Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Riepilogo

Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l'esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l'ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici.

Abstract

Freeze-frattura / freeze-etch descrive un processo in cui i campioni, in genere biologici o nanomateriali in natura, sono congelati, fratturato, e replicato per generare un carbonio / platino "cast" destinato ad esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. I campioni vengono sottoposti a tassi di congelamento ultrarapido, spesso in presenza di agenti crioprotettivi di limitare la formazione di cristalli di ghiaccio, con conseguente frattura del campione in azoto liquido raffreddato a temperature sotto alto vuoto. La superficie fratturata risultante viene replicato e stabilizzato mediante evaporazione di carbonio e platino da un angolo che conferisce dettaglio superficie tridimensionale al cast. Questa tecnica si è rivelata particolarmente illuminante per lo studio delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni ed ha contribuito notevolmente alla comprensione della forma cellulare per la funzione delle cellule correlate. In questo rapporto, passiamo in rassegna i requisiti dello strumento e protocollo tecnico per l'esecuzione dicongelamento-frattura, la nomenclatura e le caratteristiche dei piani di frattura associata, variazioni sul procedimento tradizionale, e criteri per l'interpretazione delle immagini freeze-frattura. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per le indagini ultrastrutturali in molti settori della biologia cellulare e detiene promessa come una tecnica di imaging emergente per molecolare, le nanotecnologie, e studi di scienza dei materiali.

Introduzione

Il concetto e l'applicazione pratica del trattamento di congelamento-frattura di campioni biologici è stato introdotto da Steere ¹ più di mezzo secolo fa. L'apparato presto stanziati componenti disparati in un self-contained unità di lavoro ^1. Apparecchiatura originale è stato modificato e raffinato in strumenti disponibili in commercio per ospitare la necessità critica per la manipolazione a distanza, manutenzione di alto vuoto, e l'evaporazione di carbonio e metalli per produrre una replica adatto per l'esame al microscopio elettronico a trasmissione (Figura 1 e Figura 2).

Lo strumento tipico è composto da una camera a vuoto elevato con tavolo campione e braccio microtomo avente regolabili throughput azoto liquido (Figura 1). La camera ospita anche due cannoni elettronici, uno per stabilizzare evaporazione carbonio posizionato ad un angolo di 90 ° rispetto alla fase del campione e l'altro per Platinum / carbonio shadowing ad angolo regolabile, tipicamente 15 ° - 45 ° (Figura 2). Alimentazione dell'unità viene applicato per azionare la pompa del vuoto e pannelli elettronici a regolare la regolazione della temperatura e di elettroni controllo delle armi.

Originariamente concepito come un mezzo per conseguire una migliore imaging virus, congelamento-frattura guadagnato sempre più popolarità come una tecnica per l'esame e l'analisi delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni ^{2, 3.} Infatti, questa procedura è stata parte integrante chiarire le relazioni struttura / funzione di cellule e tessuti e molti di questi studi si distinguono come i contributi classici di biologia cellulare e molecolare ^4-9. L'obiettivo principale e razionale per lo sviluppo della tecnica di congelamento-frattura era di limitare gli artefatti osservabili al microscopio elettronico a risoluzione derivante dalla fissazione chimica e lavorazione utilizzati in microscopia elettronica convenzionale biologica. Qui l'obiettivo è quello di limitare chimicafissazione e di congelare il campione con velocità sufficiente e spesso in presenza di un crioprotettore per limitare la formazione di cristalli di ghiaccio e altri artefatti congelamento. Più di recente, questa tecnica ha trovato una rinascita di interesse da biologi molecolari e gli investigatori scienza dei materiali per l'esame di nanoparticelle e nanomateriali.

