Éléments techniques fondamentales de cryofracture / Gel-gravure dans biologique Electron Microscopy

Résumé

Techniques et d'améliorations du traitement cryofracture des échantillons biologiques et des nanomatériaux, pour examen par microscopie électronique à transmission de base sont décrites. Cette technique est une méthode préférée pour révéler caractéristiques ultrastructurales et les spécialisations des membranes biologiques et pour obtenir des données dimensionnelles et spatiales niveau ultrastructural en sciences des matériaux et produits de la nanotechnologie.

Résumé

Cryo-fracture / gel de mordançage décrit un processus par lequel des spécimens, généralement biologique ou nanomatériaux dans la nature, sont gelés, fracturée, et reproduit pour générer un rapport carbone / platine "jeter" destiné à l'examen par microscopie électronique à transmission. Les échantillons sont soumis à des vitesses de congélation ultra-rapides, souvent en présence d'agents cryoprotecteurs pour limiter la formation de cristaux de glace, à la suite de la fracture de l'échantillon à la température de l'azote liquide refroidi sous vide poussé. La surface résultante est répliqué fracturé et stabilisé par l'évaporation de carbone et le platine à partir d'un angle qui confère une surface tridimensionnelle détaillée de la distribution. Cette technique s'est avérée particulièrement éclairante pour l'étude des membranes cellulaires et de leurs spécialisations et a considérablement contribué à la compréhension de la forme cellulaire de la fonction des cellules liées. Dans ce rapport, nous passons en revue les exigences de l'instrument et le protocole technique pour effectuergel-fracture, la nomenclature et les caractéristiques des plans de fracture associée, variations de la procédure conventionnelle, et les critères d'interprétation des images de fracture par congélation. Cette technique a été largement utilisée pour l'enquête ultrastructurale dans de nombreux domaines de la biologie cellulaire et est très prometteur comme une technique d'imagerie moléculaire pour émergents, nanotechnologies, matériaux et études scientifiques.

Introduction

Le concept et l'application pratique de la transformation cryofracture des échantillons biologiques a été introduit par Steere ¹ plus de la moitié il ya un siècle. L'appareil approprié début composants disparates en une unité autonome de travail ^1. L'appareil initial a été modifié et affiné dans des instruments disponibles dans le commerce afin de répondre au besoin critique pour la manipulation à distance, le maintien de vide poussé, et l'évaporation du carbone et des métaux pour produire une réplique appropriée pour l'examen par microscopie électronique à transmission (figure 1 et figure 2).

L'instrument typique se compose d'une chambre à vide élevé avec la table d'échantillon et ayant des bras microtome peut réguler des débits d'azote liquide (figure 1). La chambre abrite aussi deux canons à électrons, pour stabiliser une évaporation de carbone positionné à un angle de 90 ° de la platine porte-objet et l'autre pour les platinum / carbone ombrage à un angle ajustable, 15 ° - 45 ° (Figure 2). L'alimentation de l'appareil est appliqué à faire fonctionner la pompe à vide et des panneaux électroniques réguler réglage de la température et de l'électron contrôle des armes à feu.

Conçu à l'origine comme un moyen de parvenir à une meilleure imagerie de virus, de gel-fracture gagné encore plus de popularité en tant que technique pour l'examen et l'analyse des membranes cellulaires et leurs spécialisations ^{2, 3.} En effet, cette procédure a fait partie intégrante d'élucider les relations structure / fonction des cellules et des tissus et la plupart de ces études se tiennent comme des contributions classiques de biologie cellulaire et moléculaire ^4-9. Le principal objectif et la justification du développement de la technique de congélation-fracture était de limiter les artefacts observables au microscope électronique la résolution découlant de la fixation chimique et traitement utilisé dans la microscopie conventionnelle d'électrons biologique. Ici le but est de limiter chimiquefixation et à congeler l'échantillon avec une vitesse suffisante et souvent en présence d'un cryoprotecteur afin de limiter la formation de cristaux de glace et d'autres objets de congélation. Plus récemment, cette technique a trouvé un regain d'intérêt des biologistes moléculaires et chercheurs en science des matériaux pour l'examen des nanoparticules et des nanomatériaux.

