단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

요약

여기에 프로토콜은 바이오 층 간섭과 단백질 - 단백질 상호 작용의 운동 분석을 설명합니다. 셀룰러 에너지 대사에 관여 F 형 ATP 합성 효소는, 세균에서의 ε 서브 유닛에 의해 억제 될 수있다. 우리는 ε의 억제 C-말단 도메인과 촉매 복합체의 상호 작용을 연구하는 바이오 층 간섭을 채택했다.

초록

우리는 대장균 ATP 합성 효소의 촉매 복합체 소단위 ε의 억제 작용을 연구하는 바이오 층 간섭계를 사용하는 방법을 설명한다. 세균성 F 형 ATP 신타 약물 내성 결핵에 대처하기 위해 새로운, FDA 승인 항생제의 대상입니다. 서브 유닛 ε의 C-말단 도메인에 의해 ATP 합성 효소의 이해 박테리아 별 자동 억제 항균 약물의 발견을위한 효소를 표적으로하는 새로운 방법을 제공 할 수있다. ε의 C-말단 도메인은 활성 및 비활성 상태 및 촉매 사이트 리간드 간의 전이 효소가 우세한 ε의 배좌의 영향을 미칠 수있는 극적인 형태 적 변화를 겪는다. 간접적으로 ε의 바인딩 / 촉매 복합과 분리하고, MEA의 분석 측정 반응 속도슈어 분명히 nondissociable 억제 형태 및에서 효소 결합 ε의 변화. 바이오 - 레이어 간섭 신호는 용액 조성물에 지나치게 민감하지이므로도 ε의 형태 적 변화에 촉매 사이트 리간드의 알로 스테 릭 효과를 모니터하는데 사용될 수있다.

서문

단백질 - 단백질 상호 작용은 많은 생물 학적 과정에 중요하며, 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 같은 레이블의 광학 방법은 ^{1 바인딩과} 해리의 속도를 연구하기 위해 체외에서 사용되어왔다. 대부분의 라벨없는 방법은 센서면에 하나의 생체 분자를 고정화하고 고정화 ^한 생체 분자와 연관로서 용액으로부터 바인딩 파트너를 검출하는 광 신호를 사용한다. SPR은 매우 민감한 방법이지만,이 때문에 센서 ^(2)를 통해 흐르는 용액의 굴절률 변화에 간섭하는 경향이있다. SPR 바이오 층 간섭계 (BLI)만큼 민감하지가 적은 샘플 구성 ^1,3의 변화에 의해 영향을받지 않는다. BLI는 끝 독점 생체 적합성 코팅이 광섬유 바이오 센서를 사용합니다. (진수 RED96) 여기에 사용 된 시스템에 8 개의 분광 광도계가 포함되어 있습니다. 흰색 빛이 로봇 팔에 이동 프로브의 행으로 파이프됩니다. 광섬유 센서는 아칸소전자는 프로브에 의해 포착 및 샘플을 포함하는 96 - 웰 플레이트로 옮겼다. 표적 분자 중 하나는 바이오 센서 표면에 고정된다. 그런 다음 센서 솔루션의 결합 파트너를 포함하는 우물로 이동합니다. BLI는 고정 된 분자와 결합 파트너의 연결을 모니터링하고 바인딩 파트너없이 솔루션에 센서를 이동 한 후 해리를 모니터링합니다. 바이오 센서의 표면에 분자의 결합은 내부 표면 및 센서 및 솔루션 사이의 외부 인터페이스에서 다시 분광 광도계에 반영하는 빛의 파장과 광 간섭의 변화로 연결됩니다. 간섭의 이러한 변화는 정량화 및도 1의 애니메이션에 요약 바인딩 및 해리의 운동 속도를 결정하는데 사용될 수있다.

