Bio-couche interférométrie pour Cinétique des interactions protéine-protéine et allostériques Effets ligand mesure

Résumé

Les protocoles décrivent ici les essais cinétiques des interactions protéine-protéine avec Bio-couche interférométrie. Type F ATP synthase, qui est impliquée dans le métabolisme énergétique cellulaire, peut être inhibée par sa sous-unité ε dans des bactéries. Nous avons adapté Bio-couche interférométrie pour étudier les interactions du complexe catalytique avec le domaine C-terminal inhibiteur de ε.

Résumé

Nous décrivons l'utilisation de Bio-couche interférométrie pour étudier les interactions inhibitrices de la sous-unité ε avec le complexe catalytique d'Escherichia coli ATP synthase. Bactérienne de type F ATP synthase est la cible d'une nouvelle antibiotique approuvé par la FDA pour combattre la tuberculose résistante aux médicaments. Comprendre spécifiques-bactéries auto-inhibition de l'ATP synthase par le domaine C-terminal de la sous-unité ε pourrait fournir un nouveau moyen de cibler l'enzyme pour la découverte de médicaments antibactériens. Le domaine C-terminal de ε subit un changement conformationnel dramatique lorsque les transitions de l'enzyme entre les états actifs et inactifs, et des ligands au site catalytique, qui peuvent influencer des conformations de ε est prédominante. Les mesures d'analyse cinétique de liaison / dissociation avec le complexe catalytique, et indirectement de mea εSures le décalage ε de l'enzyme lié à et à partir de la conformation d'inhibition apparemment nondissociable. Le signal d'interférométrie Bio-couche n'est pas excessivement sensible à la composition de la solution, de sorte qu'il peut également être utilisé pour surveiller les effets allostériques de ligands au site catalytique sur les changements conformationnels de ε.

Introduction

Interactions protéine-protéine sont importantes pour de nombreux processus biologiques, et les méthodes optiques sans étiquette comme résonance plasmonique de surface (SPR) ont été utilisés in vitro pour étudier la cinétique de liaison et de dissociation ^1. La plupart des méthodes sans étiquette immobiliser une biomolécule sur une surface du capteur et d'utiliser un signal optique pour détecter un partenaire de liaison à partir de la solution telle qu'elle s'associe à la biomolécule immobilisée ^1. Bien que SPR est une méthode très sensible, elle est sujette à des interférences dues à des changements dans l'indice de réfraction de la solution s'écoulant sur ​​le capteur ^2. Bien que pas aussi sensible que SPR, Bio-couche interférométrie (BLI) est moins affectée par des changements dans la composition de l'échantillon ^1,3. BLI utilise des biocapteurs à fibres optiques qui ont un revêtement biocompatible propriétaire à la pointe. Le système utilisé ici (Octet-RED96) contient huit spectrophotomètres. La lumière blanche est canalisée vers une rangée de sondes qui se déplacent sur un bras robotisé. Capteurs à fibre optique are captés par les sondes et déplacé à une plaque de 96 puits contenant des échantillons. L'une des molécules cibles est immobilisé sur la surface du biocapteur. Puis capteurs sont déplacés aux puits contenant le partenaire de liaison en solution. BLI surveille association du partenaire de liaison avec la molécule immobilisée, puis surveille dissociation après le déplacement des capteurs de solution sans le partenaire de liaison. La liaison de molécules à la surface du biocapteur conduit à des changements de l'interférence optique entre les ondes lumineuses qui reflètent vers les spectrophotomètres à partir d'une surface interne et externe à partir de l'interface entre le capteur et la solution. Ces changements dans les interférences peuvent être quantifiés et utilisés pour déterminer les taux cinétiques de liaison et de dissociation, résumées dans l'animation de la figure 1.

