Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Resumo

São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.

Resumo

Freeze-fratura / congelar-etch descreve um processo pelo qual as amostras, normalmente biológica ou nanomaterial na natureza, são congelados, fraturado, e replicado para gerar um carbono / platina "cast" destina-se a exame de microscopia eletrônica de transmissão. As amostras são sujeitas a taxas de congelamento ultra-rápidos, muitas vezes na presença de agentes crioprotectores para limitar a formação de cristais de gelo, com subsequente fractura da amostra em azoto líquido temperaturas arrefeceu-se sob alto vácuo. A superfície de fractura resultante é replicado e estabilizado por meio de evaporação de carbono e platina a partir de um ângulo que confere a superfície pormenor tridimensional para o fundido. Esta técnica tem se mostrado particularmente esclarecedor para a investigação das membranas celulares e suas especializações e contribuiu consideravelmente para a compreensão da forma celular para a função das células relacionadas. Neste relatório, examinamos as exigências do instrumento e protocolo técnico para a realização decongelar-fratura, a nomenclatura e as características dos planos de fratura associada, variações sobre o procedimento convencional e os critérios de interpretação de imagens de congelamento e fratura. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a investigação ultra-estrutural em muitas áreas da biologia celular e promete ser uma técnica de imagem molecular para emergentes, nanotecnologia, e os estudos de ciência dos materiais.

Introdução

O conceito e aplicação prática do processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas foi introduzido por ^uma Steere mais de meio século atrás. O aparelho cedo apropriou componentes díspares em uma unidade auto-suficiente trabalhar ^um. O aparelho inicial foi modificado e refinado em instrumentos comercialmente disponíveis, a fim de acomodar a necessidade crítica para a manipulação remota, manutenção de alto vácuo, e a evaporação do carbono e metais para produzir uma réplica apropriada para exame por microscopia electrónica de transmissão (Figura 1 e Figura 2).

O aparelho típico é constituído por uma câmara de alto vácuo e com o quadro de amostra braço micrótomo com débitos reguláveis ​​de azoto líquido (Figura 1). A câmara também abriga dois canhões de electrões, um estabilizante para a evaporação de carbono posicionados em um ângulo de 90 ° para a fase da amostra e o outro por platinum / carbono sombreamento num ângulo ajustável, tipicamente 15 ° - 45 ° (Figura 2). A alimentação da unidade é aplicada para operar a bomba de vácuo e painéis eletrônicos regular de ajuste de temperatura e eletrônica de controle de armas.

Originalmente concebido como um meio para alcançar uma melhor imagem de vírus, congelar-fratura ganhou ainda mais popularidade como uma técnica para o exame e análise das membranas celulares e suas especializações ^{2, 3.} Na verdade, este procedimento tem sido parte integrante da elucidação das relações de estrutura / função em células e tecidos e muitos desses estudos se apresentam como contribuições clássicas para biologia celular e molecular ^4-9. O principal objetivo e justificativa para o desenvolvimento da técnica de congelamento e fratura era limitar artefatos observáveis ​​no elétron resolução microscópica decorrente da fixação química e processamento utilizado em microscopia eletrônica biológico convencional. Aqui o objectivo é limitar a químicaa fixação e para congelar as amostras com uma velocidade suficiente e muitas vezes na presença de um agente crioprotector de modo a limitar a formação de cristais de gelo e outros artefactos de congelamento. Mais recentemente, esta técnica tem encontrado um ressurgimento do interesse de biólogos moleculares e investigadores de ciência dos materiais para exame de nanopartículas e nanomateriais.

