Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.

Abstract

BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.

Introduction

נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל.

המופק ממוח גורם neurotrophic (BDNF), חבר של משפחת neurotrophin של גורמי גדילה, הוא בהווה בmaאזורי ניו יורק במוח, כולל ההיפוקמפוס, קליפת מוח, ומוח קדמי בסיסי. BDNF ממלא תפקיד מכריע בהיווצרות הכרה וזיכרון על ידי תמיכה בהישרדות, בידול, והתפקוד של תאי עצב המשתתפים במעגלים קוגניטיביים. BDNF נקשר לקולטן שלו, TrkB טירוזין קינאז, במסוף האקסון שבו מפעיל מסלולי איתות בתיווך TrkB כוללים חלבון קינאז מופעל mitogen / קינאז תאי מוסדר אות החלבון (MAPK / Erk), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ופוספוליפאז C-gamma (PLCγ). החלבונים המשתתפים במסלולי איתות אלה ארוזים על גבי מבני לפוחי endocytic כדי ליצור את BDNF / TrkB איתות endosome 1-6 שלאחר מכן הובל retrogradely לסומה העצבית.

חדר תרבות microfluidic הוא פלטפורמה מאוד שימושית לחקר הביולוגיה axonal בתנאים רגילים, כמו גם בהגדרה של 7,8 פציעה והמחלה. על ידי אקסונים בידודמהגופים התא, המכשיר אפשר אחד ללמוד תחבורה במיוחד באקסונים 8-10. פלטפורמות microfluidic מבוססות PDMS עם 450 מיקרומטר מחסומי microgroove שימשו במחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון תחבורת BDNF, שפיתחנו טכנולוגיה חדשנית לייצור BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). אנחנו ניצלנו את הפפטיד acceptor ביוטין, AP (הידוע גם בAviTag). זה רצף חומצות אמינו המכיל 15 שאריות ליזין שניתן ligated במיוחד כדי ביוטין על ידי האנזים Escherichia coli ביוטין האנזים, בירה. אנחנו התמזגו AviTag לC-הסופי של העכבר מראש proBDNF cDNA על ידי PCR (איור 1 א). המבנה שובט לתוך וקטור הביטוי של יונקים, myc-וקטור pcDNA3.1. אנחנו גם משובטים DNA בירה החיידקים לתוך myc-וקטור pcDNA3.1. שני פלסמידים היו זמניים במשותף transfected לתאי HEK293FT לבטא שני החלבונים. בירה הייתה זרז לקשירה של ביובאופן ספציפי ליזין מתגורר בתוך AviTag בC-הסופי של BDNF ב1: 1 יחס לתוצרת monobiotinylated מונומר BDNF. Biotinylated, להתבגר BDNF עם מסה מולקולרית של ~ 18 kDa היה התאושש ומטוהר מהתקשורת באמצעות Ni-שרף (איור 1 ג). Biotinylation של BDNF היה מלא, כמו להישפט על ידי חוסר היכולת לזהות BDNF ללא שינוי על ידי immunoblotting (1D איור). נקודות streptavidin מצומדות קוונטים, QD 655, שמשו לתייג mBtBDNF לעשות QD-BDNF. הנוכחות של AviTag לא להפריע לפעילות של BDNF כmBtBDNF הייתה מסוגלת להפעיל TrkB פוספורילציה (איור 1E) ולעורר תולדת neurite (איור 1F) בהיקף של BDNF רקומביננטי האנושי (rhBDNF). Immunostaining הראה כי QD-BDNF colocalized עם TrkB באקסונים בהיפוקמפוס, המצביע על כך QD-BDNF הוא ביו (איור 1G). ללמוד תחבורת BDNF, QD-BDNF התווסף לתא האקסון הדיסטלי שלתרבויות microfluidic מכילות חולדה נוירונים בהיפוקמפוס (איור 2 א) E18. תחבורה מדרדר QD-BDNF בתוך האקסונים נתפסה על ידי הדמיה חיה בזמן אמת של תג הניאון האדום (S1 תמיכת קטעי וידאו, S2). על ידי ניתוח רשם גלים שנוצרו, QD-BDNF נצפה להיות מועבר retrogradely במהירות מרגשת של כ 1.06 מיקרומטר / sec (איור 3 א). GFP או BDNF מתויג mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF. החסרונות העיקריים הם שהם לא בהירים מספיק ללימודי מולקולה בודדים. כמו כן, הנוכחות של שני אנטרוגדית ותנועות BDNF המדרדר עושה את זה קשה להעריך האם או לא BDNF מועבר retrogradely היה במתחם neurotrophin / קולט.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי. Ultrabrightness וphotostability מצוין של Mak נקודות קוונטיותes זה ניתן לבצע מעקב ארוך טווח של תחבורת BDNF. ניתן לנצל את הטכניקות הללו כדי לשפר את הלימודים של פונקצית axonal בספירה, HD, והפרעות ניווניות אחרות.

