir biotin-peptidi alıcı ekleme ile eşsiz bir yerel veya tasarlanmış sistein (ii) reaksiyonu ile biyotinile edilebilir etiketli proteinin ¹¹ in vivo ifadesi. Sistemimizde, ε yöntem (iii) ⁸ kullanılarak biyotinile edilir. Biotin-etiketli streptavidin ε sensör üzerinde immobilize olduğu zaman, BLI bağlanması ve alt-birimi ε (F ₁ (ε-)) içinde tükendiği F ₁ ayrışımı ölçebilen. Burada tarif edilen deneyler için, ön deneyler sensörleri hareketsiz hale getirmek için biotinlenmiş proteinin uygun miktarlarının tespiti için yapılmıştı. Bu, proteinin molekül ağırlığı ve bağlanma partneri üzerinde bağlı olarak değişebilir, ancak hedef hareketsiz protein t az miktarda tespit etmektirhat içerir (i) olarak uygun bir sinyal-gürültü a (K _D aşağıda) bağlanma partnerinin düşük konsantrasyonu ve bağlanma partnerinin yakın doyurulması konsantrasyonu ile kinetik bağlanmasının (ii) en az bozulmayla kinetik bağlanma için. Ayrıca, biyotinilasyon stokiyometrisi tutarlı BLI sinyali streptavidin kaplı üzerinde hareketsizleştirilmesi sırasında elde edilebileceğini teyit etmek için değişebilir (ancak> 1 biyotin mol / mol protein önlemek), bu deney, bir ilk biyotinile edilmiş proteinin her yeni yeri için gerekli olabilir sensörler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.. BLI Testi için Enstrüman Programlama

Lamba ısınmak için izin önceden enstrümanın en az bir saat açın, bu gürültü en aza indirmek ve deney sırasında optik sinyal kayması gereklidir. Numune plaka tutucu prewarm için enstrüman sekmesi aracılığıyla İstediğiniz sıcaklığı ayarlayın. Sonra Veri Toplama yazılımı deney tasarımı kurmak. Deney Sihirbazı sekmesinde "Yeni Kinetik Experiment" seçeneğini seçin. Bu tanımlanmış olması gereken tüm adımları ile bir sekmeli menü sunuyor.

1.1. Plaka Tanımlama

96 oyuklu numune plakası üzerinde kullanılmak üzere sütunları tanımlar. Tampon hareketsizleştirilmiş protein ya da bağlanma partneri dahil etmek için sütun atama. Her oyuğa federasyonu için kullanılacak ortak bağlanma konsantrasyonunu girin. Not: Şekil 2'de gösterilen plaka tanımı farklı deneyleri için seçenekler vardır.

1.2. Tahlil Tanımı

ontent "> tahlili için gerekli tüm adımları tanımlamak için kullanılır. bunlar (i) Temeli (birkaç), (ii) yükleme, (iii) Association ve bağlanma partneri (iv) ayırma yer alır. Daha sonra, aşağıda tarif edildiği gibi, bireysel adımları deney bağlantı ilgili sütunda deney aşamasını ve daha sonra çift tıklayarak seçerek numune levha üzerindeki kuyu sütunlar. bu programlar, sensörler, tahlil sırasında sonraki kuyu bir sütundan taşınacak.

1. Baseline
   96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilk BLI sinyalleri oluşturmak için, deney tamponu içerisinde sensör (Şekil 2, sütun 1) ile, bir kısa temel aşama (≥ 60 saniye) ile başlayın.
2. (Sensörler biyotinilatlı proteini hareketsizleştirir) Loading
   Biyotinile protein (Şekil 2, sütun 2) içerir çukurlara sensörleri atama. Bir bağlanma önceden belirlenmiş bir düzeye (bkz) elde etmek için eşik işlevini kullanın. Tüm sensörler hareket olacak şekilde eşik seçeneğini ayarlayınsensörlerden herhangi biri eşiğine ulaştığında kuyuların sonraki sütuna d.
3. Baseline
   Sensörlerin uzak sabitlenmemiş biyotinile edilmiş proteinler yıkama ve yeni, dengeli başlangıç ​​sinyalleri oluşturmak için tampon maddesi içinde bir başlangıç ​​adımı (tipik olarak> 5 dakika Şekil 2, sütun 3) içerir. Sadece (Şekil 3'te olduğu gibi) temel bağlanma / ayrılma tahlilleri için, Association aşamasından önce tampon yeni kuyu sensörlerle fazladan bir başlangıç ​​aşamasını (60 sn) (Şekil 2, sütun 4) içerir.
4. (Hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​bağlanma partnerinin) Association
   (Şekil 3'te olduğu gibi) temel bir bağlayıcı / ayrılma deneyi için, farklı sensörler / kuyu için kullanılacak bağlanma partnerinin konsantrasyonları bir dizi (Şekil 2, sütun 5) seçin. Bağlanma partnerinin en az bir doyma konsantrasyonu, sinyal bağlama denge yaklaşım gerekir, böylece adım zaman ayarlayın. Bir için(Şekil 5 'de olduğu gibi) protein-protein kompleksinin ayrışma küçük ligandlann allosterik etkilerini test etmek için deney, her bir ilişki kuyularda kullanım için (10-kat tahmini K _D yukarıda ~) bağlanma partnerinin, tek bir yüksek konsantrasyonu seçin.
5. (Bağlanma partnerinin) Ayrışma
   Sadece (Şekil 3'te olduğu gibi) temel bir bağlama / ayırma deneyi için, sütun 4 (Şekil 2), esas önce ilave taban için kullanılan ile aynı tampon oyuklara dönmek için algılayıcıları. Küçük ligandların allosterik etkilerini test etmek için bir deney için, bunun yerine, 6. sütun her bir oyuğa tamponu artı farklı allosterik ligandları ihtiva edebilir (Şekil 2), geçmek için algılayıcıları.