Nous avons appliqué BLI pour mesurer les interactions entre le complexe catalytique de l'ATP synthase bactérienne et sa sous-unité ε, qui peut auto-inhiber l'enzyme. ATP synthase est un nanomoteur rotatif enrobé dans une membrane qui catalyse la synthèse et l'hydrolyse de l'ATP ^4. Le complexe catalytique (F ₁₎ peut être isolé sous une forme soluble qui fonctionne comme une ATPase. Sous-unité ε a deux domaines: le domaine N-terminal (NTD) est nécessaire pour un montage correct et couplage fonctionnel de l'enzyme mais n'interagit pas directement avec les sous-unités catalytiques; du domaine C-terminal (CTD) peut inhiber l'enzyme en interagissant avec de multiples sous-unités catalytiques ^5,6. Ce règlement de ε-médiation est spécifique à ATP synthases bactériennes et n'est pas observée dans l'homologue mitochondrial. ATP synthase a apparu comme une cible pour les médicaments antibactériens, comme le montre la récente approbation de la FDA de bedaquiline pour traiter la tuberculose résistante aux médicaments ^7. Ainsi, le ciblage rôle inhibiteur de ε pour la découverte de médicaments pourrait donner antibactériens qui ne inhibent l'ATP synthase mitochondriale. Avec le complexe catalytique isolé (F _1), εdevient une sous-unité indissociable. Cependant, avec ε lié à F _1, la εCTD peut subir un changement de conformation dramatique, insertion partielle dans la cavité centrale de l'enzyme et la formation d'un état ​​d'inhibition qui est peu probable de dissocier directement ^6,8. Nous utilisons BLI pour mesurer la cinétique de F ₁ / ε liaison et de dissociation, et indirectement, pour examiner les effets allostériques du site catalytique ligands sur la conformation de ε.

Dans notre système, ε a été choisie pour l'immobilisation sur la surface du capteur étant donné que le signal BLI (comme SPR) est sensible à la masse des molécules de liaison à la surface. La sous-unité ε est petit (~ 15 kDa) par rapport à la principale F ₁ complexe (~ 347 kDa). Ainsi, un signal de plus grande BLI va résulter de la liaison de F ₁ à ε immobilisé. Afin de surveiller F ₁ dissociation, qui peut être très lent, ε doit être fermement immobilisée. Ainsi nous avons choisi de biotinylerEt l'immobiliser sur biocapteurs revêtues de streptavidine. Les protéines peuvent être biotinylés par (i) la modification aléatoire des lysines de surface ^9, (ii) réaction d'une cystéine natif ou composite unique avec un réactif de biotine-maléimide ¹⁰ ou (iii) l'addition génétiquement un peptide biotine-accepteur spécifique qui est enzymatiquement biotinylé pendant l'expression in vivo de la protéine marquée ^11. Dans notre système, ε est biotinylé en utilisant la méthode (iii) ^8. Une fois ε-biotine marqué est immobilisé sur des capteurs de streptavidine, BLI peut mesurer la liaison et la dissociation de F ₁ qui a été épuisée de la sous-unité ε (F ₁ (-ε)). Pour les expériences décrites ici, des essais préliminaires ont été faites pour déterminer des quantités raisonnables de la protéine biotinylé à immobiliser sur les capteurs. Cela peut varier, en fonction du poids moléculaire de la protéine et son partenaire de liaison, mais le but est de déterminer une quantité minimale de protéine immobilisée tchapeau fournit (i) acceptable signal sur bruit pour la cinétique de liaison avec une faible concentration du partenaire de liaison (K _D ci-dessous) et (ii) un minimum de distorsion de la cinétique de liaison de concentration quasi-saturation du partenaire de liaison. En outre, la stoechiométrie de biotinylation peut varier (mais évitez> 1 mole de biotine / protéine mol), de sorte que certains dosage initial peut être nécessaire pour chaque nouveau lot de protéines biotinylé pour confirmer qu'un signal BLI convergentes peut être réalisé au cours de l'immobilisation sur la streptavidine capteurs.