Immagini Freeze-frattura e congelare-etch presentano un carattere tridimensionale e, a volte sono scambiati per microscopio elettronico a scansione. Tuttavia, i preparativi freeze-fratture sono esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione e il loro importante contributo agli studi morfologici ad alta risoluzione è la loro rappresentazione unica di elementi struttura / funzione delle membrane cellulari. Trasformazione Freeze-frattura è disposta dal congelamento cellule e tessuti con velocità sufficiente a limitare la cristallizzazione del ghiaccio e / o con l'uso di agenti crioprotettori come il glicerolo. I campioni vengono poi fratturate sotto vuoto e un rappresentantelica è generato per evaporazione di carbonio e platino sulla superficie fratturata. Il campione originale viene digerito dalla replica che viene recuperato su una griglia esemplare di serie EM. Un altro errore di interpretazione comune delle immagini freeze-frattura è che essi rappresentano superfici cellulari. Tuttavia la premessa di base di congelamento-frattura è che le membrane biologiche sono divise attraverso il doppio strato lipidico dal processo di frattura (Figura 3). Questo processo in membrane biologiche produce due facce di frattura, uno che rivela l'organizzazione della metà della membrana adiacente al citoplasma, il PF-faccia, e uno che rivela la metà del foglio bimolecolare della membrana che è adiacente alla extracellulare milieu, l'EF-faccia. Superficie delle cellule veri non sono rappresentati nelle immagini freeze-frattura, ma appaiono solo quando si utilizza la successiva fase di aggiunta di freeze-etching seguendo la procedura di frattura. Al fine di incidere efficacemente campioni preventivamente fratturate per rivelare detai di superficiel, i campioni devono essere congelati a un ritmo rapido e senza unetchablecryoprotectant. Incisione di acqua dalla superficie del campione fratturati rivelano caratteristiche sottostanti si ottiene posizionando il braccio microtomo raffreddamento sul tavolino portaoggetti creando un differenziale di temperatura tra la fase che tiene il campione e il braccio microtomo raffreddamento che provoca l'acqua a sublimare dalla superficie. Quando l'acqua viene sublimata dalla superficie del campione fratturati durante la manovra di congelazione incisione, poi aspetti di superfici reali cellulari, matrice extracellulare, strutture del citoscheletro e assiemi molecolari possono essere rivelate ad alta risoluzione. Così freeze-frattura e congelare-etch non sono termini intercambiabili, ma piuttosto riflettono un processo graduale l'ultima delle quali può non essere necessario o desiderabile a seconda delle esigenze del particolare studio.

Dopo il congelamento-frattura / freeze-etch procedure, le superfici fratturate sono sottoposti a evaporazione direttitiva mani di carbonio e di platino, al fine di fornire sostegno e di imaging contrasto alla replica. Il / carbonio di imaging evaporazione platino può essere unidirezionale o rotativo, ed è compiuta da una resistenza o cannoni elettronici. Shadowing unidirezionale da un angolo noto, tipicamente 30 ° - 45 °, è utile per eseguire alcuni calcoli morfometrici. I campioni che sono stati sottoposti a profonda incisione in genere sono a rotazione in ombra e le immagini risultanti di questi esemplari sono fotograficamente invertiti per la valutazione.

Lo storico così come un attuale obiettivo del / tecnica di congelamento-frattura freeze-etch è quello di limitare la fissazione e la trasformazione chimica dei campioni artefatti che sono associati con più procedure di microscopia elettronica a trasmissione convenzionale. Tuttavia, questa tecnica fornisce un vantaggio sostanziale nella sua capacità di conferire dettaglio tridimensionale e quindi facilitare l'acquisizione dei dati morfometrici in biologico, scienza dei materiali, e nesemplari anotechnology. Procedure di congelamento-frattura e congelare-etch sono complessi e multi-sfaccettato e alcuni aspetti della sua applicazione sono personalizzati. Questa presentazione offre una vista panoramica delle principali caratteristiche del processo e si rimanda il lettore alla completa protocolli pubblicati ^{10, 11} al fine di affrontare i dettagli e personalizzare il processo per le esigenze di ricerca specifiche.

Protocollo

1 Preparazione di campioni biologici per congelamento-frattura / Fermo-etch

1. Utilizzare un convenzionale EM formulazione fissazione quale il 2% glutaraldeide + 2% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora. effettuare fissazione primaria di tessuti biologici. NOTA: Mentre può essere opportuno congelare alcuni tipi di campioni senza fissazione preventiva, ematica precauzioni universali patogeni impongono la fissazione del caso in cui il campione è costituito da tessuto umano.
2. A seguito di fissazione primaria, sciacquare il campione nello stesso tampone integrato con 0,2 M di saccarosio per non più di 1 ora.
3. Trasferire il campione di una soluzione crioprotettore composta per il 25% glicerolo in tampone fosfato 0,1 M per non più di 1 ora.

