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요약

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

초록

자연 표본, 일반적으로 생물 또는 나노 재료, 골절, 냉동 및 탄소 / 백금 "캐스팅"투과 전자 현미경에 의한 검사 대상을 생성하기 위해 복제된다 동결 골절 / 동결 에칭 프로세스에 대해 설명합니다. 시료는 액체 질소가 고 진공 하에서 냉각 온도에서 시편의 후속 파쇄와 종종 얼음 결정의 형성을 제한하는 cryoprotective 에이전트의 존재 ultrarapid 동결 속도로 실시된다. 결과 절단면 복제 및 캐스트에 표면을 세 차원 세부 사항을 부여 각도에서 탄소와 백금의 증발에 의해 안정화된다. 이 기술은 세포막과 전문 분야의 조사를 위해 특히 계몽 입증했다 및 관련 세포의 기능을 세포 형태의 이해에 크게 기여하고있다. 이 보고서에서 우리는 수행하기위한 장비 요구 사항 및 기술적 프로토콜을 조사동결 골절, 관련 용어 및 파괴 평면의 특성, 동결 골절 이미지의 해석에 대한 기존의 절차에 대한 변화 및 ​​기준. 이 기술은 널리 세포 생물학의 많은 지역에서 미세 구조 조사에 사용되는 분자, 나노 기술에 대한 새로운 이미징 기술 등의 약속을 보유하고, 재료 과학 연구되고있다.

서문

개념 및 생물학적 시료의 동결 골절 처리의 실용적인 응용 프로그램은 한 세기 전 반 이상 스티어 (1)에 의해 소개되었다. 초기 장치는 작업 자체에 포함 된 유닛 하나에 서로 다른 구성 요소를 충당. 원래 장치는 개질 및 원격 조작, 고진공의 유지를위한 중요한 요구를 수용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 기기로 정제하고, 탄소 및 금속의 증발은 투과형 전자 현미경 (도 1 및도 검진 적합한 복제본을 생성시켰다 2).

전형적인 장비는 시료 테이블과 마이크로톰 팔 regulable 액체 질소 처리량을 갖는 (그림 1)과 높은 진공 챔버로 구성되어 있습니다. 챔버는 또한 시료 스테이지 90 ° 각도 plati위한 다른 위치에서 탄소 증발을 안정화 개의 전자총 번을 수납45 ° (그림 2) - 각도 조절, 일반적으로 15 °에 그림자 NUM / 탄소. 장치의 전원이 진공 펌프를 작동하기 위해 적용되며, 전자는 패널 온도 조정 및 전자총 제어를 조절한다.

원래 시험 및 세포막의 분석 및 그들의 전문이, 3 기술로서 더욱 인기를 얻고 골절 동결 바이러스의 개선 된 이미징을 달성하기위한 수단으로 생각. 사실,이 절차는 세포와 조직과 이러한 연구의 대부분은 세포 및 분자 생물학 4-9 고전적인 기여로 서의 구조 / 기능의 관계를 해명에 통합되었습니다. 동결 골절 기술의 개발을위한 주요 목표와 이론적 근거는 종래 생물학적 전자 현미경에 사용되는 화학 물질과 정착 처리에서 도출 전자 현미경 관찰 아티팩트 해상도를 제한하는 것이었다. 여기서의 목표는 화학을 제한하는 것정착 충분한 속도로 자주 얼음 결정 생성 등의 동결 아티팩트를 제한하기 위해서 동결 방지제의 존재 하에서 시험편을 동결하고. 최근,이 기술은 나노 입자와 나노 물질의 검사를위한 분자 생물학 및 재료 과학 연구자들의 관심의 부활을 발견했다.

