הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

Summary

תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.

Abstract

BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.

Introduction

נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל.

המופק ממוח גורם neurotrophic (BDNF), חבר של משפחת neurotrophin של גורמי גדילה, הוא בהווה בmaאזורי ניו יורק במוח, כולל ההיפוקמפוס, קליפת מוח, ומוח קדמי בסיסי. BDNF ממלא תפקיד מכריע בהיווצרות הכרה וזיכרון על ידי תמיכה בהישרדות, בידול, והתפקוד של תאי עצב המשתתפים במעגלים קוגניטיביים. BDNF נקשר לקולטן שלו, TrkB טירוזין קינאז, במסוף האקסון שבו מפעיל מסלולי איתות בתיווך TrkB כוללים חלבון קינאז מופעל mitogen / קינאז תאי מוסדר אות החלבון (MAPK / Erk), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ופוספוליפאז C-gamma (PLCγ). החלבונים המשתתפים במסלולי איתות אלה ארוזים על גבי מבני לפוחי endocytic כדי ליצור את BDNF / TrkB איתות endosome ^1-6 שלאחר מכן הובל retrogradely לסומה העצבית.

חדר תרבות microfluidic הוא פלטפורמה מאוד שימושית לחקר הביולוגיה axonal בתנאים רגילים, כמו גם בהגדרה של ^7,8 פציעה והמחלה. על ידי אקסונים בידודמהגופים התא, המכשיר אפשר אחד ללמוד תחבורה במיוחד באקסונים ^8-10. פלטפורמות microfluidic מבוססות PDMS עם 450 מיקרומטר מחסומי microgroove שימשו במחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון תחבורת BDNF, שפיתחנו טכנולוגיה חדשנית לייצור BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). אנחנו ניצלנו את הפפטיד acceptor ביוטין, AP (הידוע גם בAviTag). זה רצף חומצות אמינו המכיל 15 שאריות ליזין שניתן ligated במיוחד כדי ביוטין על ידי האנזים Escherichia coli ביוטין האנזים, בירה. אנחנו התמזגו AviTag לC-הסופי של העכבר מראש proBDNF cDNA על ידי PCR (איור 1 א). המבנה שובט לתוך וקטור הביטוי של יונקים, myc-וקטור pcDNA3.1. אנחנו גם משובטים DNA בירה החיידקים לתוך myc-וקטור pcDNA3.1. שני פלסמידים היו זמניים במשותף transfected לתאי HEK293FT לבטא שני החלבונים. בירה הייתה זרז לקשירה של ביובאופן ספציפי ליזין מתגורר בתוך AviTag בC-הסופי של BDNF ב1: 1 יחס לתוצרת monobiotinylated מונומר BDNF. Biotinylated, להתבגר BDNF עם מסה מולקולרית של ~ 18 kDa היה התאושש ומטוהר מהתקשורת באמצעות Ni-שרף (איור 1 ג). Biotinylation של BDNF היה מלא, כמו להישפט על ידי חוסר היכולת לזהות BDNF ללא שינוי על ידי immunoblotting (1D איור). נקודות streptavidin מצומדות קוונטים, QD 655, שמשו לתייג mBtBDNF לעשות QD-BDNF. הנוכחות של AviTag לא להפריע לפעילות של BDNF כmBtBDNF הייתה מסוגלת להפעיל TrkB פוספורילציה (איור 1E) ולעורר תולדת neurite (איור 1F) בהיקף של BDNF רקומביננטי האנושי (rhBDNF). Immunostaining הראה כי QD-BDNF colocalized עם TrkB באקסונים בהיפוקמפוס, המצביע על כך QD-BDNF הוא ביו (איור 1G). ללמוד תחבורת BDNF, QD-BDNF התווסף לתא האקסון הדיסטלי שלתרבויות microfluidic מכילות חולדה נוירונים בהיפוקמפוס (איור 2 א) E18. תחבורה מדרדר QD-BDNF בתוך האקסונים נתפסה על ידי הדמיה חיה בזמן אמת של תג הניאון האדום (S1 תמיכת קטעי וידאו, S2). על ידי ניתוח רשם גלים שנוצרו, QD-BDNF נצפה להיות מועבר retrogradely במהירות מרגשת של כ 1.06 מיקרומטר / sec (איור 3 א). GFP או BDNF מתויג mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF. החסרונות העיקריים הם שהם לא בהירים מספיק ללימודי מולקולה בודדים. כמו כן, הנוכחות של שני אנטרוגדית ותנועות BDNF המדרדר עושה את זה קשה להעריך האם או לא BDNF מועבר retrogradely היה במתחם neurotrophin / קולט.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי. Ultrabrightness וphotostability מצוין של Mak נקודות קוונטיותes זה ניתן לבצע מעקב ארוך טווח של תחבורת BDNF. ניתן לנצל את הטכניקות הללו כדי לשפר את הלימודים של פונקצית axonal בספירה, HD, והפרעות ניווניות אחרות.

