生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

要約

基本的な技術および透過型電子顕微鏡による検査のための生体試料とナノ材料のフリーズフラクチャー処理の改良が記載されている。この技術は、生体膜の超微細構造の特徴と専門性を明らかにするため、材料科学、ナノテクノロジー製品の超微細構造レベル次元の空間データを取得するための好ましい方法である。

要約

自然の中での試料、典型的には、生物学的またはナノ材料、骨折し、凍結し、カーボン/プラチナ "キャスト"透過型電子顕微鏡による検査のために意図を生成するために複製されることにより、フリーズフラクチャー/凍結エッチングは、プロセスについて説明します。試験片を液体窒素で試料のその後の破砕と、氷晶形成を制限するために凍結保護剤の存在下で、多くの場合、超高速凍結速度が施され、高真空下で高温に冷却した。生じた破断面には鋳造、表面の三次元詳細を与える角度から炭素と白金の蒸発によって複製され、安定化される。この技術は、細胞膜とその専門分野の研究に特に啓発証明していると、関連する細胞機能に対する細胞の形の理解にかなり貢献してきました。本稿では、実行するための機器の要件や技術的なプロトコルを調査凍結骨折、関連した用語と、破断面の特性、フリーズフラクチャー画像の解釈のための従来の手順のバリエーション、および判定基準。この技術は、広く細胞生物学の多くの分野での超微細構造の調査のために使用され、分子、ナノテクノロジーのための新たなイメージング技術として有望であり、材料科学の研究されています。

概要

概念と生物学的標本の凍結破砕処理の実用化は、半世紀以上前スティア¹によって導入された。初期の装置は、作業内蔵ユニット¹内に異種のコンポーネントを流用。元の装置は遠隔操作、高真空の維持、および透過型電子顕微鏡による検査に適したレプリカを生成するために、炭素、金属の蒸発（ 図1および図ための重要な必要性に対応するために、市販の器具に変更し、精製した2）。

典型的な器具は、試料台及びミクロトームアーム調節性液体窒素スループットを有する（ 図1）と高真空チャンバから構成されている。室内には、試料ステージに90°の角度やプラティのための他に位置炭素の蒸発を安定化するための2つの電子銃、1を収容45°（ 図2） -調節可能な角度、通常は15°で、シャドーイングNUM /カーボン。ユニットへの電力は、温度調整及び電子銃制御を調節する真空ポンプおよび電子パネルを操作するために適用される。

本来のウイルスの改善されたイメージングを達成するために考え出され、凍結破壊は、細胞膜及びその特殊化^2,3の検査および分析のための技術として、さらに多くの人気を得た。実際に、この手順では、細胞や組織内の構造/機能の関係を解明に不可欠であったと、これらの研究の多くは、細胞生物学および分子生物学^4-9に古典的な貢献として立っている。フリーズフラクチャー法の開発のための主要な目標と原理は、従来の生物学、電子顕微鏡で使用される化学固定および処理に由来する電子顕微鏡の分解能で観測アーティファクトを制限することであった。ここでの目標は、化学物質を制限することです固定は、十分な速度で、頻繁に氷の結晶の形成やその他の冷凍アーティファクトを制限するために、凍結防止剤の存在下で試料を凍結すると。さらに最近では、この技術は、ナノ粒子とナノ材料の検査のための分子生物学者と材料科学の研究者からの関心の復活を発見した。

凍結破砕し、凍結エッチ画像が3次元キャラクタを示し、時には走査型電子顕微鏡写真を間違わある。しかし、フリーズフラクチャー製剤は、透過型電子顕微鏡によって検査され、高解像度の形態学的研究への主要な貢献は、細胞膜の構造/機能要素の独自の表現である。凍結破砕処理および/またはグリセロールなどの凍結保護剤を用いて氷の結晶化を制限するために十分な速度で、細胞および組織を凍結することによって開始される。標本を真空と担当者の下で破断しているLICAは破断面上に炭素と白金の蒸発によって生成される。オリジナルの標本は、標準のEM標本グリッド上に検索されるレプリカから消化される。フリーズフラクチャー画像の別の一般的な誤解は、それらが細胞表面を描写することである。フリーズフラクチャーの基本的な前提は、生体膜の破壊過程（ 図3）によって脂質二重層を通して分割されるということですが。生体膜のこのプロセスは、2つの破断面を、外に隣接する二分子膜のリーフレットの半分を明らかに細胞質、PF-面に隣接する膜の半分の編成を明らかにする一つを生じる環境、EF-顔。真の細胞表面は、フリーズフラクチャー画像に表さなく破壊手順に従って凍結エッチングの後に添加ステップが使用される場合にのみ表示されていない。効果的に表面detaiを明らかにするために以前に破断試験片をエッチングするためにlは、試験片を急速にかつunetchablecryoprotectantずに凍結されている必要があります。根本的な特徴を明らかに骨折した試料表面からの水のエッチングは、試料を保持するステージとの間の温度差を生成する試料ステージ上に冷却ミクロトームアームと、表面から昇華させる冷却水をミクロトームアームを位置決めすることによって達成される。水が凍結エッチング操作中、骨折片の表面から昇華した場合、実際の細胞表面、細胞外マトリックス、細胞骨格構造、および分子集合体の側面は、高解像度で明らかにすることができる。このように凍結破砕し、凍結エッチングは互換用語ではなく、むしろ特定の研究の必要性に応じて必要または望ましくないかもしれない後者は段階的なプロセスを反映している。