Images cryofracture et gel-gravure présentent un caractère tridimensionnel et sont parfois confondus avec des photographies au microscope électronique à balayage. Cependant, les préparations de fracture par congélation sont examinés par microscopie électronique à transmission et leur contribution majeure aux études morphologiques en haute définition est la représentation unique d'éléments de structure / fonction des membranes cellulaires. Cryo-fracture traitement est initié par congélation des cellules et des tissus avec une vitesse suffisante pour limiter la cristallisation de la glace et / ou avec l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le glycérol. Les échantillons sont ensuite fracturées sous vide et un représentantlica est généré par l'évaporation de carbone et le platine sur la surface fracturée. L'échantillon initial est digéré de la réplique qui est récupéré sur une grille standard de l'échantillon EM. Une autre erreur d'interprétation commune des images de fracture par congélation, c'est qu'ils représentent la surface des cellules. Toutefois, le principe de base de cryofracture est que les membranes biologiques sont répartis à travers la bicouche lipidique par le processus de rupture (figure 3). Ce processus dans les membranes biologiques donne deux faces de rupture, une qui indique l'organisation de la moitié de la membrane adjacente au cytoplasme, le PF-face, et qui montre la moitié de la valve bimoléculaire de la membrane qui est adjacente à la extracellulaire milieu, l'EF-face. La surface des cellules de véritables ne sont pas représentés dans les images de fracture par congélation, mais apparaissent uniquement lorsque l'étape supplémentaire ultérieure de gel de gravure en suivant la procédure de rupture est utilisé. Afin de graver efficacement des échantillons prélevés antérieurement fracturés pour révéler detai de surfacel, les échantillons doivent être congelés à un rythme rapide et sans unetchablecryoprotectant. La gravure de l'eau à partir de la surface de l'échantillon fracturé qui révèlent des caractéristiques sous-jacentes est réalisée en positionnant le bras microtome de refroidissement au-dessus de la platine porte-objet de créer un différentiel de température entre la phase de maintien de l'échantillon et le bras microtome de refroidissement qui amène l'eau à se sublimer à partir de la surface. Lorsque l'eau est sublimée à partir de la surface de l'échantillon fracturé lors de la manoeuvre de gravure par congélation, puis les aspects de surfaces réelles de cellules, la matrice extracellulaire, des structures cytosquelettiques, et des assemblages moléculaires peuvent être révélées à haute résolution. Ainsi gel fracture et le gel gravure ne sont pas des termes interchangeables mais reflète un processus par étapes dont la dernière peut-être pas nécessaire ou souhaitable en fonction des besoins de l'étude.

Après la cryofracture / gel de mordançage procédures, les surfaces fracturées sont soumis à l 'évaporation dirigéstive couches de carbone et de platine, afin de fournir un appui et d'imagerie à contraste de la réplique. Le / carbone imagerie évaporation du platine peut être unidirectionnelle ou rotatif et est accompli par résistance ou des canons à électrons. Observation unidirectionnelle à partir d'un angle connu, généralement de 30 ° - 45 °, est utile dans l'exercice de certains calculs morphométriques. Les échantillons qui ont été soumis à profondeur de gravure sont généralement rotatif ombre et les images résultantes de ces spécimens sont photographiquement inversés pour l'évaluation.

L'historique ainsi qu'un objectif actuel du / technique de gel-gravure cryofracture est de limiter la fixation et le traitement chimique spécimen objets qui sont associés à des procédures plus classiques de transmission de microscopie électronique. Cependant, cette technique présente un avantage substantiel dans sa capacité à conférer détail en trois dimensions, et donc de faciliter l'acquisition de données morphométriques dans biologique, la science des matériaux, et nspécimens anotechnology. Procédures cryofracture et gel-gravure sont complexes et à multiples facettes et certains aspects de son application sont personnalisés. Cette présentation offre une vue de l'enquête sur les principales caractéristiques du processus et le lecteur est renvoyé à des protocoles complets publiés ^{10, 11} afin de traiter les détails et personnaliser le processus pour les besoins de recherche spécifiques.