1.3. Sensör Atama

Deney için önceden silinmiş sensörleri içerir sensör tepsisine yerleri gösterir. Deneme FAI beri herhangi bir boş pozisyonları tespitBen hiçbir sensörler aldı eğer.

1.4. İnceleme Deneme

Hataları denetlemek ve bunları düzeltmek için geri gitmek için planlanan tüm adımları gözünüzde canlandırın.

1.5. Denemeyi çalıştırın

Veri dosyalarının konumu da dahil olmak üzere gerekli ayrıntıları girin. Deney için istenilen sıcaklığa girin. Sensörleri hala Önnemlendirme gerektiriyorsa, deney başlamadan geciktirmek için seçeneği seçin. Son olarak, bir kez tüm numune hazırlama (adım 2) tamamlandı ve numune plaka ve sensör tepsi hem enstrüman yüklenir, tahlil çalıştırmak için Git düğmesini tıklatın.

2. Numune Hazırlama

1. Uygun bir deney tamponu hazırlayın. (8.0 'a pH değerinin ayarlanması için ilave edildi) - ((N-morfolino) propansülfonik asit 3), Tris (Tris (hidroksimetil) amino-metan), 50 mM KCI, 20 mM MOPS: Tampon, Şekil 3 ve 5'te gösterilen deneyler için kullanılır. BSA (sığır serum albumin, yağlı asitsiz, 0.5 DahilTüm deney adımlar için ve biyotinile protein veya sensörlere proteinlerin spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bağlanma partnerinin tüm seyreltileri için tampon maddesi içinde) son mg / ml.
2. (Bkz) uygun bir konsantrasyona kadar deney tamponu içerisinde biyotinile protein (ε) seyreltin.
3. Deney tamponu içinde bağlanma partner (F ₁ (ε-)) (kullanmak için konsantrasyonlarının aralığı için tartışma bakınız) seyreltim dizileri hazırla.
4. Koruyucu kaplama sükroz çıkarmak için en az 10 dakika boyunca streptavidin kaplı sensörleri ön ıslatılmış. Sensör tepsiden sensör içeren raf çıkarın ve tepsinin üzerindeki yönlendirme çentiğe plakanın bir köşesini kayar, tepsinin dibinde bir 96-plaka takın. Sensörlerin kolon kullanılması için, 96 oyuklu plakanın bu sütunda oyuk başına deney tamponu içinde 200 ul ekleyin. (Yuvaları ile sekmeleri) doğru yönde tepsiye sensörlerin raf dönün.
5. Adım 1 programlama sırasında atanan, o kuyuları doldurmakŞekil 2'de olduğu gibi, deney tamponu ya da uygun protein seyreltileri f numune plakası. Onlar optik sinyal gürültü neden olabilir, kabarcıkları tanıtan kaçının. (I) biyotinile protein ya da (ii) bağlanma partneri ya da ihmal bir veya daha fazla kuyu bir referans içerir.
6. Enstrümanın kapağını açın ve sahnenin yuvalarına takılı tepsinin sekmeleri ile, sahnede (sol) üzerine sensör tepsisini yerleştirin. Plaka tutucu (sağda) örnek plaka yerleştirin; plaka sahibi belirtildiği gibi plaka, düz ve doğru yönde oturduğundan emin olun. Kapıyı kapatın ve Veri Toplama programı (adım 1.5) den deneyi başlar.

