Фундаментальный Технический Элементы замерзания перелома / Зафиксированные-травления в биологическом электронной микроскопии

Резюме

Основные методы и уточнения обработки замораживания-разрушения биологических образцов и наноматериалов для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии описаны. Эта техника является предпочтительным методом для выявления ультраструктурные особенности и специализации биологических мембран и для получения мерных и пространственные данные ультраструктурным уровня в материаловедении и нанотехнологической продукции.

Аннотация

Замерзание перелом / заморозить травления описывает процесс, при котором образцы, как правило, биологические или наноматериал в природе, заморожены, перелом, и воспроизведены в генерировать углерода / платина "бросить", предназначенный для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии. Образцы подвергают сверхбыстрой ставок замораживания, часто в присутствии криопротекторов, чтобы ограничить образование кристаллов льда, с последующим разрыва образца при охлаждаемым жидким азотом температуру в высоком вакууме. Полученный перелом поверхность тиражируется и стабилизируется испарения углерода и платины под углом, что придает поверхности трехмерной детали к броску. Эта техника оказалась особенно поучительно для исследования клеточных мембран и их специализаций и внес значительный вклад в понимание клеточных форме к соответствующей функции клеток. В этом докладе, мы рассматриваем требования инструмента и технический протокол для выполнениясублимационной перелом, связанный номенклатура и характеристики самолетов разрушения, вариации на обычной процедуры и критерии интерпретации замораживанием перелом изображений. Эта техника широко используется для ультраструктурным расследования во многих областях клеточной биологии и перспективен как новой техники визуализации для молекулярной, нанотехнологии, и материаловедение исследования.

Введение

Понятие и практическое применение обработки замораживания-разрушения биологических образцов было введено Стир ¹ более полувека назад. Ранняя аппарат присвоил разрозненные компоненты в рабочую автономного блока ^1. Оригинальный аппарат был изменен и перерабатывается в коммерчески доступных инструментов для того, чтобы учесть крайнюю необходимость удаленного манипулирования, поддержания высокого вакуума, и испарение углерода и металлов для производства реплику подходящий для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рисунок 1 и рисунок 2).

Типичный прибор состоит из высокой вакуумной камере с образцом таблицы и микротома руку, имеющей регулируемые жидкие пропускную азота (рисунок 1). Камера также находятся два электронных пушек, один для стабилизации углерода испарения расположенный на 90 ° углом к ​​сцене образца, а другой для Platiкол / углерода слежки в регулируемым углом, обычно 15 ° - 45 ° (рисунок 2). Питание ресивера применяется для работы вакуумного насоса и электронные панели регулировать регулировки температуры и электронный контроль над огнестрельным оружием.

Первоначально задуманный как средство для достижения улучшенной визуализации вирусов, заморозить-перелом, полученный еще большую популярность в качестве метода для проверки и анализа клеточных мембран и их специализаций ^{2, 3.} В самом деле, эта процедура является неотъемлемой частью выяснения структуры / функции отношения в клетках и тканях, и многие из этих исследований стоят как классических вкладов в клеточной и молекулярной биологии ^4-9. Основная цель и обоснование для развития техники сублимационной перелома в том, чтобы ограничить артефакты, наблюдаемые в электронно-микроскопического разрешения, вытекающие из химической фиксации и обработки, используемой в обычных биологических электронной микроскопии. Здесь цель состоит в том, чтобы ограничить химическуюфиксация и заморозить образца с достаточной скоростью и часто в присутствии криопротекторов в того, чтобы ограничить образование кристаллов льда и других замораживание артефакты. Совсем недавно, эта техника нашла всплеск интереса от молекулярных биологов и материаловедения следователей для изучения наночастиц и наноматериалов.

Мораторий-перелом и заморозить травления изображения демонстрируют трехмерный характер и иногда ошибочно принимают за сканирующем электронном микроскопе. Тем не менее, замораживанием перелом препараты рассматриваются с помощью просвечивающей электронной микроскопии и их большой вклад в морфологических исследований с высоким разрешением является их уникальный представление структуры / функциональных элементов клеточных мембран. Замораживание-перелом обработки инициируется замораживание клеток и тканей с достаточной скоростью, чтобы ограничить кристаллизации льда и / или с использованием криопротекторов агентов, таких как глицерин. Затем образцы перелом в вакууме и репутациейLICA порождается испарения углерода и платины над поверхности излома. Оригинальный экземпляр переваривается из реплики, которые извлекается на стандартную EM образца сетки. Еще одна распространенная неправильная интерпретация замораживанием перелом изображений является то, что они изображают поверхности клеток. Однако основная предпосылка сублимационной перелома в том, что биологические мембраны разделены через липидный бислой в процессе разрушения (рисунок 3). Этот процесс в биологических мембранах дает два лица разрушения, один, который показывает организацию половины мембраны, прилегающей к цитоплазме, ПФ-лица, и один, который показывает половину бимолекулярного листовки мембраны, которая примыкает к внеклеточной среда, EF-лицо. Истинные клеточные поверхности, не представлены в замораживанием перелом изображений, но появляются только тогда, когда последующий добавил шаг сублимационной травления в соответствии с процедурой разрушения используется. Для того, чтобы эффективно травления ранее перелом образцы по выявлению поверхностные Detaiл, образцы должны быть заморожены с большой скоростью и без unetchablecryoprotectant. Травление воды с поверхности образца трещиноватых, раскрывающих, лежащие в основе функции достигается путем установки охлаждения микротомных руку над стадии образца, создавая разность температур между стадии, удерживающий образец и охлаждающей микротомных рычаг, который заставляет воду, чтобы сублимировать с поверхности. Когда вода сублимируется с поверхности образца разрушенных во время замораживания-травления маневра, то аспекты реальных поверхностей клеток, внеклеточный матрикс, цитоскелета структур и молекулярных агрегатов могут быть выявлены с высоким разрешением. Таким образом сублимационной перелом и заморозить травления не взаимозаменяемые термины, а скорее отражают поэтапный процесс последний из которых не может быть необходимым или желательным в зависимости от нужд конкретного исследования.