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Protocole

Une. Programmation de l'instrument de BLI Assay

Allumez l'instrument au moins une heure à l'avance pour permettre à la lampe de se réchauffer, ce qui est nécessaire pour réduire le bruit et la dérive du signal optique pendant l'expérience. Réglez la température souhaitée via l'onglet instrument Préchauffez le support de plaque échantillon. Ensuite, mettre en place le plan expérimental dans le logiciel d'acquisition de données. Sélectionnez "Nouvelle Expérience Kinetics" dans l'onglet de l'assistant de l'expérience. Cela présente un menu à onglets avec toutes les mesures qui doivent être définis.

1.1. Plaque Définition

Définir les colonnes à utiliser sur la plaque d'échantillons à 96 puits. Assigner les colonnes pour contenir tampon, protéine immobilisée ou partenaire de liaison. Pour chaque association ainsi, entrer la concentration de partenaire de liaison à utiliser. Remarque: la définition de la plaque représentée sur la figure 2 a des options pour des dosages distincts.

1.2. Essai Définition

ontenu "> Définir toutes les mesures nécessaires pour le dosage. s'agit notamment (i) de base (plusieurs), (ii) en cours de chargement, (iii) Association et (iv) La dissociation de partenaire de liaison. Ensuite, comme décrit ci-dessous, un lien étapes de test avec colonnes de puits sur la plaque de l'échantillon en sélectionnant l'étape de test, puis double-cliquant sur la colonne correspondante. Cette programmes les capteurs à être déplacés d'une colonne de puits à l'autre pendant le test.

1. Baseline
   Commencer avec un pas de ligne de base courte (≥ 60 sec), avec des capteurs dans le tampon d'essai (figure 2, colonne 1), pour établir des signaux de BLI initiales dans la plaque à 96 puits.
2. Chargement (immobilisation de la protéine biotinylée sur les capteurs)
   Assigner des détecteurs à puits qui contiennent la protéine biotinylé (Figure 2, colonne 2). Utilisez la fonction de seuil pour atteindre un niveau prédéterminé de liaison (voir Introduction). Réglez l'option de seuil de sorte que tous les capteurs seront mouvementd à l'autre colonne de puits lorsque l'un quelconque des capteurs atteigne le seuil.
3. Baseline
   Inclure une autre étape de base dans un tampon (figure 2, colonne 3; généralement> 5 min) pour laver protéines biotinylées non immobilisés par les capteurs et établir de nouveaux signaux de référence, stable. Pour de base des essais de liaison / de dissociation que (comme dans la figure 3), inclure une étape supplémentaire de base (60 sec) avec des capteurs dans de nouveaux puits de tampon (figure 2, colonne 4) avant l'étape d'association.
4. Association (du partenaire de liaison à la protéine immobilisée)
   Pour une analyse de base de liaison / de dissociation (comme dans la figure 3), sélectionnez une plage de concentrations de partenaire de liaison à utiliser pour différents capteurs / puits (figure 2, colonne 5). Ajuster le temps de l'étape de telle sorte qu'au moins une concentration saturante du partenaire de liaison devrait approcher le signal liaison à l'équilibre. Pour unessai pour tester les effets allostériques de petits ligands sur la dissociation du complexe protéine-protéine (comme dans la Figure 5), sélectionnez une seule concentration élevée de partenaire de liaison (~ 10 fois supérieure à la estimée K _D) pour une utilisation dans tous les puits de l'association.
5. Dissociation (du partenaire de liaison)
   Pour un dosage de liaison de dissociation de base / seulement (comme sur la figure 3), désigner les capteurs pour revenir à la colonne 4 (Figure 2), les mêmes puits de tampon que celui utilisé pour la ligne de base supplémentaire avant d'association. Pour un essai pour tester les effets allostériques de petits ligands, au lieu de désigner des capteurs de passer à la colonne 6 (figure 2), où chaque puits peut contenir un tampon en plus différents ligands allostériques.

1.3. Capteur Affectation

Indiquer les endroits dans le plateau de capteur qui va contenir les capteurs préalablement mouillée pour le dosage. Identifier toutes les positions vides puisque l'expérience sera fail si aucun capteur sont pris en charge.