Freeze-fratura e congelar-etch imagens apresentam um caráter tridimensional e, por vezes, são confundidos com microscopia eletrônica de varredura. No entanto, os preparativos criofratura são examinados por microscopia eletrônica de transmissão e sua grande contribuição para os estudos morfológicos de alta resolução é a sua representação única de elementos estrutura / função das membranas celulares. Processamento de fractura por congelação é iniciada por células e tecidos de congelação com uma velocidade suficiente para limitar a cristalização do gelo e / ou com o uso de agentes crioprotectores, tais como glicerol. As amostras são então fraturado sob vácuo e um representantelica é gerado pela evaporação de carbono e platina sobre a superfície fracturada. A amostra original foi digerido a partir de réplicas, que é recuperado dentro de uma grade de amostra padrão EM. Outra má interpretação comum de imagens criofratura é que eles retratam superfícies celulares. No entanto, a premissa básica da congelação-fractura é que as membranas biológicas são divididos através da bicamada lipídica do processo de fractura (Figura 3). Este processo em membranas biológicas produz duas faces, uma fractura que revela a organização da metade da membrana adjacente ao citoplasma, o PF-cara, e uma que revela a metade do folheto bimolecular da membrana que está adjacente ao extracelular meio, a EF-face. Superfície das células não são verdadeiras imagens representadas em freeze-fracture mas só aparecem quando o passo subsequente adicionado de gelo-água-forte, seguindo o procedimento fractura é usado. A fim de gravar efetivamente espécimes previamente fraturadas para revelar detai superfíciel, as amostras devem ser congeladas a uma taxa rápida e sem unetchablecryoprotectant. Etching de água a partir da superfície do espécime fracturadas que revelem características subjacentes é conseguido através do posicionamento do braço micrótomo arrefecimento durante a fase de amostra criando um diferencial de temperatura entre a fase, com o modelo e o braço micrótomo de arrefecimento que faz com que a água a sublimar a partir da superfície. Quando a água é sublimada a partir da superfície do espécime fracturados durante a manobra de gravura congelação, em seguida, os aspectos de superfícies celulares reais, matriz extracelular, as estruturas do citoesqueleto e montagens moleculares pode ser revelada em alta resolução. Assim congelar-fratura e congelá-etch não são termos intercambiáveis ​​mas refletem um processo passo a passo o último dos quais pode não ser necessário ou desejável, dependendo das necessidades do estudo particular.

Após a fratura freeze / freeze-etch procedimentos, as superfícies fraturadas são submetidos a evapora dirigidostiva camadas de carbono e platina, a fim de fornecer suporte e imagem contraste com a réplica. A evaporação de imagem / carbono platina pode ser unidirecional ou rotativo, e é realizado por qualquer resistência ou canhões de elétrons. Sombreamento unidirecional de um ângulo conhecido, tipicamente 30 ° - 45 °, é útil na realização de certos cálculos morfométricos. As amostras que foram submetidas a deep-etching normalmente são rotativos sombreado e as imagens resultantes destes espécimes são fotograficamente revertida para avaliação.

O histórico, bem como uma meta presente da criofratura / congelar-etch técnica é limitar a fixação química e processamento das amostras de artefatos que estão associados com mais procedimentos de microscopia eletrônica de transmissão convencional. No entanto, esta técnica proporciona uma vantagem substancial em sua capacidade de conferir detalhe tridimensional e, assim, facilitar a aquisição de dados morfométricos em biológicas, ciência dos materiais, e nespécimes anotechnology. Procedimentos criofratura e congelar-etch são complexas e multi-facetada e alguns aspectos de sua aplicação são personalizados. Esta apresentação oferece uma visão levantamento das principais características do processo e remete-se a protocolos publicados abrangentes ^{10, 11} a fim de resolver os detalhes e personalizar o processo para as necessidades específicas de pesquisa.

Protocolo

1 Preparação de amostras biológicas para Freeze-fratura / Freeze-etch

1. Use uma formulação fixador EM convencional, tal como o glutaraldeído a 2% + 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. para realizar a fixação primária de tecidos biológicos. Nota: Embora possa ser desejável para congelar alguns tipos de amostras sem fixação prévia, de agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue precauções universais obrigar a fixação adequada em que a amostra consiste de tecido humano.
2. A seguir à fixação primária, enxaguar a amostra no mesmo tampão suplementado com sacarose a 0,2 M para não mais do que 1 hora.
3. Transfira a amostra a uma solução de agente crioprotector consiste em 25% de glicerol em tampão fosfato 0,1 M, para não mais do que 1 hora.