골절을 동결하고 동결 에칭 이미지 입체 문자를 나타내고 때로 주사 전자 현미경으로 오인한다. 그러나, 동결 골절 제제는 투과 전자 현미경에 의해 검사하는 것으로 고해상도 형태 학적 연구에 큰 기여들은 세포막의 구조 / 기능 요소의 독특한 표현이다. 냉동 처리는 골절 및 / 또는 글리세롤과 같은 동결 방지제 처리제를 이용하여 얼음 결정을 제한하기에 충분한 속도로 세포와 조직을 동결에 의해 개시된다. 표본은 다음 진공 및 담당자 파단 아르리카는 골절 표면에 탄소와 백금의 증발에 의해 생성된다. 원래 시편은 표준 EM 표본 그리드에 검색되는 복제본에서 소화된다. 동결 골절 화상의 또 다른 일반적인 오해들은 세포 표면을 묘사한다는 것이다. 동결 골절의 기본 전제는 생체막가 파괴 과정 (그림 3)에 의해 지질 이중층을 통해 분할된다는 것입니다 그러나. 생체막에이 과정이 골절면, 세포에 인접한 막의 이분자 전단지의 절반을 계시 세포질, PF-면에 인접 멤브레인의 절반의 구성을 보여준다 하나, 하나를 얻을 적 환경, EF-얼굴입니다. 트루 세포 표면 동결 골절 이미지로 표현했지만 파괴 절차에 따라 동결 에칭 이후 추가 단계가 사용되는 경우에만 표시되지 않는다. 효과적으로 표면 detai을 공개하는 이전 파단 시험편을 에칭하기 위해서는리터는 표본은 빠른 속도와 unetchablecryoprotectant없이 고정해야합니다. 기본 기능을 드러내는 골절 시험편의 표면으로부터 물의 에칭 시험편 채 상기 스테이지 사이의 온도 차이를 생성 시험편 스테이지 위에 냉각 마이크로톰 아암과 표면으로부터 승화 물을 일으키는 냉각 마이크로톰 아암을 위치시킴으로써 달성된다. 물이 동결 에칭 기동 중에 골절 시험편의 표면으로부터 승화 될 경우, 실제의 세포 표면, 세포 외 기질, 세포 골격 구조, 분자 어셈블리의 양태는 높은 해상도로 밝혀 질 수있다. 따라서 동결 골절 및 에칭을 정지하면 교체 규정하지 않지만 오히려 후자는 어느 특정 연구의 요구에 따라 필요하거나 바람직하지 않을 단계별 과정을 반영한다.

골절 다음 동결 / 동결 에칭 절차, 파 단면이 지시 evapora을 실시복제에 대한 지원과 영상 대조를 제공하기 위해 탄소와 백금의 코트를 포지티브,. 백금 / 탄소 촬상 증발 단방향 또는 회전 될 수 있고, 저항 또는 전자총 중 하나에 의해 달성된다. 알려진 각도, 일반적으로 30 °에서 단방향 그림자 - 45 °는 특정 형태 계측 학적 계산을 수행하기에 유용하다. 깊은 에칭 대상이 된 표본은 일반적으로 그림자가 회전하고이 표본의 결과 이​​미지는 사진으로 평가를 위해 반전된다.

과거뿐만 아니라 동결 골절 / 동결 에칭 기술의 본 목적은 종래보다 투과 전자 현미경 절차와 관련된 아티팩트 시험편 화학 고정 및 처리를 제한 할 수있다. 그러나,이 기술 및 N, 입체 내용을 부여함으로써 생물학적 물질 과학에서 형태 계측 데이터의 수집을 용이하게하는 기능에 실질적인 이점을 제공한다anotechnology 표본. 골절 동결 및 동결 에칭 절차는 복잡하고 다면적이며, 그 응용 프로그램의 일부 측면은 사용자 정의됩니다. 이 프레젠테이션 방법의 주요 특징의 조사 뷰를 제공하며, 리더가 특정 요구에 대한 연구 과정을 상세 해결하고 정의하기 위해 광범위한 프로토콜 번역 10, 11로 지칭된다.

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프로토콜

동결 골절 / 냉동 에칭을위한 생물 표본의 1 준비

  1. 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 기존의 EM 고정 제 제제와 같은 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) + 2 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 생체 조직의 기본 고정을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 전에 고정하지 않고 표본의 몇 가지 유형을 동결하는 것이 바람직 할 수 있지만, 보편적 인 혈액 매개 병원균주의 시편은 인간의 조직으로 구성되어 적절한 고정을 의무화.
  2. 기본 고정에 따라, 더 이상 하나 이상의 시간 동안 0.2 M 자당으로 보충 같은 버퍼에 시편을 씻어.
  3. 1 시간보다 더 0.1 M 인산염 완충액에서 25 % 글리세롤로 이루어진 동결 방지제 용액에 시편을 전송.