우리는 촉매 세균 ATP 합성 효소의 복잡한 효소를 자동으로 억제 할 수는 ε의 서브 유닛 사이의 상호 작용을 측정하는 BLI를 적용했습니다. ATP 싸이nthase 합성 및 ATP ^4의 가수 분해를 촉매 막 - 내장 된 회전을 nanomotor입니다. 촉매 복합체 (F ₁₎ ATP 아제로 작동하는 수용성 형태로 분리 할 수있다. 소단위 ε는 두 도메인있다 : N-말단 영역 (NTD) 적절한 조립 및 효소의 기능적인 결합을 위해 필요하지만, 촉매 서브 유닛과 직접적으로 상호 작용하지 않고, C-말단 도메인 (CTD)에 상호 작용하여 효소를 억제 할 여러 촉매 서브 유닛 ^5,6. 이 ε - 중재 규정은 세균 ATP 합성 효소에 고유하며 미토콘드리아 상동에서 관찰되지 않습니다. 약물 내성 결핵 ^7을 치료하는 bedaquiline의 최근 FDA의 승인에 의해 도시로 ATP 합성 효소는, 항균 약물의 대상으로 떠오르고있다. 따라서, 약물 발견을위한 ε의 억제 역할을 대상으로하는 미토콘드리아 ATP 합성 효소를 억제하지 않는 항균제를 얻을 수 있습니다. 절연 촉매 착체 (F _1), ε와 함께해리 서브 유닛이됩니다. 그러나, F _(1)에 바인딩 ε와 εCTD 부분적 효소의 중앙 공동 내로 삽입하고 직접 ^6,8 해리 가능성은 억제 상태를 형성 극적인 형태 적 변화를 겪을 수있다. 우리는 촉매 사이트는 ε의 형태에 대한 리간드의 알로 스테 릭 효과를 조사하기 위해, 간접적으로 F ₁ / ε 결합과 해리의 반응 속도를 측정하는 BLI를 사용합니다.

우리의 시스템에서, ε는 (SPR 등) BLI 신호 이후 센서 표면에 고정화를 위해 선택 하였다는 표면에 결합 분자의 질량에 민감하다. ε 서브 유닛은 메인 F ₁ 단지 (~ 347 kDa의) 작은 (~ 15 kDa의)를 기준으로합니다. 따라서, 더 큰 BLI 신호는 고정 ε에 F _1의 결합에서 발생합니다. 매우 느릴 수 있습니다 F ₁ 해리를 모니터링하기 위해, ε 강하게 고정해야합니다. 따라서 우리는 biotinylate하기로 결정했습니다; 및 스트렙 타비 딘 - 코팅 된 바이오 센서를 이용하여 그것을 고정시킨다. 단백질 표면 리신 ^(9)의 (I)의 임의의 변형, 비오틴 - 말레이 미드 시약 ⁽¹⁰⁾ 또는 (ⅲ) 유전자 효소 중에 비오틴되는 특정 비오틴-수용체 펩티드 첨가와 고유 네이티브 또는 엔지니어링 시스테인 (II)의 반응에 의해 비오틴 수 태그 단백질 ^(11)의 생체 내 발현. 우리의 시스템에서, ε는 방법 (III) ⁸ 사용 비오틴된다. 비오틴 태그 ε는 스트렙 타비 딘 센서에 고정되면, BLI는 바인딩과 서브 유닛 ε (F ₁ (-ε))의 소진 된 F _1의 분리를 측정 할 수 있습니다. 여기 기재된 실험을 위해, 예비 분석은 센서에 고정화 바이오틴 단백질의 적당한 양을 결정하기 위해 수행되었다. 이 단백질의 분자량 및 그 결합 파트너에 따라 달라질 수 있지만, 목표는 고정화 단백질 t의 최소한의 양을 결정하는 것이다모자를 제공합니다 (I) 허용 신호 대 잡음 (K _D 이하) 바인딩 파트너의 낮은 농도와 결합 파트너의 거의 포화 농도와 반응 속도를 결합 (II) 최소한의 왜곡과 반응 속도를 바인딩. 또한, 바이오 티 닐화의 화학 양론은 일관된 BLI 신호가 스트렙 타비 딘 - 코팅에 고정하는 동안 달성 될 수 있음을 확인하기 위해 변경 (만> 1 몰 비오틴 / 몰 단백질을 방지), 그래서 몇 가지 초기 분석은 바이오틴 단백질의 새 많이 필요 할 수도 있습니다 센서.