2. congelação e armazenamento de amostras de antecedência da Freeze-fratura

1. Seleccionar os espécimes de ouro ou de cobre topos de tamanho e forma para a amostra adequada a ser processado (Figura 4 ).
2. Usando fórceps fino grau e / ou calibre pequeno posição agulhas de seringa pequenos fragmentos da amostra na parte superior de um topo da amostra de metal.
   1. Reduzir o teor de líquido da amostra para um pegajoso, ligeiramente cola como a consistência, a tiragem de líquidos a partir do bordo do topo com o papel de filtro.
   2. Para réplicas individuais, use agulhas de pequeno calibre seringa para criar um monte de tecido no topo. Por duas vezes réplicas, inverter outro toco e posicioná-lo exatamente sobre o topo e coloque levemente na superfície da amostra a criação de um sanduíche (Figura 5A). Não pressione a amostra para fora entre os dois tocos.
3. Encha dois vasos Dewar isolados com nitrogênio líquido. NOTA: O primeiro recipiente acomoda um poste de metal contendo um pequeno poço que é utilizado para liquefazer um pequeno volume de gás propano de um cilindro disponível comercialmente (Figura 5B). O segundo navio é um armazenamento particionado / navio segurando para brevely manter espécimes congelados com nitrogênio líquido.
   1. Utilizando o cilindro de bocal posicionada dentro do poço de propano, abrir a válvula do cilindro e permitem que o gás flua para o poço do primeiro vaso em que vai liquefazer. NOTA: CUIDADO !! PROPANE é explosivo, PODE CAUSAR LESÕES NO CONGELAMENTO contato e é um asfixiante. Use propano apenas em uma capa química certificada para tal uso cuidando também para evitar fontes de ignição estranhos, usando vestuário de protecção das temperaturas baixas, e manter a ventilação adequada.
   2. Tão rapidamente quanto possível, pegar o modelo de montagem com uma pinça de grão fino e mergulhá-la no gás liquefeito no primeiro navio por alguns segundos, em seguida, transferir rapidamente para o segundo reservatório de retenção de nitrogênio líquido (Figura 5B).
   3. Uma vez que as amostras são congeladas, loja sob nitrogênio líquido até o momento de transferir para a fábrica de gelo-fratura. Transfira os tocos para um nitrogênio líquido recipiente Dewar maior de armazenamento para prorrogadoarmazenamento, se desejar, no entanto o cuidado deve ser tomado para não permitir que os tocos para descongelar.