동결 골절에 앞서 2 냉동 및 검체의 보관

  1. 적절한 크기와 시편 형상의 선택 금 또는 구리 시편 스텁이 처리되고 (그림 4 ).
  2. 미세 등급 겸자 및 / 또는 금속 시편 스텁 위에 시험편의 작은 게이지 주사기 바늘 위치 작은 조각을 사용.
    1. , 스티커로 시험편의 액체 함량을 감소 약간 여과지와 스터브의 가장자리에서 액체를 그려서 일관성 같은 접착제.
    2. 단일 복제본 스텁에 조직의 마운드를 만드는 작은 게이지 주사기 바늘을 사용합니다. 이중 복제본 들어, 정확하게 스텁 위에 다른 스터브와 위치를 반전하고 샌드위치 (도 5a)을 생성 시험편 표면에 가볍게 놓는다. 이 스텁 사이에서 밖으로 표본을 누르지 마십시오.
  3. 액체 질소와이 절연 듀어 혈관을 입력합니다. 주 : 제 용기는 시판 실린더 (도 5b)에서 프로판 가스의 작은 부피를 액화하는 데 사용되는 작은 잘 함유 금속 포스트를 수용한다. 두 번째 선박에 대한 간단한 선박을 들고 / 파티션 스토리지입니다만민은 액체 질소에서 냉동 표본을 유지.
    1. 프로판 웰에 위치하는 실린더 노즐을 사용하여, 실린더 밸브를 열고 가스가 액화되는 제 용기에 잘 흐르게. 참고 :주의! 프로판은 접촉시 부상을 동결 초래할 수 있습니다, 폭발하고, 질식입니다. 그러한 사용은 낮은 온도에 대한 보호 의복을 사용하여, 또한 외부 점화원을 피하기 위해주의하면서 적절한 환기를 유지하기위한 인증 화학 후드에서 프로판을 사용합니다.
    2. 가능한 한 빨리, 시편은 미세 학년 집게 마운트하고 신속하게 액체 질소의 제 2 유지 용기 (그림 5B)로 전송 몇 초 동안 첫 번째 용기에 액화 가스로 뛰어 픽업.
    3. 표본이 고정되면, 준비가 될 때까지 액체 질소에서 저장소는 동결 골절 공장으로 전송합니다. 확장을 위해 큰 저장 액체 질소 듀어 병 컨테이너 스텁을 전송원하는 경우,하지만 상관 저장 스텁 해동 허용하지 않도록주의해야한다.