1.4. Expérience avis

Visualisez toutes les mesures prévues à vérifier pour les erreurs et aller de nouveau à les corriger.

1.5. Exécutez l'expérience

Entrez les détails nécessaires, y compris l'emplacement des fichiers de données. Entrez la température désirée pour l'expérience. Si les capteurs nécessitent encore prémouillage, sélectionnez l'option de retarder le démarrage de l'expérience. Enfin, une fois toute la préparation de l'échantillon est terminée (étape 2) et à la fois la plaque de l'échantillon et le plateau de capteur sont chargés dans l'instrument, cliquez sur le bouton OK pour lancer l'analyse.

2. Préparation de l'échantillon

1. Préparer un tampon de dosage approprié. Tampon utilisé pour les expériences représentées sur les figures 3 et 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morpholino) propanesulfonique), le Tris (Tris (hydroxyméthyl) amino-méthane) (ajouté pour ajuster le pH à 8,0), 50 mM de KCl. Inclure BSA (albumine de sérum bovin, acides gras libres, de 0,5mg / ml final) dans le tampon pour toutes les étapes de l'analyse et pour toutes les dilutions de la protéine partenaire de liaison biotinylé ou de réduire au minimum la liaison non spécifique de protéines à des capteurs.
2. Diluer la protéine biotinylée (ε) dans du tampon analytique à une concentration appropriée (voir l'introduction).
3. Préparer des dilutions du partenaire de liaison (F ₁ (-ε)) dans un tampon de dosage (voir discussion pour la gamme de concentrations à utiliser).
4. Pré-imbibé les capteurs revêtues de streptavidine pendant au moins 10 minutes pour éliminer de leur revêtement protecteur de saccharose. Retirer le porte-capteur contenant le capteur et le plateau à insérer une plaque à 96 puits dans le fond du plateau, en glissant l'un des coins de la plaque dans l'encoche d'orientation sur le plateau. Pour la colonne de capteurs à utiliser, ajouter 200 ul de tampon d'essai par puits dans la colonne de la plaque de 96 puits. Remettre le panier de capteurs sur le plateau dans le bon sens (avec onglets dans les fentes).
5. Comme attribué lors de la programmation à l'étape 1, remplir les puits of la plaque d'échantillons avec un tampon de dosage ou des dilutions appropriées de la protéine, comme dans la figure 2. Éviter d'introduire des bulles, car ils peuvent provoquer du bruit dans le signal optique. Inclure un ou plusieurs puits de référence qui omettent soit (i) la protéine biotinylé ou (ii) un partenaire de liaison.
6. Ouvrez la porte de l'appareil et insérez le plateau de capteur sur la scène (à gauche), avec les onglets du plateau insérés dans les fentes de la scène. Insérez la plaque de l'échantillon dans le support de plaque (à droite), assurez-vous que la plaque est assis à plat et dans le bon sens, comme indiqué sur le support de plaque. Fermez la porte et commencer le test du programme d'acquisition de données (étape 1.5).

3. Traitement des données

1. Après le test a été exécuté, ouvrez le logiciel d'analyse de données et de charger le dossier contenant les données. Cliquez sur l'onglet "Traitement" pour voir un menu étape par étape de traitement (à gauche) et les données cinétiques premières, à chaque capteur (AH) attribué une couleur différente (voirLa figure 3).
2. Sous la rubrique «Sélection de données", cliquez sur le bouton "Sélection capteur". Sur la "plaque d'échantillons de carte", désigner les puits pour 1 ou 2 capteurs de contrôle (G, H dans le test de la figure 3) que les puits de référence. Dans le menu de traitement, cochez la case «Soustraction» et sélectionnez «Référence Wells" pour soustraire le signal de référence (simple ou moyenne) à partir du signal de chaque autre capteur.
3. Aligner toutes les traces de Y = 0 en utilisant l'étape "Aligner l'axe Y". Sélectionnez "de base" comme l'étape d'alignement (ce qui est la dernière base avant l'étape d'association). Pour "Plage de temps", entrez les 10 dernières secondes de cette ligne de base (c.-à 50-60 secondes pour une base de référence de 60 sec, comme dans la figure 3).
4. Cochez la case "Inter-étape de correction» pour minimiser les changements de signaux entre les étapes d'association et de dissociation. Sélectionnez aligner à base ou de dissociation.
5. Sélectionner la fonction de filtrage Savitzky-Golay dans la plupart des cas et cliquez sur "Process Data!" de procéder. Inspecter visuellementles données finales transformés (panneau en bas à droite). Avec des essais destinés à l'analyse globale des données (comme dans la figure 4), si des traces de signaux montrent un changement important entre l'Association et les étapes de dissociation, changer la sélection de dissociation ou de référence pour le "Correction Inter-étape» et retraiter les données avant de procéder à des données Analyse.