3. Veri İşleme

1. Tahlil çalıştırmak sonra, Veri Analizi yazılımı açın ve verileri içeren klasörü yükleyebilirsiniz. Her bir sensör ile, (solda) bir adım bilge İşleme menüsünü ve ham kinetik verileri görmek için "İşleme" sekmesine tıklayın (AH), farklı bir renk atanır (bkz.Şekil 3).
2. "Veri Seçimi" altında, "Sensör Seçimi" düğmesine tıklayın. "Örnek Plate" Harita üzerinde, referans kuyu gibi 1 ya da 2 kontrol sensör (G, Şekil 3'ün deneyde H) için kuyu işaret etmektedir. İşleme menüsünde, "Çıkarma" kutusunu işaretleyin ve diğer her sensörün sinyal referans sinyalini (tek ya da ortalama) çıkarma "Referans Wells" seçeneğini seçin.
3. "Hizala Y Ekseni" adımı kullanarak = 0 Y tüm izlerini hizalayın. Hizalama adım (bu Association adımdan önce son temel varlık) olarak "Temeli" seçeneğini seçin. "Zaman Aralığı" için, bu başlangıca (Şekil 3 gibi bir 60-saniye başlangıç ​​için, yani 50-60 sn) ve son 10 sn girin.
4. Derneği ve ayrışma adımlar arasında sinyal vardiya en aza indirmek için "Inter-adım Düzeltme" kutucuğunu işaretleyin. Baseline veya Ayrışma align seçin.
5. Çoğu durumda Savitzky-Golay filtreleme işlevini seçiniz ve tıklayınız "Süreç Veri!" devam etmek. Gözle kontrolson işlenen veriler (alt sağ panel). Sinyal izleri Derneği ve ayrışma adımlar arasında önemli bir değişim gösteriyorsa, (Şekil 4 gibi) global veri analizi için tasarlanan deneyleri ile, "Inter-adım Düzeltme" için Ayrışma veya Baseline seçimini değiştirmek ve Veri geçmeden önce veri işleyemeyiz Analiz.

4. Veri Analizi

Başlamak için Veri Analizi "Analiz" sekmesini tıklayın. Not: Örnek birden fazla bağlayıcı / ayrılma eğrileri genel analizi için (Şekil 3 'de olduğu gibi) aşağıda adımları tekrarlayın.

1. "Analiz Adım" için, birleşme ve ayrılma seçin. "Model" için, 1:01 seçin. Not: diğer sınırlı seçenekleri mevcuttur.
2. "Montaj" için, (Full) Küresel seçin. "By Group" için (grafiğin yanı) Renk seçin. (R _max bağımsız takılmasını sağlamak için "Sensör tarafından Unlinked R _max" seçiniz par bağlayıcı doyurarak üzerine maksimum sinyal tepkisi) hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​tner. Not: sensörler hareketsiz protein miktarı biraz farklı olarak biz (Şekil 3, Yükleniyor bakınız), en deneyleri için bunu yapmak.
3. Gösterilen masanın üzerinde, analiz edilecek tüm sensör izleri aynı renk var, bu yüzden küresel olarak analiz edilecektir emin olun. Gerekirse, bir veya birden fazla sensör küresel uymasından atlarsanız izleri seçin: "Dahil" sütununda, istenen sensör pozisyonunda sağ tıklayın ve "Wells dışla" seçeneğini seçin.
4. "Fit Curves!" Tıklayın doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. (Şekil 4 gibi) sensör veri izleri ile regresyon eğrileri (i) bindirme, montaj artıklar (ii) araziler ve kararlı bir parametre değerleri (oran sabitleri, R _max ile (iii) bir tablo eklemek uydurma sonuçlarını incelemek, K _D) ve istatistik parametreler için (standart hatalar, Ki-kare, R ^2).
5. "Veri Aktarma" başlığı altında, "İhracat Tablo için. Csv File" tıklayarak uydurma sonuçları kaydedin. Grap içinhing veya diğer yazılımı ile veri / donatılmış eğriler daha fazla analiz, bir metin dosyasındaki her sensörün verilerini ve donatılmış eğrisi kaydetmek için "İhracat Montaj Sonuçlar" butonuna tıklayınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Gerçek zaman bağlanma ve ayrılma BLI kinetiği Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu deney Birleşme ve ayrışmaya olarak deney tamponu ile yapıldı. Sensörler sadece kısaca ön ıslatılmış olmuştu çünkü bu deney, 10 dakika temel adımla başladı. Daha sonra, biyotinile edilmiş ε sensör üzerine yüklenmiştir. Ε farkedilir bir ayrışma bağlayıcı bir ortak ilave vardı referans eğrisinin (G) görüldüğü gibi, geriye kalan tüm adımlar boyunca oluştu. Bir ikinci referans senso...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

BLI için şu anda mevcut araçlar biyomoleküler etkileşimler için deneylerinde önemli verim ve esnekliğe izin verir. Çeşitli çözelti örnekleri siyah mikrotitre levhasının küvetleri içerisinde dağıtılır ve paralel BLI sensörler bir dizi tabağın kuyu sütunlar arasında ileri ve geri hareket ettirmek için programlanmıştır. Numuneler tahlil boyunca orbital çalkalama ile karıştırılır. Burada kullanılan sistem 8 sensörleri ve 96 oyuklu bir plaka örnek kullanır, ancak başka bir sistem 16, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available