Protocol

הליכים כירורגיים ובעלי החיים מתבצעים אך ורק על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. כל הניסויים בתחום השימוש בבעלי החיים אושרו על ידי UCSD המוסדי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

.1 פלסמיד שיבוט, ביטוי וטיהור של BDNF biotinylated-Mono (mBtBDNF)

הערה: לבנות מראש proBDNFavi והבירה cDNA לתוך וקטור pcDNA3.1 וcoexpress בתאי HEK293FT 10. לטהר mBtBDNF באמצעות חרוזים Ni-נ.ת. ע על פי שיטה שפורסמה בעבר לייצר גורם בוגר ופעיל ביולוגי גדילה העצבית monobiotinylated (mBtNGF) 10.

2 הכנת לשכות Microfluidic

מכשיר culturing נוירון microfluidic מאפשר לבודד את fluidically האקסונים מגופי תא נוירון. להרכיב תאים עם coverslips טרי מצופה נכון לפני כל נתיחה. תאי microfluidic משמשיםבפרוטוקול זה נרכש באופן מסחרי (ראה חומרים ושולחן של הציוד). כביסה ביד ותאים לרכוש מסחרי לשימוש חוזר עד 5-6x.

  1. לשטוף ידיים תאי microfluidic ב1% Alconox. לשטוף שלוש פעמים עם מים מילי- Q ל30 דקות כל אחד. תאים לשטוף ידיים שוב ב70% אתנול.
  2. להוציא תאים לייבוש על Parafilm בזרימה למינרית. להקרין ולעקר את שני הצדדים של התאים עבור 20 דקות תחת UV. חנות מעוקרת תאים בצלחת 15 סנטימטר סטרילי החתומה עם Parafilm בטמפרטורת חדר.
  3. הנח 24 x 40 coverslips מ"מ זכוכית מס '1 במכל זכוכית. משרים את coverslips ב35% חומצת hydrochloride לילה על הכתף. ביום למחרת, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ל30 דקות כל אחד עם מים.
  4. לעקר את coverslips אחד אחד על ידי טבילת כל coverslip ל100% אתנול ובוער מעל מבער בונזן. אחסן coverslips היבש בצלחת פטרי סטרילית ולשמור אותו בטמפרטורת חדר עד ציפוי.
  5. הנח out coverslips בצלחת תרבות 15 סנטימטר. מעיל כל coverslip עם 0.7 מ"ל של 0.01% פולי-L-ליזין (PLL) ו דגירה במכסת המנוע בטמפרטורת חדר.
  6. אחרי שעה 1, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם מים סטריליים. coverslips יבש עם ואקום ומקום כל coverslip לתוך צלחת תרבות 6 סנטימטר.
  7. כדי להרכיב את תא microfluidic, למקם את החדר עם צד microgroove בתחתית על coverslip המצופה PLL בזהירות לא לגעת בmicrogrooves. לחץ בעדינות את התא עם קצה פיפטה כדי להבטיח את התא היה סגור היטב.

.3 Dissection עצבי תרבות ופלייט על צ'יימברס

  1. מניחים שתי hippocampi E17-E18 חולדה (מוח אחד) גזור בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל חיץ דיסקציה (HBSS, אין סידן, לא מגנזיום, עם 1% עט / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ"מ. שוטפים את הרקמות 3x עם 5 מ"ל נתיחת חיץ בכל פעם. הסר את החוצץ לנתיחה ככל האפשר ולהוסיף 900 ​​μl של di הטריחיץ ssection.
  2. כדי לעכל את הרקמה, להוסיף של 10x טריפסין (2.5%) 100 μl למאגר לנתיחה כדי להפוך את ריכוז העבודה 1x. מניחים את צינור חרוטי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של עיכול, להוסיף 10 מ"ג / מ"ל ​​DNase אני 100 μl לריכוז סופי סביב 1 מ"ג / מ"ל.
  3. בעזרת פיפטה זכוכית פסטר אש מלוטשת, בעדינות triturate הרקמות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x. מייד לאחר טחינה דקה, להרוות את טריפסין עם 2 מ"ל ציפוי בינוני (Neurobasal עם 10% FBS, 2 מ"מ Glutamax, B27 2%).
  4. השאר את המדגם במכסת המנוע למשך 5 דקות כדי לאפשר לכל פסולת של הרקמות להתיישב לתחתית. מוציא בזהירות 2 מ"ל של supernatant לתוך צינור נקי סטרילי 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend גלולה ב50 תקשורת μl ציפוי
  5. ספירת התאים עם hemocytometer. עומס 15-20 השעיה μl תא (~ 40,000 תאים) לתוך תא אחד של חדר microfluidic. מניחים את החדרבחממה במשך 10 דקות, כדי לאפשר לתאים לצרף לcoverslip. לאחר 10 דקות, להוסיף מדיה ציפוי יותר כדי למלא את שני התאים של החדר.
  6. ביום השני של נתיחה, להחליף לחלוטין את תקשורת הציפוי עם תקשורת תחזוקה (Neurobasal עם 2 מ"מ Glutamax, B27 2%) בשני גוף התא ותא האקסון. האקסונים מתאי העצב בהיפוקמפוס להתחיל לחצות את microgrooves ביום 3 ולהגיע לתא האקסון בין היום 5-7. בתקופה זו של זמן, להחליף מחצית תקשורת culturing עם תקשורת תחזוקה טריות בכל שעה 24 ~ 48.