4. Analyse des données

Cliquez sur l'onglet "Analyse" dans l'analyse des données pour commencer. Remarque: l'exemple ci-dessous sont les étapes de l'analyse globale de plusieurs courbes de liaison / dissociation (comme sur la figure 3).

1. Pour "l'étape pour l'analyse", choisissez Association et dissociation. Pour "modèle", sélectionnez 1:1. Remarque: d'autres options disponibles sont limitées.
2. Pour "assemblage", choisissez mondial (complet). Pour "Groupe par" sélectionnez Couleur (comme sur le graphique). Sélectionnez «R _max UNLINKED par capteur" d'autoriser le montage indépendant de R _max (réponse maximale du signal sur la liaison de la saturation parTENAIRE à la protéine immobilisée). Note: nous le faisons pour la plupart des tests, comme des capteurs varient légèrement dans la quantité de protéine immobilisée (voir la figure 3, Chargement).
3. Sur le tableau ci, assurez-vous que toutes les traces de capteurs à analyser ont la même couleur, afin qu'ils soient analysés comme un ensemble global. Si nécessaire, sélectionnez un ou plusieurs capteur traces d'omettre de montage mondiale: dans la colonne "Inclure", cliquez-droit sur la position du capteur souhaité et sélectionnez "Exclure Wells".
4. Cliquez sur "ajustement des courbes!" commencer l'analyse de régression non linéaire. Examiner les résultats de montage, qui comprennent (i) superposition des courbes de régression avec des traces de données de capteurs (comme sur la figure 4), (ii) des graphiques de résidus de montage, et (iii) un tableau avec des valeurs de paramètre déterminées (constantes de taux, R _max, K _D) et statistiques (erreurs types de paramètres, Chi-squared, R ^2).
5. Sous "Exporter des données", enregistrer les résultats de montage en cliquant sur "Exporter le tableau. Fichier csv". Pour graphing ou une analyse plus approfondie des données / courbes ajustées avec un autre logiciel, cliquez sur "Exporter les résultats de montage" pour enregistrer les données de chaque capteur et courbe ajustée dans un fichier texte.

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Résultats

Liaison en temps réel et la cinétique de dissociation de BLI sont le montre la figure 3. Cette expérience a été effectuée avec un tampon de dosage en association et de dissociation. Cette expérience a été commencé avec un pas de ligne de base de 10 min depuis les capteurs ont été brièvement pré-imbibé. Ensuite, ε biotinylé a été chargé sur les capteurs. Pas de dissociation détectable de ε s'est produite dans toutes les étapes restantes comme on le voit à partir de la courbe d...

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Discussion

Instruments actuellement disponibles pour BLI permettent un débit important et la flexibilité dans des essais pour les interactions biomoléculaires. Différents échantillons de solution sont distribués dans des puits d'une plaque de microtitration noire, et un ensemble de capteurs BLI parallèles sont programmés pour se déplacer d'avant en arrière entre les colonnes de puits de la plaque. Les échantillons sont agités par agitation orbitale tout au long de l'essai. Le système utilisé ici a huit ca...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available