2 Congelamento e conservazione dei campioni In Anticipo di Freeze-frattura

1. Selezionare campione di oro o di rame mozziconi di forma e dimensione per il campione adeguato in fase di elaborazione (Figura 4 ).
2. Utilizzando una pinza grado fini e / o calibro piccolo posizione siringa aghi piccoli frammenti del campione sulla parte superiore di uno stub provino metallico.
   1. Ridurre il contenuto liquido del campione ad un appiccicoso, incollare un po 'come la coerenza attingendo il liquido dal bordo dello stub con carta da filtro.
   2. Per le singole repliche, utilizzare piccoli aghi siringa calibro di creare un tumulo di tessuto sulla stub. Per il doppio repliche, invertire un altro stub e posizionarlo esattamente sopra lo stub e posizionare delicatamente sulla superficie del campione creando un sandwich (Figura 5A). Non premere il campione di tra i due stub.
3. Riempire due vasi Dewar isolati con azoto liquido. NOTA: La prima nave ospita un palo metallico contenente un pozzetto che viene usato per liquefare un piccolo volume di gas propano da un cilindro disponibile in commercio (Figura 5B). Il secondo vaso è uno storage partizionato / contenitore di accumulo per brevely mantenendo campioni congelati in azoto liquido.
   1. Usando l'ugello cilindro posizionato nel pozzo propano, aprire la valvola della bombola e lasciare il gas di fluire nel pozzo della nave dove si liquefare. NOTA: ATTENZIONE !! PROPANO è esplosiva, PUO 'CAUSARE CONGELAMENTO LESIONI AL CONTATTO, E' UN asfissiante. Utilizzare propano solo in una cappa chimica certificato per tale uso facendo attenzione anche per evitare fonti di ignizione estranee, utilizzando indumenti protettivi contro le basse temperature, e il mantenimento di una ventilazione adeguata.
   2. Nel più breve tempo possibile, raccogliere il campione di montaggio con una pinza grado fini e immergerlo nel gas liquefatto nel primo vaso per alcuni secondi poi trasferire rapidamente alla seconda nave in possesso di azoto liquido (Figura 5B).
   3. Una volta che i campioni sono congelati, conservare in azoto liquido fino al momento di trasferire all'impianto di congelamento-frattura. Trasferire il stub di una memoria più grande azoto liquido contenitore Dewar per estesostoccaggio se lo si desidera, tuttavia occorre prestare attenzione a non permettere la stub per scongelare.