Protocole

1 Préparation des spécimens biologiques pour Cryo-fracture / Gel-gravure

1. Utilisation d'une formulation de fixateur EM classique tel que glutaraldéhyde à 2% + 2% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate 0,1 M pendant 1 heure. à effectuer la fixation primaire de tissus biologiques. REMARQUE: Bien qu'il soit souhaitable de geler certains types de spécimens sans fixation préalable, universels pathogènes à diffusion hématogène précautions prescrivent fixation appropriée lorsque l'échantillon est constitué de tissus humains.
2. Après la fixation primaire, rincer l'échantillon dans le même tampon additionné de 0,2 M de saccharose de pas plus de 1 heure.
3. Transférer le spécimen dans une solution cryoprotectrice consistant en 25% de glycerol dans du tampon phosphate 0,1 M pendant au plus 1 h.

2. de congélation et de stockage des échantillons En avance cryofracturation

1. Sélectionnez or ou cuivre spécimens talons de taille et la forme de l'échantillon approprié en cours de traitement (Figure 4 ).
2. En utilisant des pinces fines de qualité et / ou de petit calibre de la position des aiguilles de seringues de petits fragments de l'échantillon sur le haut d'une tubulure de prélèvement de métal.
   1. Réduire la teneur en liquide de l'échantillon à un collant, un peu comme la consistance de la colle par soutirage de liquide à partir du bord de l'embout avec un papier filtre.
   2. Pour répliques simples, utiliser de petites aiguilles de seringues de calibre pour créer un monticule de tissu sur le talon. Pour deux répliques, inverser autre talon et le positionner exactement sur ​​le talon et le placer légèrement sur ​​la surface de l'échantillon créer un sandwich (figure 5A). N'appuyez pas sur l'échantillon d'entre les deux talons.
3. Remplir deux navires de Dewar isolés avec de l'azote liquide. NOTE: Le premier récipient recevant un poste de métal contenant un petit puits qui est utilisé pour liquéfier un petit volume de gaz propane à partir d'une bouteille du commerce (Figure 5B). Le deuxième bâtiment est un stockage partitionné / récipient de maintien d'une brèvement maintenir les échantillons congelés dans l'azote liquide.
   1. Utilisation de la buse du cylindre positionné dans le puits de propane, d'ouvrir le robinet de la bouteille et permet au gaz de s'écouler dans le puits de la première cuve où il se liquéfie. NB: ATTENTION !! PROPANE est explosif, peut causer des blessures AU CONTACT congélation et asphyxiant. Utilisez propane seulement dans une hotte chimique homologué pour cet usage en prenant soin aussi d'éviter les sources d'inflammation étrangers, en utilisant des vêtements de protection contre les températures basses, et le maintien d'une ventilation adéquate.
   2. Aussi rapidement que possible, ramasser les spécimen de montage avec une pince fine de qualité et plongent dans le gaz liquéfié dans le premier récipient pendant plusieurs secondes, puis transférer rapidement à la deuxième cuve de maintien de l'azote liquide (figure 5B).
   3. Une fois les échantillons sont congelés, magasin sous azote liquide avant d'être prêt à transférer à l'usine de congélation-fracture. Transfert talons à un azote liquide contenant de Dewar de stockage plus étendue pourstockage si on le souhaite, les soins ne doit cependant veiller à ne pas laisser les talons à décongeler.