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프로토콜

1. BLI 분석 실험을위한 장비를 프로그래밍

램프가 예열 ​​할 수 있도록 사전에 기기에 적어도 한 시간에 켜고,이 소음을 최소화하고 실험 기간 동안 광 신호에서 표류 할 필요가있다. 샘플 플레이트 홀더를 prewarm 악기 탭을 통해 원하는 온도를 설정합니다. 그런 다음 데이터 수집 소프트웨어의 실험적인 디자인을 설정합니다. 실험 마법사 탭에서 "새 속도론 실험"을 선택합니다. 이 정의해야하는 모든 단계에 탭 메뉴를 제공합니다.

1.1. 플레이트의 정의

96 - 웰 샘플 플레이트에 사용되는 열을 정의. 버퍼, 고정 된 단백질 또는 바인딩 파트너를 포함하는 열을 지정합니다. 각 웰 협회, 사용될 파트너 결합 농도를 입력한다. 참고 : 그림 2의 플레이트 정의가 서로 다른 분석을위한 옵션이 있습니다.

1.2. 분석의 정의

ontent "> 분석에 필요한 모든 단계를 정의합니다. 다음은 (내가)베이스 라인 (수), (II)로드, (ⅲ) 협회와 파트너를 바인딩 (IV) 해리 (가) 있습니다. 그런 다음, 아래에 설명 된대로, 개별 분석 단계를 링크 각각의 열 분석 단계를 두 번 클릭을 선택하여 샘플 접시에 우물의 열.이 프로그램은 센서는 분석하는 동안 다음에 우물 하나의 컬럼에서 이동합니다.

1. 기준
   96 - 웰 플레이트에 초기 BLI 신호를 설정하기 위해, 분석 버퍼 센서 (그림 2, 열 1)과, 간단한 초기 단계 (≥ 60 초)로 시작합니다.
2. (센서의 바이오틴 단백질을 고정)로드
   바이오틴 단백질 (그림 2, 2 열)를 포함한다 우물에 센서를 할당합니다. 바인딩의 일정 수준 (소개를 참조하십시오) 달성하기 위해 임계 값 기능을 사용합니다. 모든 센서가 이동 될 수 있도록 임계 값 옵션을 설정센서들 중 하나가 임계 값에 도달 웰 다음 열로 D.
3. 기준
   센서에서 멀리 nonimmobilized 바이오틴 단백질을 씻고 새로운 안정 기준 신호를 설정, 버퍼의 또 다른 기본 단계 (일반적으로> 5 분 그림 2, 3 열)를 포함합니다. 만 (그림 3)을 기본 결합 / 분리 분석법의 경우, 협회의 단계 전에 버퍼의 새로운 우물에 센서와 별도의 기본 단계 (60 초) (그림 2, 4 열) 등이 있습니다.
4. (고정 된 단백질에 결합 파트너의) 협회
   (그림 3)을 기본 결합 / 분리 분석을 위해, 다른 센서 / 우물에 사용되는 바인딩 파트너의 농도 범위 (그림 2, 5 열)을 선택합니다. 바인딩 파트너의 적어도 포화 농도가 신호를 결합 평형에 접근해야되도록 단계 시간을 조정한다. 에 대한(그림 5에서와 같이) 단백질 - 단백질 복합체의 해리에 작은 리간드의 알로 스테 릭 효과를 테스트하는 분석은, 모든 협회 우물에 사용 (10 배 추정 K _D 이상 ~) 바인딩 파트너의 하나의 높은 농도를 선택합니다.
5. (바인딩 파트너의) 분리
   만 (그림 3)을 기본 결합 / 분리 분석의 경우, 4 열 (그림 2), 협회 전에 별도의 기준에 사용 된 것과 동일한 버퍼 우물로 돌아 센서를 지정합니다. 작은 리간드의 알로 스테 릭 효과를 테스트 할 수있는 분석의 경우, 대신에 열 6 각 잘 버퍼 플러스 다른 알로 스테 릭 리간드를 포함 할 수 있습니다 (그림 2)으로 이동 센서를 지정합니다.

1.3. 센서 할당

분석을 위해 prewetted 센서를 포함 할 센서 트레이에 위치를 나타냅니다. 실험 FAI 때문에 빈 위치를 확인L에는 센서가 포착되지 않은 경우.