3 Funzionamento del Gelo-frattura strumenti e campioni di elaborazione

1. Caricamento campioni sul supporto ottone e nella camera
   1. Caricare i campioni d'oro stub in un opuscolo di tipo portacampioni doppia replica o morsetto dispositivo in azoto liquido e mantenere lì fino al momento di posizionare nella camera del campione (figura 6).
   2. Quando la camera ha raggiunto alto vuoto (circa 2 x 10 ^-6 mbar) e il passaggio è stato raffreddato alla temperatura dell'azoto liquido, spegnere la pompa, sfiatare la camera, e posizionare il provino mozzi montati sul tavolo campione più rapidamente possibile .
   3. Accendere la pompa, ristabilire alto vuoto, e utilizzare stadio e temperatura braccio controlli elettronici per regolare la temperatura tabella campione a -100 ° C e azoto liquido diretto al braccio microtomo e bring alla temperatura dell'azoto liquido.
2. Il processo di frattura
   1. Al raggiungimento di alto vuoto, una temperatura di -100 ° C palcoscenico e del braccio microtomo alla temperatura dell'azoto liquido, aprire a distanza il titolare doppia replica esemplare fratturazione in tal modo gli esemplari sui monti campione (freeze-fracture_movie1.mov).
   2. Nel caso di campioni destinati ad incisione seguente frattura, utilizzare una lama di rasoio mantenuto in una morsa sul braccio microtomo radere (cioè, frattura) la superficie dei campioni in luogo di passaggio 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov).
   3. Se il passo-freeze etching aggiunto deve essere eseguita, posizionare il braccio microtomo raffreddato sulle superfici fratturate per uno a parecchi minuti. NOTA: Questa manovra sublimare (cioè, etch) l'acqua dalla superficie fratturata. L'effetto di tale manovra è quello di rivelare i veri superfici cellulari, matrice extracellulare e / o assemblaggi molecolari per sublimazione di acqua, oltre a fracture facce passando attraverso il doppio strato lipidico delle membrane.
3. Shadowing in metallo e supporto replica evaporazione con cannoni elettronici
   1. Attivare il platino / elettrone carbonio o la resistenza della pistola e farlo evaporare uno strato sottile (circa 2 nm) di platino / carbonio sulla superficie fratturata da un angolo di 30 ° - 45 °. Ciò richiede in genere circa 15-20 sec.
   2. Attivare l'elettrone carbonio o la resistenza della pistola come al punto 3.3.1 e far evaporare un sottile strato di carbonio alla superficie del campione fratturata direttamente dall'alto (90 °) per dare sostegno alla replica. Ciò richiede in genere circa 15-20 sec.
4. Recupero di repliche
   1. Al termine di shadowing replica e la stabilizzazione di carbonio, spegnere la pompa del vuoto, ventilare la camera, e rimuovere il campione montare dallo strumento.
   2. Usando un paio di pinze grado fini rimuovere ogni stub oro esemplare dal doppioreplica libretto / morsetto e lasciare scongelare per alcuni secondi prima di abbassare delicatamente lo stub su una superficie di acqua in un posto piatto (Figura 7). NOTA: La replica di carbonio / platino contenente materiale campione aderente galleggia sulla superficie dell'acqua.
   3. Manovra le repliche utilizzando sia un loop di filo sottile o una griglia microscopio elettronico rame convenzionale tenuto da una pinza qualità fine e il trasferimento ad un altro posto piatto contenente il 5% di bicromato di sodio in 50% di acido solforico per uno per diverse ore. NOTA: Questo bagno digerisce il materiale reale del campione biologico dalla replica. Forza completa candeggina può essere sostituito per l'/ soluzione di bicromato di acido solforico.
   4. Quando la digestione è completa, trasferire la replica di nuovo ad una superficie d'acqua pulita e recuperare su una griglia di microscopia elettronica standard di rame. (NOTA: repliche può frammentarsi in pezzi più piccoli durante la digestione, ma anche molto piccole repliche può contenere informazioni sostanziali e dovrebbe essere retrieved ed esaminato.) Conservare replica sostenendo griglie in scatole di griglia in commercio dove rimarranno stabili per anni con un trattamento delicato.

4 Esame ultrastrutturale di Freeze-frattura / repliche etch

1. Vedi repliche in un microscopio elettronico a trasmissione ad una tensione di accelerazione tipicamente 50-80 kV.
2. Registrare le immagini rilevanti su pellicola TEM standard o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione.

Risultati

La premessa fondamentale di congelamento-frattura immagine interpretazione è che i piani di frattura passano attraverso il doppio strato lipidico delle membrane che conferiscono due facce di frattura, chiamato per convenzione il PF-faccia (plasma frattura-face) e EF-faccia (extracellulare frattura-face) (Figura 3). Il PF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al citoplasma della cellula e EF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al mezzo extracellulare...

Discussione

Negli anni successivi alla sua introduzione e la disponibilità commerciale, congelamento-frattura / procedure etch sono stati ampiamente utilizzati per le indagini di struttura della membrana biologica. Infatti, le migliori prospettive di alcune delle specializzazioni strutturali delle membrane sono state ottenute in preparati congelamento-frattura / etch. Questi studi non solo hanno contribuito alla comprensione della organizzazione strutturale delle membrane, ma anche fornito intuizioni su come la struttura e la funz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.