После ледостава перелома / стоп-травления процедуры, сломанные поверхности подвергаются направленных evaporaного слоя углерода и платины в целях обеспечения поддержки и изображений контраст с репликой. / Углерода испарения изображений платина может быть однонаправленным или поворотные и осуществляется либо сопротивление или электронных пушек. Однонаправленный затенение от известным углом, обычно 30º - 45 °, полезно при выполнении отдельных расчеты морфометрических. Образцы, которые были подвергнуты глубокой травления обычно поворотные тени и полученные образы этих образцов фотографически вспять для оценки.

Историческая, а также присутствует цель сублимационной перелома / заморозить травления техники является ограничение химическую фиксацию и обработку образца артефактов, которые связаны с более традиционными передачи процедур электронной микроскопии. Тем не менее, этот метод обеспечивает существенную преимущество в его способности придавать трехмерную деталь и тем самым облегчить приобретение морфометрических данных в биологических, материаловедения, и нanotechnology образцы. Мораторий-перелом и заморозить травления процедуры сложны и многогранны и некоторые аспекты его применения настроены. Эта презентация открывается вид обследования из главных особенностей процесса и отсылаем читателя к комплексным опубликованных протоколов ^{10, 11} в целях решения детали и настроить процесс для конкретных потребностей в области исследований.

протокол

1 Подготовка биологических образцов для замерзания перелома / Зафиксированные-травления

1. Использование обычного EM фиксирующий препарат, такой как 2% глутарового альдегида + 2% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 часа. выполнить первичную фиксацию биологических тканей. Примечание: В то время как может быть желательно заморозить некоторые виды образцов без предварительного фиксации, универсальные через кровь патогенных меры предосторожности мандат соответствующую фиксацию, где образец состоит из тканей человека.
2. После первичной фиксации, промыть образца в том же буфере с добавлением 0,2 М сахарозы в течение не более 1 часа.
3. Передача образца к криопротекторов раствора, состоящего из 25% глицерина в 0,1 М фосфатном буфере в течение не более 1 часа.

2 замораживания и хранения образцов заранее сублимационной перелома

1. Выбор золота или меди образца заглушки соответствующего размера и формы для образца обрабатывается (фиг.4 ).
2. Использование щипцов прекрасные сорта и / или небольшой калибр шприцев иглы позиции небольшие фрагменты образца на вершине металла образца заглушки.
   1. Уменьшите содержание жидкости образца, чтобы липкая, слегка приклеить консистенции на отвода жидкости от края заглушки с фильтровальной бумагой.
   2. Для одиночных реплик, использовать маленькие иглы калибра шприцев создать насыпь ткани на пенек. Для двойного реплик, инвертировать другой окурок и расположите его точно над пенек и поместите слегка на поверхности образца, создавая многослойную (рисунок 5А). Не нажимайте образец из между двумя заглушками.
3. Заполните два изолированных сосудах Дьюара с жидким азотом. Примечание: первое судно вмещает металлическую штангу, содержащий небольшое скважины, которая используется для разжижения небольшой объем газа пропана из коммерчески доступного цилиндра (фиг.5В). Второе судно является разделенная хранения / удерживающей емкости для краткоголы поддержания замороженные образцы в жидком азоте.
   1. Использование сопла цилиндра, расположенную в скважине пропан, открыть клапан баллона, и позволить газу поступать в скважину первого судна, где она будет сжижения. ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ !! Пропан взрывчатых веществ, могут привести к замерзанию ТРАВМЫ на контакт, и является удушающие. Используйте пропан только в химическом капотом сертифицированных для такого использования заботиться также, чтобы избежать посторонних источников воспламенения, используя одежды защитные от низких температур, и поддержанию достаточной вентиляцией.
   2. Как можно быстрее, забрать образец установки щипцами мелких классов и вонзить его в сжиженного газа в первом сосуде в течение нескольких секунд, а затем быстро передать второй холдинга судна жидкого азота (Рисунок 5Б).
   3. После того, как образцы замораживаются, магазин под жидким азотом до готовности передать на завод сублимационной перелома. Перенести заглушки на больше для хранения жидкого азота сосуд Дьюара для продленхранение при желании, однако следует позаботиться, чтобы не допустить окурки таять.