3 Fonctionnement de la cryofracture instrument et de traitement des échantillons

1. Chargement des échantillons sur le support en laiton et dans la chambre
   1. Charger l'échantillon d'or talons en double réplique porte-échantillon du type de livret ou dispositif serrer sous azote liquide et y maintenir jusqu'au moment de les placer dans la chambre de spécimen (figure 6).
   2. Lorsque la chambre a atteint un vide élevé (environ 2 x 10 ^-6 mbar) et la scène a été refroidie à la température de l'azote liquide, éteindre la pompe, purger la chambre, et positionner les échantillons talons monté sur la table de l'échantillon le plus rapidement possible .
   3. Mettez la pompe, rétablir vide poussé, et utiliser des contrôles de la scène et de la température de bras électroniques pour ajuster la température de la table de l'échantillon à 100 ° C et de l'azote liquide directement sur le bras microtome et bring à la température de l'azote liquide.
2. Le processus de fracture
   1. Après la réalisation de vide élevé, une température de l'étage de -100 ° C et bras microtome à la température de l'azote liquide, ouvrir à distance le support double réplique de l'échantillon fracturation ainsi les spécimens sur les supports d'échantillon (gel fracture_movie1.mov).
   2. Dans le cas des échantillons destinés à la rupture suite à la gravure, l'utilisation d'une lame de rasoir maintenue dans un dispositif de serrage sur le bras microtome à raser (à savoir, la rupture) de la surface des échantillons à la place de l'étape 3.2.1 (gel-etch_movie2.mov).
   3. Si l'étape de gravure par congélation est ajouté à réaliser, positionner le bras microtome refroidi sur les surfaces de rupture de l'une à plusieurs minutes. NOTE: Cette manœuvre sera sublime (c'est à dire, gravure) de l'eau de la surface fracturée. L'effet de cette manoeuvre est de révéler de véritables surfaces de cellules, la matrice extracellulaire et / ou d'assemblages moléculaires par sublimation de l'eau, en plus de framage faces traversant la bicouche lipidique des membranes.
3. observation de métal et le soutien de réplique évaporation en utilisant des canons à électrons
   1. Activer le pistolet platine / électronique de carbone ou de la résistance et laisser évaporer une couche mince (environ 2 nm) de platine / carbone sur la surface fracturée d'un angle de 30 ° - 45 °. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec.
   2. Activez l'électron de carbone ou de la résistance pistolet comme à l'étape 3.3.1 et évaporer une mince couche de carbone à la surface de l'échantillon fracturé directement à la verticale (90 °) à apporter un soutien à la réplique. Cela nécessite généralement environ à 15 - 20 sec.
4. Récupération des répliques
   1. À la fin de la réplication observation et la stabilisation de carbone, éteignez la pompe à vide, évacuation de la chambre, et supprimer le spécimen de montage de l'instrument.
   2. En utilisant une paire de pinces fines de qualité supprimer chaque talon de modèle d'or de la doubleréplique livret / pince et laisser décongeler pendant plusieurs secondes avant de baisser légèrement le talon sur une surface de l'eau dans une plaque de place (Figure 7). REMARQUE: La réplique de carbone / platine contenant du matériau d'échantillon adhérent flottera sur la surface de l'eau.
   3. Manœuvrer les répliques à l'aide soit d'une boucle de fil fin ou d'une grille de microscope électronique de cuivre conventionnelle tenue par une pince de qualité fine et le transfert à une autre plaque spot contenant du dichromate de sodium à 5% dans de l'acide sulfurique à 50% pour une à plusieurs heures. NOTE: Ce bain digère la matière de l'échantillon biologique réelle de la réplique. Pleine force de Javel peut être remplacé par la solution d'acide dichromate / sulfurique.
   4. Lorsque la digestion est terminée, de transférer la réplique à une surface arrière de l'eau propre et récupérer sur une grille de microscopie électronique en cuivre standard. (REMARQUE: Les répliques peuvent se fragmenter en petits morceaux lors de la digestion, mais même de très petites répliques peut contenir des informations importantes et devrait être retrieved et examiné.) magasin réplique soutenir les réseaux disponibles dans le commerce en cases de la grille où ils resteront stables pendant des années avec une manipulation en douceur.

4. ultrastructurale examen de cryofracture / Répliques de gravure

1. Voir répliques dans un microscope électronique en transmission à une tension d'accélération typiquement de 50 à 80 kV.
2. Enregistrer des images pertinentes sur le film de TEM standard ou avec un appareil photo numérique haute résolution.

Résultats

Le principe clé de cryofracture l'interprétation des images est que des plans de fracture traversent la bicouche lipidique des membranes donnant deux faces de rupture, appelé par convention, le PF-face (plasma fracture-face) et EF-face (extracellulaire fracture-face) (Figure 3). Le PF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacente au cytoplasme de la cellule et l'EF-face est la moitié de la membrane bicouche lipidique adjacent au milieu extracellulaire. La technique de cong?...

Discussion

Dans les années suivantes de son introduction et la disponibilité commerciale, la lyophilisation fracture / procédures de gravure ont été largement utilisés pour les enquêtes de structure de la membrane biologique. En effet, les meilleurs points de vue de certains des spécialisations structurales de membranes ont été obtenus dans des préparations cryofracture / gravure. Ces études ont contribué non seulement à la compréhension de l'organisation structurale des membranes, mais aussi fourni des indicati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
standard aldehyde fixatives	various suppliers
sodium dichromate	various suppliers
sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Freon	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.