.4 Axonal תחבורה של QD-BDNF

  1. לפני גר הדמיה תחבורת axonal QD-BDNF, לרוקן BDNF משני גוף התא והאקסון תאים של חדר microfluidic על ידי ביסודיות לשטוף את שני התאים עם תקשורת BDNF ללא, סרום חופשית Neurobasal כל 30 דקות לשעה 2.
  2. במהלך דלדול BDNF, להכין conjugates QD-BDNF. מערבבים 50 ננומטר של BD מונו biotinylatedדימר NF עם 50 conjugates QD655-streptavidin ננומטר בתקשורת neurobasal ולדגור על קרח למשך 60 דקות.
  3. הסר את המדיה בתא האקסון ולהוסיף 300 μl QD-BDNF עם ריכוז סופי של 0.25 ננומטר במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס. כדי למזער את לשדר של QD-BDNF לתוך תא גוף תא, זה מאוד חשוב תמיד לשמור על רמה גבוהה יותר של תקשורת בתא גוף תא מאשר בתא האקסון. לשטוף QD-BDNF מאוגד לאחר דגירה לפני ההדמיה לחיות.
  4. לבצע הדמיה חיה של תחבורת QD-BDNF באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בעדשה אובייקטיבית שמן 100X. לחמם את ההיקף והתא הסביבתי קשור אליו לטמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס) וCO 2 (5%). השתמש בסט של קוביות עירור / פליטה האדומה טקסס כדי להמחיש את אות QD655.
  5. לרכוש וללכוד זמן לשגות תמונות בתוך האקסונים האמצע במהירות של 1 מסגרת / שנייה עבור הסכום כולל של 2 דקות באמצעות מצלמת CCD. microgrooves שימוש ללא האקסונים thaלא צריכים שום QD ולכן אין אות כביקורת לחדירה.
  6. לנתח תחבורת BDNF באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה או NIH ImageJ.

תוצאות

ייצור וטיהור של BDNF מונו biotinylated פעיל ביולוגית

וקטור הביטוי של BDNF התמזגו עם רצף AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) נוצר על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 10. המסה המולקולרית של חלבון היתוך באורך המלא הייתה צפויה להיות ~ 32V kDa

Discussion

במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות ...

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ליואה (פאולין) הו, רחל Sinit לקבלת הסיוע הטכני שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק NIH (EY016525 PN2) ועל ידי מימון מחקר תסמונת דאון וטיפול הקרן ולארי L. Hillblom הקרן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NameCompanyCatalog Number
Platinum pfx DNA polymerase Invitrogen11708021
EcoRI FermentasFD0274
BamHI FermentasFD0054
HEK293FT cellsInvitrogenR70007
DMEM-high glucose mediaMediatech10-013-CV
d-biotin SigmaB4639
TurboFect FermentasR0531
PMSF  SigmaP7626
aprotininSigmaA6279
Ni-NTA resinsQiagen30250
protease inhibitors cocktailSigma S8820
silver staining kit G-Biosciences786-30
human recombinant BDNFGenentech
Microfluidic chambersXonaSND450
24x40 mm No. 1 glass coverslips VWR48393-060
poly-L-Lysine Cultrex3438-100-01
HBSSGibco14185-052
DNase IRoche10104159001
TrypsinGibco15090-046
Neurobasal Gibco21103-049
FBS Invitrogen16000-044
GlutaMax Invitrogen35050-061
B27  Gibco17504-044
QD655-streptavidin conjugatesInvitrogen Q10121MP
anti-Avi tag antibodyGenScriptA00674
streptavidin-agarose beads Life Technology SA100-04
trichloroacetic acidSigmaT6399
HRP-streptavidin Thermo ScientificN100
anti-pTrkB antibodya generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibodyBD Science610101

References

  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience91BDNFaxonalmicrofluidic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved