טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

Abstract

להקפיא בר / להקפיא לחרוט מתאר תהליך שבו דגימות, בדרך כלל ביולוגי או nanomaterial בטבע, הם קפואים, שבר, ומשוכפל ליצירת פחמן / פלטינה "להפיל" המיועד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. דגימות נתונים לשיעורי הקפאת ultrarapid, לעתים קרובות בנוכחות סוכני cryoprotective להגביל היווצרות גבישי קרח, עם השבירה הבאה של הדגימה בחנקן נוזלי מקוררת טמפרטורות תחת ואקום גבוה. המשטח סדוק התוצאה משוכפל והתייצב על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מזווית שמקנה משטח פירוט תלת ממדי לשחקנים. טכניקה זו הוכיחה מאיר עיניים במיוחד לחקירה של קרום תא וההתמחויות שלהם ותרמה במידה ניכרת להבנה של צורה סלולרית לתפקוד תא קשור. בדוח זה, נסקור את דרישות המכשיר ופרוטוקול טכני לביצועהקפאה שבר, המינוח ומאפיינים של מטוסי שבר הקשורים, וריאציות על ההליך המקובל, וקריטריונים לפרשנות של תמונות להקפיא בר. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקירת ultrastructural בתחומים רבים של ביולוגיה של תא וטומנת בחובו הבטחה כטכניקת הדמיה המתעוררות למולקולרית, ננוטכנולוגיה, ולימודי מדע חומרים.

Introduction

הרעיון והיישום מעשי של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות הוצג על ידי ¹ סטיר יותר ממחצית לפני מאה שנה. המנגנון המוקדם ניכס רכיבים שונים ליחידה עצמאית עובדת ^1. המנגנון המקורי שונה ומעודן לתוך מכשירים זמינים באופן מסחרי במטרה לענות על הצורך הקריטי במניפולציה מרחוק, תחזוקה של ואקום גבוה, והאידוי של פחמן ומתכות כדי לייצר העתק מתאים לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1 ואיור 2).

המכשיר הטיפוסי מורכב של תא ואקום גבוה עם שולחן דגימה וזרוע microtome יש תפוקת חנקן נוזלית regulable (איור 1). התא כולל גם שני רובי אלקטרונים, אחד לייצוב אידוי פחמן ממוקם בזווית 90 מעלות לשלב דגימה והאחרת לPlatinum / פחמן הצללה בזווית מתכווננת, בדרך כלל 15º - 45º (איור 2). כוח ליחידה מוחל לתפעול משאבת הוואקום ולוחות אלקטרוניים לווסת שליטת התאמת הטמפרטורה ואלקטרון אקדח.

הגה במקור כאמצעי להשגת הדמיה משופרת של וירוסים, להקפיא-שבר זכה לפופולריות עוד יותר כטכניקה לבחינה והניתוח של קרום תא וההתמחויות שלהם ^{2, 3.} ואכן, הליך זה היה בלתי נפרד מהבהרת יחסי מבנה / תפקוד בתאים וברקמות ורבים מהמחקרים האלה עומדים כמו תרומות קלאסיות לביולוגיה מולקולרית של תא ^4-9. המטרה העיקרית והרציונל לפיתוח של טכניקת הקפאה-השבר היה להגביל חפצים נצפים ברזולוציה מיקרוסקופית אלקטרונים הנובעות מקיבעון כימי והעיבוד השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי קונבנציונלי. כאן המטרה היא להגביל כימיקיבעון ולהקפיא את הדגימה במהירות מספקת, ולעתים קרובות בנוכחות cryoprotectant כדי להגביל את היווצרות גבישי קרח וחפצי הקפאה אחרות. לאחרונה, בטכניקה זו מצאה התעוררות מחודשת של עניין מביולוגים מולקולריים וחוקרי מדע חומרים לבדיקה של חלקיקים וננו.

תמונות בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט מפגינות אופי תלת ממדים ולעתים טועים לmicrographs אלקטרונים הסורקים. עם זאת, הכנות להקפיא בר נבחנות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה והתרומה הגדולה שלהם ללימודים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה היא הייצוג הייחודי שלהם של אלמנטי מבנה / תפקוד של קרום תא. עיבוד בהקפאה שבר הוא ביוזמת הקפאת תאים ורקמות במהירות מספיקה כדי להגביל את התגבשות קרח ו / או בשימוש בסוכנים cryoprotectant כגון גליצרול. לאחר מכן הדגימות שבר תחת ואקום ונציגLica מופק על ידי אידוי של פחמן ופלטינה על פני השטח שהברים. הדגימה המקורית מתעכלת מההעתק שמאוחזר על רשת דגימת EM סטנדרטית. עוד פירוש מוטעה נפוץ של תמונות להקפיא בר הוא שהם מתארים משטחי תא. עם זאת ההנחה הבסיסית של הקפאה שבר היא שקרומים ביולוגיים מפוצלים דרך bilayer השומנים על ידי תהליך שבר (איור 3). תהליך בקרומים ביולוגיים זה מניב שני פרצופים שבר, אחד החושף את הארגון של מחצית מהקרום הסמוך אל הציטופלסמה,-PF הפנים, ואחד אשר חושף את מחצית עלון bimolecular של הקרום שנמצאה בסמוך לתאי הסביבה,-EF הפנים. משטחי תא אמיתיים אינם מיוצגים בתמונות להקפיא בר אך מופיעים רק כאשר הצעד שנוסף לאחר הקפאת תחריט ביצוע הליך שבר משמש. כדי לחרוט ביעילות דגימות שבר בעבר כדי לחשוף detai משטחl, דגימות חייבות להיות קפוא בקצב מהיר וללא unetchablecryoprotectant. תחריט של מים מפני השטח של הדגימה שבר חושפת תכונות הבסיסיות מושגת על ידי הצבת זרוע קירור microtome מעל הבמה דגימת יצירת ההפרש טמפרטורה בין השלב מחזיק את הדגימה וזרוע microtome הקירור אשר גורמת למים נשגבים מהמשטח. כאשר מים בסובלימציה מפני השטח של הדגימה שבר במהלך תמרון תחריט ההקפאה, אז היבטים של משטחים בפועל תא, מטריצת חוץ תאית, מבני cytoskeletal, והרכבות מולקולריות עשויים להתגלות ברזולוציה גבוהה. כך בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט אינן תנאים להחלפה, אלא משקף את תהליך צעד חכם האחרונה שבם לא עשוי להיות נחוץ או רצוי בהתאם לצרכים של מחקר המסוים.

בעקבות ההקפאה-הבר / להקפיא לחרוט נהלים, המשטחים הסדוקים חשופים לevapora המכווןtive שכבות של פחמן ופלטינה על מנת לספק תמיכה והדמיה ניגוד להעתק. אידוי ההדמיה / פחמן הפלטינה יכול להיות חד כיווני או סיבובי, והוא נעשה על ידי או התנגדות או רובי אלקטרונים. הצללה חד כיווני מזווית ידועה, בדרך כלל 30º - 45º, היא שימושית בביצוע חישובי morphometric מסוימים. דגימות שהיו נתונים לעמוקים תחריט בדרך כלל הן סיבוביות מוצל והתמונות כתוצאה של דגימות אלה מתהפכות photographically להערכה.

ההיסטורי, כמו גם מטרה הנוכחית של הקפאה שבר טכניקת ההקפאה לחרוט / היא להגביל קיבעון כימי ועיבוד דגימת ממצאים הקשורים ליותר נהלים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונליים. עם זאת, טכניקה זו מספקת יתרון מהותי ביכולתה להעניק פירוט תלת ממדים ובכך להקל על רכישה של נתונים morphometric במדע ביולוגי, חומר, וnדגימות anotechnology. נהלי ההקפאה שבר ולהקפיא לחרוט הם מורכבים ורבי פנים והיבטים מסוימים של היישום שלה מותאמים אישית. מצגת זו מציעה נוף סקר של התכונות העיקריות של התהליך והקורא מופנה לפרוטוקולים שפורסמו מקיפים ^{10, 11} על מנת לתת מענה לפרטים ולהתאמה אישי של התהליך לצרכי מחקר ספציפיים.

Protocol

.1 הכנת ביולוגית דוגמאות להקפאה-בר / הקפאה-לחרוט

1. השתמש בניסוח מקבע EM קונבנציונלי כגון 2% paraformaldehyde glutaraldehyde + 2% במאגר M 0.1 פוספט עבור שעה 1. לבצע קיבוע ראשוני של רקמות ביולוגיות. הערה: למרות שזה עשוי להיות רצוי להקפיא כמה סוגים של דגימות ללא קיבוע לפני, אמצעי זהירות הפתוגן דם נישא אוניברסלי מחייב קיבעון המתאים שבו הדגימה מורכבת מרקמה אנושית.
2. בעקבות קיבעון עיקרי, לשטוף את הדגימה באותו החיץ בתוספת 0.2 M סוכרוז לא יותר מ 1 שעות.
3. העבר את הדגימה לפתרון cryoprotectant המורכב מגליצרול 25% ב0.1 חיץ פוספט M לא יותר משעה 1.