Protocol

הליכים כירורגיים ובעלי החיים מתבצעים אך ורק על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. כל הניסויים בתחום השימוש בבעלי החיים אושרו על ידי UCSD המוסדי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

.1 פלסמיד שיבוט, ביטוי וטיהור של BDNF biotinylated-Mono (mBtBDNF)

הערה: לבנות מראש proBDNFavi והבירה cDNA לתוך וקטור pcDNA3.1 וcoexpress בתאי HEK293FT ^10. לטהר mBtBDNF באמצעות חרוזים Ni-נ.ת. ע על פי שיטה שפורסמה בעבר לייצר גורם בוגר ופעיל ביולוגי גדילה העצבית monobiotinylated (mBtNGF) ^10.

2 הכנת לשכות Microfluidic

מכשיר culturing נוירון microfluidic מאפשר לבודד את fluidically האקסונים מגופי תא נוירון. להרכיב תאים עם coverslips טרי מצופה נכון לפני כל נתיחה. תאי microfluidic משמשיםבפרוטוקול זה נרכש באופן מסחרי (ראה חומרים ושולחן של הציוד). כביסה ביד ותאים לרכוש מסחרי לשימוש חוזר עד 5-6x.

1. לשטוף ידיים תאי microfluidic ב1% Alconox. לשטוף שלוש פעמים עם מים מילי- Q ל30 דקות כל אחד. תאים לשטוף ידיים שוב ב70% אתנול.
2. להוציא תאים לייבוש על Parafilm בזרימה למינרית. להקרין ולעקר את שני הצדדים של התאים עבור 20 דקות תחת UV. חנות מעוקרת תאים בצלחת 15 סנטימטר סטרילי החתומה עם Parafilm בטמפרטורת חדר.
3. הנח 24 x 40 coverslips מ"מ זכוכית מס '1 במכל זכוכית. משרים את coverslips ב35% חומצת hydrochloride לילה על הכתף. ביום למחרת, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ל30 דקות כל אחד עם מים.
4. לעקר את coverslips אחד אחד על ידי טבילת כל coverslip ל100% אתנול ובוער מעל מבער בונזן. אחסן coverslips היבש בצלחת פטרי סטרילית ולשמור אותו בטמפרטורת חדר עד ציפוי.
5. הנח out coverslips בצלחת תרבות 15 סנטימטר. מעיל כל coverslip עם 0.7 מ"ל של 0.01% פולי-L-ליזין (PLL) ו דגירה במכסת המנוע בטמפרטורת חדר.
6. אחרי שעה 1, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם מים סטריליים. coverslips יבש עם ואקום ומקום כל coverslip לתוך צלחת תרבות 6 סנטימטר.
7. כדי להרכיב את תא microfluidic, למקם את החדר עם צד microgroove בתחתית על coverslip המצופה PLL בזהירות לא לגעת בmicrogrooves. לחץ בעדינות את התא עם קצה פיפטה כדי להבטיח את התא היה סגור היטב.