동결 골절의 3 조작 기기 및 시료 처리

  1. 황동 홀더와 챔버로 표본을로드
    1. 책자 형 더블 복제 시편 홀더에 금 표본 스텁을로드 또는 액체 질소 하에서 장치를 고정하고 시료 챔버 (그림 6)에 배치 할 준비가있을 때까지 유지한다.
    2. 챔버는 높은 진공 (약 2 × 10-6 밀리바)를 달성하고 스테이지 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄지 챔버를 배기하고, 가능한 한 신속하게 시료 테이블 상에 탑재 된 시료 스텁 위치 .
    3. 펌프를 켜고 고진공을 다시하고 마이크로톰 팔과 BRI에 표본 테이블 -100 ° C로 온도와 직접 액체 질소를 조정하는 전자 무대와 팔 온도 컨트롤을 사용하여액체 질소 온도로 겨.
  2. 파괴 과정
    1. 액체 질소 온도에서 고진공, -100 ºC의 스테이지 온도 마이크로톰 아암을 달성하면, 원격으로하여 시편 마운트에 시험편을 파쇄 이중 복제본 시편 홀더를 열고 (동결을 fracture_movie1.mov).
    2. 에칭 다음 골절위한 시편의 경우, 면도 마이크로톰 아암에 클램프 유지 면도날을 사용하여 (즉, 파단) 단계 3.2.1 대신 시험편의 표면 (동결을 etch_movie2.mov).
    3. 추가 동결 에칭 공정이 수행 될 경우, 몇 분에 하나 파 단면 위에 냉각 마이크로톰 아암 위치. 참고 : 절단면의이 작전은 승화 (즉, 에칭) 물입니다. 이 기동의 효과는 FRA에 더하여, 물의 승화 진정한 세포 표면, 세포 외 기질, 및 / 또는 분자 어셈블리를 공개하는 것이다가능한 화상은 세포막의 지질 이중층을 통과 직면 해있다.
  3. 금속 음영 및 복제 지원 증발 전자총을 사용
    1. 백금 / 탄소 전자 또는 저항 총을 활성화하고 30 °의 각도에서 골절 표면에 백금 / 탄소의 얇은 층 (약 2 nm의) 증발 할 수 있도록 - 45 °. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다.
    2. 단계 3.3.1에서와 같이 탄소 또는 전자 총 저항을 활성화하고 복제본에 지원을 제공하기 위해 직접적으로 부하 (90도)에서 프랙 시험편 표면에 탄소 박막을 증발. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다.
  4. 복제본의 검색
    1. 복제 음영 탄소 안정화 완료되면, 진공 펌프를 해제 벤트 챔버와 시료가 탑재 기기로부터 제거한다.
    2. 미세 등급 포셉 쌍을 사용하여 이중에서 각 금 시험편 스텁을 제거복제 책자 / 클램프 조심스럽게 자리 플레이트 (그림 7)에 물 표면에 스텁을 낮추는 전에 몇 초 동안 해동 할 수 있습니다. NOTE : 물 표면에 뜬다 접착 시험편 재료를 함유 탄소 / 백금 복제본.
    3. 미세 와이어 루프 또는 미세 등급 집게 몇 시간에 한 50 % 황산에서 5 % 중크롬산 나트륨을 함유하는 다른 스폿 판에 전사에 의해 유지 종래의 구리 전자 현미경 그리드를 사용 복제본 책략. 참고 :이 화장실은 복제본에서 실제 생물 표본 자료를 소화. 전체 강도 가정용 표백제는 중크롬산 염 / 황산 용액 대신 할 수있다.
    4. 소화가 완료되면, 깨끗한 물 표면으로 다시 복제본을 전송 및 표준 구리 전자 현미경 격자 상으로 검색한다. (참고 : 복제본 소화하는 동안 작은 조각으로 조각 낼 수 있지만, 심지어 아주 작은 복제본 상당한 정보를 포함 할 수 있으며, RETR해야ieved 및 검사.)가 부드러운 핸들링 년 동안 안정적으로 유지 될 것입니다 시중에서 판매하는 그리드 상자에 그리드를 지원하는 저장 복제.

동결 골절 / 에칭 복제본의 4 현미경 적 검사

  1. 80 kV의 - 일반적으로 50 내지 가속 전압에서의 투과형 전자 현미경의 레플리카보기.
  2. 표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라와 함께 관련 이미지를 기록한다.

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결과

동결 골절 화상 해석의 핵심 전제는 골절면이 규칙 PF - 얼굴 (플라즈마 골절면)와 EF-얼굴 (세포 외 골절면) (그림에 의해 호출이 골절의 얼굴을 부여하는 세포막의 지질 이중층을 통과한다는 것입니다 3). PF-얼굴 셀 EF-얼굴의 세포질에 인접 멤브레인 지질 이중층의 절반 엑스트라 셀룰러 인접 세포막 지질 이중층의 절반이다. 동결 골절 기술은 막 구조물의 조사에 특히 유?...

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토론

도입 및 상용화 다음 몇 년 동안, 동결 골절 / 에칭 과정은 널리 생물학적 막 구조의 연구에 활용 하였다. 실제로, 막 구조 전문의 일부 가장 관점 동결 골절 / 에칭 제제로 얻어졌다. 이러한 연구뿐만 아니라 세포막의 구조적 조직의 이해에 기여뿐만 아니라 구조와 기능이 관련되는 방법에 대한 통찰력을 제공했다.

루틴 생​​물학적 전자 현미경의 출현은 생물학적 시료에 ?...

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공개

The author has nothing to disclose.

감사의 말

This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plantBalzersBAF400T
Standard buffersvarious suppliers
Standard aldehyde fixativesvarious suppliers
Sodium dichromatevarious suppliers
Sulfuric acidvarious suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon EvaporationTechnotrade International
Liquid nitrogenvarious suppliers
Propanevarious suppliers
Disposable supplies for electron microscopyElectron Microscopy Sciences
Transmission electron microscopeCarl Zeiss Inc.

참고문헌

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