フリーズフラクチャー/凍結エッチ手順に従って、破断面が向けられevaporaに供されるレプリカへのサポートおよびイメージングのコントラストを提供するために、炭素と白金のコートを電性。白金/炭素イメージング蒸発は、単方向または回転式であってもよく、抵抗または電子銃のいずれかによって達成される。既知の角度からの単方向シャドウイングは、通常は30° - 45°、特定の形態学的計算を行うのに有用である。ディープエッチングが施された試験片は、一般的に陰に回転式であり、これらの検体の結果画像は、写真的に評価のために逆になっている。

フリーズフラクチャー/凍結エッチング技術の歴史だけでなく、現在の目標は、より従来型の透過型電子顕微鏡の手続きに関連している化学固定および処理試料アーティファクトを制限することである。しかしながら、この技術は、三次元ディテールを付与するため、生物学、材料科学における形態計測データの取得を容易にする能力において実質的な利点を提供し、そしてnanotechnology標本。骨折、凍結および凍結エッチ手順は複雑かつ多面的であり、その応用のいくつかの側面がカスタマイズされています。このプレゼンテーションでは、プロセスの主な機能の調査ビューを提供しており、読者は細部に対処し、特定の研究ニーズに合わせてプロセスをカスタマイズするために、包括的に公開されたプロトコル^10、11と呼ばれている。

プロトコル

フリーズフラクチャー/フリーズ·エッチングのための生物試料の調製

1. そのような1時間0.1 Mリン酸緩衝液中の2％グルタルアルデヒド+ 2％パラホルムアルデヒドのような従来のEM固定剤製剤を使用する。生体組織の主要な固定を行う。注：それは前に固定せず標本のいくつかのタイプを凍結することが望ましいかもしれないが、ユニバーサル血液媒介病原体の予防措置は、検体がヒトの組織で構成され、適切な固定を義務付ける。
2. 一次固定に続いて、わずか1時間、0.2Mのスクロースを補充した同じ緩衝液中の試料をすすぐ。
3. 1時間を超えない、0.1 Mリン酸緩衝液中の25％グリセロールからなる凍結防止剤溶液に試料を移す。

凍結破砕の前に2。凍結と標本の保存

1. （ 図4適切な大きさの金や銅試料スタブを選択して、処理中の試料について形状）。
2. 金属試料スタブの上に試料の位置の小さな断片が細かいグレードの鉗子および/または小ゲージの注射針を使用した。
   1. 少しろ紙とスタブの端から液体を抜き取ることにより、一貫性のような接着剤、粘着性の試料の液体含有量を減らします。
   2. 単一レプリカの場合、スタブ上で組織のマウンドを作成するには、小さなゲージの注射針を使用しています。ダブルレプリカの場合は、それを正確にスタブを介して別のスタブと位置を反転し、サンドイッチ（ 図5A）を作成する試料面上に軽く置きます。 2つのスタブ間から外に標本を押さないでください。
3. 液体窒素で2つの絶縁デュワー容器を埋める。注：最初の容器は市販のシリンダ（ 図5B）からプロパンガスの小容量を液化するために使用される小さなウェルを含む金属ポストを収容する。第二の容器は短いため、パーティションのストレージ/保持容器であるLY液体窒素下で凍結した標本を維持する。
   1. プロパンウェル内に配置シリンダーノズルを用いて、シリンダーバルブを開き、ガスがそれを液化する最初の容器のウェル内に流れることを可能にする。注：注意！プロパンは触れた場合の傷害を凍結原因かもしれません、爆発され、窒息されています。唯一のそのような使用は、低温に対する防護服を使用し、また、外部からの発火源を避けるように注意しながら、十分な換気を維持するために認定された化学フード内でプロパンを使用してください。
   2. 可能な限り迅速に、試料が細かいグレードの鉗子でマウントしてからすぐに液体窒素の第二の保持容器（ 図5B）に転送数秒間最初の容器内で液化ガスにそれを突入拾う。
   3. 標本が凍結されると、直前まで、液体窒素下で店がフリーズフラクチャープラントへ転送します。拡張のための大規模なストレージ液体窒素デュワー容器にスタブを転送必要に応じて、しかし気にストレージはスタブが解凍させないように注意してください。