.3 Dissection עצבי תרבות ופלייט על צ'יימברס

1. מניחים שתי hippocampi E17-E18 חולדה (מוח אחד) גזור בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל חיץ דיסקציה (HBSS, אין סידן, לא מגנזיום, עם 1% עט / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ"מ. שוטפים את הרקמות 3x עם 5 מ"ל נתיחת חיץ בכל פעם. הסר את החוצץ לנתיחה ככל האפשר ולהוסיף 900 ​​μl של di הטריחיץ ssection.
2. כדי לעכל את הרקמה, להוסיף של 10x טריפסין (2.5%) 100 μl למאגר לנתיחה כדי להפוך את ריכוז העבודה 1x. מניחים את צינור חרוטי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של עיכול, להוסיף 10 מ"ג / מ"ל ​​DNase אני 100 μl לריכוז סופי סביב 1 מ"ג / מ"ל.
3. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר אש מלוטשת, בעדינות triturate הרקמות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x. מייד לאחר טחינה דקה, להרוות את טריפסין עם 2 מ"ל ציפוי בינוני (Neurobasal עם 10% FBS, 2 מ"מ Glutamax, B27 2%).
4. השאר את המדגם במכסת המנוע למשך 5 דקות כדי לאפשר לכל פסולת של הרקמות להתיישב לתחתית. מוציא בזהירות 2 מ"ל של supernatant לתוך צינור נקי סטרילי 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend גלולה ב50 תקשורת μl ציפוי
5. ספירת התאים עם hemocytometer. עומס 15-20 השעיה μl תא (~ 40,000 תאים) לתוך תא אחד של חדר microfluidic. מניחים את החדרבחממה במשך 10 דקות, כדי לאפשר לתאים לצרף לcoverslip. לאחר 10 דקות, להוסיף מדיה ציפוי יותר כדי למלא את שני התאים של החדר.
6. ביום השני של נתיחה, להחליף לחלוטין את תקשורת הציפוי עם תקשורת תחזוקה (Neurobasal עם 2 מ"מ Glutamax, B27 2%) בשני גוף התא ותא האקסון. האקסונים מתאי העצב בהיפוקמפוס להתחיל לחצות את microgrooves ביום 3 ולהגיע לתא האקסון בין היום 5-7. בתקופה זו של זמן, להחליף מחצית תקשורת culturing עם תקשורת תחזוקה טריות בכל שעה 24 ~ 48.

.4 Axonal תחבורה של QD-BDNF

1. לפני גר הדמיה תחבורת axonal QD-BDNF, לרוקן BDNF משני גוף התא והאקסון תאים של חדר microfluidic על ידי ביסודיות לשטוף את שני התאים עם תקשורת BDNF ללא, סרום חופשית Neurobasal כל 30 דקות לשעה 2.
2. במהלך דלדול BDNF, להכין conjugates QD-BDNF. מערבבים 50 ננומטר של BD מונו biotinylatedדימר NF עם 50 conjugates QD655-streptavidin ננומטר בתקשורת neurobasal ולדגור על קרח למשך 60 דקות.
3. הסר את המדיה בתא האקסון ולהוסיף 300 μl QD-BDNF עם ריכוז סופי של 0.25 ננומטר במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס. כדי למזער את לשדר של QD-BDNF לתוך תא גוף תא, זה מאוד חשוב תמיד לשמור על רמה גבוהה יותר של תקשורת בתא גוף תא מאשר בתא האקסון. לשטוף QD-BDNF מאוגד לאחר דגירה לפני ההדמיה לחיות.
4. לבצע הדמיה חיה של תחבורת QD-BDNF באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בעדשה אובייקטיבית שמן 100X. לחמם את ההיקף והתא הסביבתי קשור אליו לטמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס) וCO ₂ (5%). השתמש בסט של קוביות עירור / פליטה האדומה טקסס כדי להמחיש את אות QD655.
5. לרכוש וללכוד זמן לשגות תמונות בתוך האקסונים האמצע במהירות של 1 מסגרת / שנייה עבור הסכום כולל של 2 דקות באמצעות מצלמת CCD. microgrooves שימוש ללא האקסונים thaלא צריכים שום QD ולכן אין אות כביקורת לחדירה.
6. לנתח תחבורת BDNF באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה או NIH ImageJ.

תוצאות

ייצור וטיהור של BDNF מונו biotinylated פעיל ביולוגית

וקטור הביטוי של BDNF התמזגו עם רצף AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) נוצר על פי פרוטוקול שפורסם בעבר ^10. המסה המולקולרית של חלבון היתוך באורך המלא הייתה צפויה להיות ~ 32V kDa

Discussion

במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101