.2 הקפאה ואחסון של דגימות מראש של הקפאה-שבר

1. ספחי דגימת זהב או נחושת בחרו בגודל מתאים ובצורה לדגימה בעיבוד (איור 4 ).
2. בעזרת מלקחיים כיתה קנס ו / או שברים קטנים עמדת מד קטנה מחטי מזרק של הדגימה בחלק העליון של בדל דגימת מתכת.
   1. להפחית את תכולת הנוזל של הדגימה לדביקה, מעט דבק כמו עקביות על ידי ציור את הנוזל מקצה הבדל עם נייר סינון.
   2. להעתקים יחידים, משתמש במחטי מזרק מד קטנות כדי ליצור תלולית של רקמה על הבדל. להעתקים כפולים, להפוך בדל ותפקיד אחר זה בדיוק מעל הבדל ולמקם בקלילות על פני השטח דגימת יצירת כריך (איור 5 א). אל תלחץ על הדגימה מבין שני הספחים.
3. מלא שני כלי דיואר מבודדים עם חנקן נוזלי. הערה: הכלי הראשון להכיל הודעה מתכת המכילה גם קטן המשמש להנזלת נפח קטן של גז פרופן מצילינדר זמין מסחרי (איור 5). הכלי השני הוא אחסון למחיצות / מחזיק כלי לקצרly שמירת דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי.
   1. השימוש בנחיר הגליל ממוקם בבאר פרופאן, לפתוח את שסתום הגליל ולאפשר גז לזרום לתוך הבאר של הכלי הראשון שבו הוא נוזל. הערה: זהירות !! PROPANE נפיץ, עלול לגרום להקפאת פציעה במגע, והוא ASPHYXIANT. השתמש פרופאן רק במנדף כימי מאושר לשימוש כזה מטפל גם להימנע ממקורות הצתה זרים, תוך שימוש בבגדי מגן מי טמפרטורות נמוכות, ושמירה על אוורור נאות.
   2. מהר ככל האפשר, לאסוף את דגימת הר עם מלקחיים כיתה משובחים ולנעוץ אותה בגז הנוזלי בכלי הראשון לכמה שניות ולאחר מכן להעביר במהירות לכלי מחזיק השני של חנקן נוזלי (איור 5).
   3. ברגע שהדגימות קפואות, חנות תחת חנקן נוזלי עד מוכן להעביר למפעל הקפאה שבר. העבר את הספחים למכל דיואר חנקן נוזלי אחסון גדול יותר עבור מורחבאחסון אם תרצה בכך, עם זאת יש להיזהר שלא לאפשר לספחים להפשיר.