凍結破砕装置と試料の処理の3。運用

1. 真鍮のホルダーにチャンバ内に検体をロード
   1. 冊子型ダブルレプリカ標本ホルダーにゴールドの試料スタブをロードするか、液体窒素下でデバイスをクランプし、試料室（ 図6）に配置するために準備ができるまでそこに維持する。
   2. チャンバーは高真空（約2×10 ^-6ミリバール）を達成しており、ステージがチャンバーベント、ポンプの電源を切り、液体窒素温度まで冷却し、可能な限り迅速に試料台に取り付けられた試料スタブを配置している場合。
   3. 、ポンプの電源を入れ、高真空を再確立し、ミクロトームアームおよびBRIに試料台を-100℃までの温度と直接液体窒素を調整する電子ステージとアーム温度制御を使用液体窒素温度にngの。
2. 破壊過程
   1. 高真空、液体窒素温度で-100ºCとミクロトーム腕のステージ温度を達成すると、リモートで、それによって試料マウント（凍結fracture_movie1.mov）上の検体を破砕ダブルレプリカ試料ホルダーを開きます。
   2. エッチング後の骨折のために意図標本の場合には、（ すなわち、骨折）を剃ることミクロトーム腕にクランプで維持カミソリの刃を使用してステップ3.2.1の代わりに、試験片の表面（凍結etch_movie2.movを）。
   3. 加え凍結エッチング工程が実行される場合には、数分に1ための破断面上に冷却したミクロトームアームを位置決めする。注：この機動は破断面から（ すなわち、エッチング）水を昇華されます。この手技の効果は、FRAに加えて、水の昇華によって真の細胞表面、細胞外マトリックス、および/または分子集合体を明らかにすることである影は、膜の脂質二重層を通過する対向する。
3. 電子銃を用いた金属シャドウイングとレプリカ支援蒸発
   1. 白金/炭素型電子銃や抵抗をアクティブにし、それが30°の角度から破断面の上に白金​​/カーボンの薄層（約2nm）を蒸発させる - 45°。 20秒 - これは典型的には約15を必要とします。
   2. ステップ3.3.1のように、炭素の電子や抵抗銃をアクティブにして、レプリカに支援を与えることを真上（90°）から破砕試料表面に炭素の薄い層を蒸発させる。 20秒 - これは典型的には約15を必要とします。
4. レプリカの検索
   1. レプリケーションのシャドーイングと炭素の安定化が完了すると、真空ポンプの電源を切り、チャンバーベント、試料が装置からマウント取り外します。
   2. 細かいグレードのピンセットを使用すると、doubleから各金試料スタブを削除レプリカブックレット/クランプと静かにスポットプレート（ 図7）で水面上にスタブを下げる前に、数秒間に解凍することができます。注：接着性試料材料を含有する炭素/白金レプリカが水面上に浮遊する。
   3. 細いワイヤループまたは微細グレードの鉗子と、1〜数時間のために50％硫酸中の5％重クロム酸ナトリウムを含む別のスポットプレートに移すことによって保持された従来の銅電子顕微鏡グリッドのいずれかを使用してレプリカを操縦。注：この浴はレプリカから実際の生体試料材料を消化する。完全な強度の家庭用漂白剤は、重クロム/硫酸溶液の代わりに用いてもよい。
   4. 消化が完了すると、きれいな水の表面に戻って複製を転送し、標準的な銅の電子顕微鏡グリッド上に取り出す。 （注：レプリカは、消化中に小片に断片化するかもしれないが、でも非常に小さなレプリカが、実質的な情報を含んでいてもよく、RETRであるべき彼らは穏やかな取り扱いに年間安定残る市販のグリッドボックス内のグリッドをサポートしています。）お店のレプリカをievedと検討した。

フリーズフラクチャー/エッチレプリカの4微細構造の検討

1. 80 kVの - 典型的には50から加速電圧での透過型電子顕微鏡での表示のレプリカ。
2. 標準のTEM膜上または高解像度デジタルカメラで、関連する画像を記録します。

結果

フリーズフラクチャーの読影の鍵前提は、破断面が規則PF-面（プラズマ破断面）とEF-面（外破断面）（ 図によっていわゆる二破断面を付与する膜の脂質二重層を通過することである3）。 PF-faceが細胞の細胞質およびEF面に隣接する膜脂質二重層の半分が細胞外環境に隣接した膜脂質二重層の半分である。フリーズフラクチャー法は、膜構造の調査のために特に有用で...

ディスカッション

その導入および商業的入手次の年では、フリーズフラクチャー/エッチングの手順は、広く、生物学的膜構造の調査のために利用した。実際、膜の構造の専門分野のいくつかの最高の視点がフリーズフラクチャー/エッチ製剤において得られている。これらの研究は、膜の構造組織の理解に貢献しただけでなく、構造と機能がどのように関連しているかについての洞察を提供していないだけ。 <...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.