3 Operação da fratura Congelar Instrumento e Specimen Processing

1. Carregando espécimes no suporte de latão e para a câmara
   1. Coloque os topos de amostras de ouro em um suporte de amostra dupla réplica do tipo brochura ou dispositivo de fixação sob nitrogênio líquido e manter lá até a hora de colocar na câmara da amostra (Figura 6).
   2. Quando a câmara tenha atingido alto vácuo (cerca de 2 x 10 ^-6 mbar) e a fase de ter sido arrefecido até à temperatura de azoto líquido, desligar a bomba, a câmara de ventilação, e posicionar os espécimes montados tocos para a mesa de amostra tão rapidamente quanto possível .
   3. Ligar a bomba, restabelecer a alto vácuo, e usar fase e temperatura braço controlos electrónicos para ajustar a temperatura da amostra de tabela de -100 ° C e azoto líquido directamente para o braço micrótomo e bring que a temperatura do azoto líquido.
2. O processo de fratura
   1. Ao atingir alto vácuo, uma temperatura de -100 ° C fase e braço microtome à temperatura do azoto líquido, abrir remotamente o titular duplo réplica espécime fraturando assim as amostras sobre as montagens de amostras (freeze-fracture_movie1.mov).
   2. No caso de espécimes destinados a seguinte fractura gravura, utilizar uma lâmina mantida num grampo no braço micrótomo para raspar (isto é, fractura) a superfície das amostras, em vez do passo 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov).
   3. Se o passo de gravura congelamento é adicionado para ser executada, posicionar o braço micrótomo arrefecida sobre as superfícies fracturadas por um a vários minutos. NOTA: Esta manobra sublima (ie, etch) água da superfície fraturada. O efeito desta manobra é o de revelar verdadeiras superfícies celulares, matriz extracelular, e / ou agrupamentos moleculares por sublimação de água, em adição a fracture caras que passa através da bicamada lipídica das membranas.
3. Sombreamento de metal e suporte réplica evaporação usando canhões de elétrons
   1. Ative a arma platina / elétron de carbono ou de resistência e permitir que ele se evapore uma camada fina (cerca de 2 nm) de platina / carbono sobre a superfície de fratura de um ângulo de 30 ° - 45 °. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg.
   2. Ative o elétron de carbono ou arma de resistência como no passo 3.3.1 e evaporar uma fina camada de carbono para a superfície da amostra fraturada directamente de cima (90 º) para dar suporte para a réplica. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg.
4. Recuperação de réplicas
   1. Após a conclusão do sombreamento replicação e estabilização de carbono, desligar a bomba de vácuo, ventilação da câmara, e remover o modelo de montagem do instrumento.
   2. Usando um par de fórceps grade fina remover cada stub espécime de ouro da duplaréplica folheto / braçadeira e permitir a descongelar durante vários segundos antes de baixar suavemente o topo sobre uma superfície de água, em uma placa de mancha (Figura 7). NOTA: A réplica de carbono / platina contendo material de amostra aderente irá flutuar sobre a superfície da água.
   3. Manobra as réplicas usando um laço de arame fino ou uma grade microscópio eletrônico de cobre convencional realizada por uma pinça de grão fino e transferência para outra placa de ponto contendo dicromato de sódio a 5% em ácido sulfúrico a 50% para uma a várias horas. NOTA: Este banho digere o material de amostra biológica real da réplica. Intensidade total de lixívia doméstica pode ser substituído por uma solução de ácido dicromato / ácido sulfúrico.
   4. Quando a digestão é completa, transferir a réplica de volta para a superfície da água limpa e recuperar dentro de uma grade de microscopia eletrônica de cobre padrão. (NOTA: Réplicas podem fragmentar em pedaços menores durante a digestão, mas mesmo muito pequenas réplicas podem conter informação substancial e deve ser retquistada e examinados.) réplica da loja apoiando grades em caixas de grade disponíveis comercialmente onde permanecerão estáveis ​​durante anos com manipulação suave.

4 O exame ultra-de criofratura / Replicas de corrosão

1. Ver réplicas em um microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de aceleração normalmente 50-80 kV.
2. Grave imagens relevantes em filme TEM padrão ou com uma câmera digital de alta resolução.

Resultados

A premissa fundamental de interpretação da imagem criofratura é que planos de fratura atravessar a bicamada lipídica das membranas que conferem duas faces da fratura, chamado por convenção a PF-face (plasma fratura-face) e EF-face (extracelular fratura-face) (Figura 3). O PF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao citoplasma da célula e o EF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao meio extracelular. A técnica de congelação-fractura é particularm...

Discussão

Nos anos seguintes a sua introdução e disponibilidade comercial, congelar-fratura / procedimentos de corrosão foram amplamente utilizado em investigações da estrutura da membrana biológica. Na verdade, as melhores perspectivas de algumas das especializações estruturais das membranas foram obtidos em preparações criofratura / etch. Estes estudos não só contribuiu para a compreensão da organização estrutural das membranas mas também forneceu insights sobre como a estrutura ea função estão relacionados. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.