1.4. 검토 실험

실수를 확인하고이를 수정로 돌아가 모든 계획 단계를 시각화.

1.5. 실험을 실행

데이터 파일의 위치를​​ 포함하여 필요한 세부 사항을 입력합니다. 실험에 원하는 온도를 입력합니다. 센서는 여전히 prewetting이 필요한 경우, 실험을 시작 지연하는 옵션을 선택합니다. 마지막으로, 한 번 모든 샘플 준비 (2 단계) 완료하고 샘플 플레이트와 센서 트레이 모두가 악기에로드, 분석을 실행하는 바로 가기 버튼을 클릭합니다.

2. 샘플 준비

1. 적절한 분석 버퍼를 준비합니다. (8.0에 첨가하여 pH를 조정할) - ((N-모르 폴리 노) 프로판 술폰산 3), 트리스 (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄), 50 mM의 KCl을 20mM의 ​​MOPS : 버퍼는도 3 및도 5에 도시 된 실험에 사용. BSA (소 혈청 알부민, 자유 지방산, 0.5 마련되어모든 분석 단계와 닐화 단백질 또는 센서 단백질의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 결합 파트너의 모든 희석에 대한 버퍼) 최종 ML ㎎ /.
2. (소개 참조) 적절한 농도로 분석 버퍼에 바이오틴 단백질 (ε)를 희석.
3. 분석 버퍼에 바인딩 파트너 (F ₁ (-ε)) (사용하는 농도의 범위에 대한 설명을 참조)의 희석을 준비합니다.
4. 그들의 보호 자당 코팅을 제거하기 위해 적어도 10 분 동안 스트렙 타비 딘 - 코팅 센서 Prewet. 센서 트레이에서 센서를 포함하는 랙을 제거하고 트레이에 배향 노치에 판의 한 구석 슬라이딩 트레이의 바닥에 96 - 웰 플레이트를 삽입합니다. 센서의 열을 사용하는 경우, 96 - 웰 플레이트의 열을 잘 당 분석 완충액 200 μl를 추가합니다. (슬롯 탭)를 올바른 방향으로 트레이 센서의 랙을 반환합니다.
5. 1 단계에서 프로그래밍하는 동안 할당 된, O 우물을 채우기그림 2에서와 같이 분석 버퍼 또는 적합한 단백질 희석와 F 샘플 플레이트. 그들은 광 신호의 노이즈를 일으킬 수, 거품을 도입하지 마십시오. (I) 비오틴 단백질 또는 (ⅱ) 결합 파트너 중 하나를 생략 하나 이상의 참조 우물을 포함합니다.
6. 악기의 문을 열고 무대의 슬롯에 삽입 된 트레이의 탭으로, 단계 (왼쪽)에 센서 트레이를 삽입합니다. 판 홀더 (오른쪽)에 샘플 플레이트를 삽입 한 판 홀더에 표시된대로 판은, 평평하고 올바른 방향으로 장착되어 있는지 확인합니다. 문을 닫고 데이터 수집 프로그램 (단계 1.5)에서 분석을 시작합니다.

3. 데이터 처리

1. 분석이 실행 된 후, 데이터 분석 소프트웨어를 열고 데이터를 포함하는 폴더를로드. 각 센서 (왼쪽) 단계별 처리 메뉴와 원시 운동 데이터를 확인하려면 "취소"탭을 클릭 (AH) 다른 색상을 할당 (참조그림 3).
2. "데이터 선택"에서 "센서 선택"버튼을 클릭합니다. "샘플 플레이트지도"에서 참조 우물로 1 또는 2 제어 센서 (G, 그림 3의 분석에서 H)에 대한 우물을 지정합니다. 처리 메뉴에서 "빼기"확인란을 선택하고 다른 모든 센서의 신호로부터 기준 신호 (단일 또는 평균)을 뺄​​ "참조 웰스"를 선택합니다.
3. "정렬 Y 축"단계를 사용하여 = 0 Y에 모든 흔적을 맞 춥니 다. 정렬 단계 (이것은 협회의 단계 전에 마지막 기준 인) 등의 "기준"을 선택합니다. "시간 범위"에 대한, 그 기준 (그림 3에서와 같이 60 초 기준에 대한 즉, 50 ~ 60 초)의 마지막 10 초를 입력합니다.
4. 협회와 해리 단계 사이의 신호 변화를 최소화하기 위해 "간 단계 보정"확인란을 선택합니다. 베이스 라인 또는 해리에 정렬을 선택합니다.
5. 대부분의 경우 Savitzky - 골 레이 필터링 기능을 선택하고 "프로세스 데이터를!" 진행합니다. 육안 검사최종 처리 된 데이터 (오른쪽 패널). 신호 트레이스는 협회와 해리 단계 사이에 상당한 변화를 표시하는 경우 (그림 4에서와 같이) 글로벌 데이터 분석을위한 분석과 함께, "간 단계의 보정"의 해리 또는 기준의 선택을 변경하고 데이터를 진행하기 전에 데이터를 다시 처리 분석.