.3 מבצע של ההקפאה-שבר כלי ודגימת עיבוד

1. טעינת דגימות על בעל פליז ולתוך התא
   1. טען את ספחי דגימת זהב לבעל דגימת העתק כפול חוברת סוג או לצבוט מכשיר תחת חנקן נוזלי ולשמור על קיים עד מוכן למצב בתא הדגימה (איור 6).
   2. כאשר התא השיג ואקום גבוה (כ -2 x 10 ^-6 mbar) והשלב כבר מקורר לטמפרטורה של חנקן נוזלי, לכבות את המשאבה, לפרוק הקאמרית, ומקם את ספחי דגימה רכובים על גבי שולחן הדגימה במהירות אפשרי .
   3. הפעל את המשאבה, להקים מחדש ואקום גבוה, ועושים שימוש בפקדי שלב וטמפרטורת זרוע אלקטרוניים כדי להתאים את טמפרטורת שולחן דגימה ל-100 ° C וחנקן נוזלי ישיר לזרוע microtome וbring אותו לטמפרטורה של חנקן נוזלי.
2. תהליך שבר
   1. על השגת ואקום גבוה, טמפרטורת שלב של -100 ºC וזרוע microtome בטמפרטורה של חנקן נוזלי, מרחוק לפתוח את בעל דגימת העתק הכפול ובכך שבירה הדגימות על mounts הדגימה (בהקפאה fracture_movie1.mov).
   2. במקרה של דגימות מיועדות לבר הבא תחריט, להשתמש בסכין גילוח נשמר במהדק על זרוע microtome לגלח (כלומר, שבר) את פני השטח של הדגימות במקום צעד 3.2.1 (בהקפאת etch_movie2.mov).
   3. אם צעד תחריט הקפאה נוסף הוא שיש לבצע, מקם את זרוע microtome המקורר מעל המשטחים הסדוקים לאחד למספר דקות. מים תמרון זה נשגב (כלומר, לחרוט) מהמשטח שבורה: הערה. ההשפעה של המהלך הזה היא לחשוף משטחים אמיתיים תא, מטריצת חוץ תאית, ו / או מכלולים מולקולריים על ידי סובלימציה של מים, בנוסף לfracture פרצופים עובר דרך bilayer השומנים של קרומים.
3. הצללת מתכת ואידוי תמיכת העתק באמצעות רובי אלקטרונים
   1. הפעל את אקדח פלטינה / אלקטרון פחמן או התנגדות ולאפשר לו להתאדות שכבה דקה (כ 2 ננומטר) של פלטינה / פחמן על פני השטח שברים מזווית של 30º - 45º. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות.
   2. הפעל את אלקטרון פחמן או אקדח התנגדות כמו בשלב 3.3.1 ולהתאדות שכבה דקה של פחמן אל פני השטח דגימה שבורים מישירות (90 מעלות) מעל לראש לתת תמיכה להעתק. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות.
4. שליפה של העתקים
   1. עם השלמת הצללת שכפול וייצוב פחמן, לכבות את משאבת הוואקום, לפרוק הקאמרית, ולהסיר את דגימת הר מהמכשיר.
   2. בעזרת זוג המלקחיים כיתה קנס להסיר כל בדל דגימת זהב מכפולחוברת העתק / מהדק ולאפשר להפשיר במשך כמה שניות לפני שמעדנים את הבדל על גבי משטח מים בצלחת מקום (איור 7). הערה: העתק פחמן / פלטינה המכיל חומר דגימה חסיד יצוף על פני המים.
   3. לתמרן את העתקים או באמצעות לולאת חוט דקה או רשת מיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונלית נחושת המוחזקת על ידי מלקחיים כיתה קנס והעברה לצלחת מקום אחר המכילה 5% dichromate נתרן ב50% חומצה גופרתית לאחד למספר שעות. הערה: אמבטיה זה מעכלת את חומר הדגימה ביולוגי בפועל מההעתק. אקונומיקה ביתית כוח מלא יכולה להחליף dichromate / פתרון החומצה גופרתי.
   4. כאשר העיכול יושלם, להעביר ההעתק בחזרה למשטח של מים נקי ולאחזור אל רשת במיקרוסקופ אלקטרונים נחושת סטנדרטית. (הערה: העתקים עשויות לפצל לחתיכות קטנות יותר במהלך עיכול אבל גם העתקים קטנים מאוד עשויים להכיל מידע משמעותי וצריכים להיות retrieved ובדק.) העתק חנות תמיכה רשתות בקופסות רשת זמינות המסחרית שבו הם יישארו יציבים במשך שנים עם טיפול עדין.

.4 Ultrastructural בחינת להקפיא בר / העתקים לחרוט

1. צפו בהעתקים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים במתח מאיץ בדרך כלל 50-80 ק.
2. להקליט תמונות רלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה.

תוצאות

הנחת היסוד המרכזית של פרשנות תמונת הקפאה שבר הוא שמטוסי שבר עוברים דרך bilayer השומנים של קרומים המקנים שני פרצופים שבר, שנקרא על ידי אמנה-PF הפנים (שבר פנים פלזמה) וEF פנים (שבר פנים תאיים) (איור 3). -PF הפנים הוא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לציטופלסמה של התא ו- EF ה?...

Discussion

בשנים שלאחר השקתו וזמינות מסחרית, הקפאה שבר / נהלים לחרוט נוצלו באופן נרחב לחקירות של מבנה קרום ביולוגי. ואכן, נקודות המבט הטובות ביותר של חלק מההתמחויות המבניות של קרומים התקבלו בהכנות להקפיא בר / לחרוט. מחקרים אלה לא רק תרמו להבנה של המבנה הארגוני של ממברנות אלא גם ס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.