3 Эксплуатация замораживанием перелома инструмента и образца Обработка

1. Загрузка образцов на держателе из латуни и в камеру
   1. Загрузите золотого образца окурки в буклет типа двойной реплик держатель образца или зажать устройство под жидким азотом и не поддерживать там до готовности на позицию в образце камеры (Рисунок 6).
   2. Когда камера добилась высокого вакуума (примерно 2 х 10 ^-6 мбар) и этап был охлажден до температуры жидкого азота, выключить насос, вентиляционные камеры, и позиционировать смонтированные образцами заглушек на стол образца как можно быстрее .
   3. Включите насос, восстановить высокий вакуум, и использовать электронные системы управления сценические и температуры рука, чтобы отрегулировать температуру образца таблицы до -100 ° С и прямой жидкого азота к микротома руку и бринг его до температуры жидкого азота.
2. Процесс разрушения
   1. После достижения высокого вакуума, температуры сценический -100 ° С и микротоме руку при температуре жидкого азота, дистанционно открыть двойной держатель реплики образца таким гидроразрыва образцов на образец крепления (сублимационной fracture_movie1.mov).
   2. В случае образцов, предназначенных для травления после переломов, использовать лезвие поддерживается в зажиме на микротома рычага для бритья (например, перелом) поверхность образцов вместо этапа 3.2.1 (сублимационной etch_movie2.mov).
   3. Если добавленное замораживания-травления шаг должен быть выполнен, положение охлажденного микротомных руку над трещиноватых поверхностей для одного до нескольких минут. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр будет сублимировать (т.е., травление) вода из поверхности излома. Эффект этого маневра, чтобы выявить истинные клеточные поверхности, внеклеточный матрикс и / или молекулярные сборки путем сублимации воды, в дополнение к FRActure лица, проходящий через липидный бислой мембраны.
3. Металл затенение и поддержка реплики испарение с помощью электронных пушек
   1. Активируйте платины / углерода электронов или сопротивления пистолет и дать ей испариться тонким слоем (примерно 2 нм) платины / углерода над переломом поверхности от угла 30º - 45 °. Обычно для этого требуется около 15 - 20 сек.
   2. Активируйте углерода электрон или сопротивления пистолет, как в шаге 3.3.1 и испаряется тонкий слой углерода на поверхности излома образца из прямо над головой (90 °), чтобы оказать поддержку реплики. Обычно для этого требуется около 15 - 20 сек.
4. Извлечение реплик
   1. По окончании слежки репликации и стабилизации углерода, выключите вакуумный насос, вентиляционные камеры, и удалить образец установки от инструмента.
   2. Используя пару щипцов мелких классов удалить каждый золото образца окурок от двойнойкопия буклета / зажим и позволяют таять в течение нескольких секунд, прежде чем осторожно опуская окурок на поверхности воды в пятне пластины (рисунок 7). Примечание: углерод / платины реплики, содержащий адгезивный материал образца будет плавать на поверхности воды.
   3. Маневр реплик, используя либо штраф проволочную петлю или обычный медный электронном микроскопе сеткой, на тонких щипцов и передачи в другое место пластины, содержащей 5% бихромата натрия в 50% серной кислоты для одного до нескольких часов класса. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ванна переваривает фактического биологического материала образца из реплики. Полная прочность бытовой отбеливатель может быть заменен на дихромата / раствора серной кислоты.
   4. Когда пищеварение завершена, передать копию обратно в чистую поверхность воды и извлечения на стандартную микроскопии сетки меди электронов. (ПРИМЕЧАНИЕ: Реплики могут распадаться на более мелкие куски в процессе пищеварения, но даже очень малые копии могут содержать существенную информацию и должны быть RETRieved и рассмотрены.) Магазин реплики поддержки сеток в коммерчески доступных для распределительных коробок, где они будут оставаться стабильными в течение многих лет с бережное обращение.

4 Ультраструктурный Экспертиза замерзания разрушения / травления реплик

1. Вид реплики в просвечивающем электронном микроскопе при ускоряющем напряжении обычно от 50 - 80 кВ.
2. Запишите соответствующие изображения на стандартный ТЕМ фильма или с цифровой камерой высокого разрешения.

Результаты

Ключ предпосылка сублимационной перелома интерпретации изображений является то, что самолеты разрушения проходят через липидный бислой мембран, дающих два лица разрушения, называемого конвенции PF-лицевой (плазма поверхности разрыва) и EF-лица (внеклеточный поверхности разрыва) (р...

Обсуждение

В годы после его введения и коммерческой доступности, сублимационной перелом / травления процедуры были широко использованы для исследования биологической структуры мембраны. В самом деле, лучшие перспективы некоторых структурных специализации мембран были получены в вымораживание...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.