4. 데이터 분석

시작하는 데이터 분석에서 "분석"탭을 클릭합니다. 참고 : 예를 들어 여러 바인딩 / 해리 곡선의 글로벌 분석 (그림 3에서와 같이)입니다 아래의 단계를 반복합니다.

1. "분석하는 단계"의 경우, 협회와 해리를 선택합니다. "모델"에 대해 1:1를 선택합니다. 참고 : 제한된 옵션을 사용할 수 있습니다.
2. "피팅"의 경우, (전체) 글로벌을 선택합니다. "별 그룹"에 대한 (그래프 등) 색상을 선택합니다. (R _최대의 독립적 인 피팅을 할 수 있도록 "센서가 연결되지 않은 R _최대"를 선택 파의 결합 포화에 따라 최대한의 신호 응답) 고정 된 단백질에 tner. 참고 : 센서는 고정 된 단백질의 양이 다소 다를로 우리는 (그림 3,로드 참조), 대부분의 분석에 대해이 작업을 수행합니다.
3. 표시된 테이블에서 분석 할 모든 센서 흔적 같은 색깔이있다, 그래서 그들은 글로벌 세트로 분석 될 것이라는 점을 확인한다. 필요한 경우, 하나 이상의 센서가 글로벌 피팅에서 생략 추적 선택 : "포함"열에서 원하는 센서 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "웰스 제외"를 선택합니다.
4. "적당한 곡선을!"클릭 비선형 회귀 분석을 시작합니다. (그림 4)를 센서 데이터 추적으로 회귀 곡선 (I) 오버레이, 피팅 잔차 (II) 플롯, 그리고 결정된 매개 변수 값 (속도 상수, R _최대로 (III) 테이블을 포함 피팅 결과를 검토, K _D) 및 통계 매개 변수 (표준 오차, 카이 제곱, R ^2).
5. "데이터 내보내기"에서 "내보내기 테이블에. CSV 파일"을 클릭하여 피팅 결과를 저장합니다. GRAP에 대한힝 또는 다른 소프트웨어와 데이터 / 장착 곡선의 추가 분석은 텍스트 파일의 각 센서의 데이터 및 장착 곡선을 저장하려면 "수출 피팅 결과"를 클릭합니다.

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결과

실시간 바인딩 및 해리 BLI의 반응 속도는 그림 3에 나와 있습니다. 이 실험은 협회와 해리의 분석 완충액으로 이루어졌다. 센서가 잠깐 동안 만 prewet했다 이후이 실험은 10 분 기준 단계를 시작했다. 다음으로, 비오틴 ε는 센서에로드했습니다. ε의 검출 가능한 해리은 바인딩 파트너가 추가되지 있었다 기준 곡선 (G)에서 본 나머지 모든 단계에 걸쳐 발생했습니다. 제 2 기준 센서 (H)가 ...

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토론

BLI에 대한 현재 사용 가능한 장비는 생체 분자의 상호 작용에 대한 분석에 상당한 처리량과 유연성을 허용합니다. 각종 용액 시료 블랙 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 분배하고, 병렬 BLI 센서 세트는 플레이트에 웰의 열 사이에서 앞뒤로 이동하도록 프로그램되어있다. 시료는 분석을 통해 궤도 흔들어 교반. 여기에 사용 된 시스템은 8 센서를 가지고 있으며, 96 웰 샘플 플레이트를 사용하지만...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available