В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах

Резюме

Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.

Аннотация

BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.

Введение

Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть проведена через расстояния более 1000 раз больше диаметра тела клетки, возможность легко Предполагается, что даже незначительный дефицит может заметно повлиять нейронов и схемы функцию.

Головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), член нейротрофина семейства факторов роста, присутствует в мАNY области мозга, в том числе гиппокампа, коры головного мозга, и базальных отделах переднего мозга. BDNF играет решающую роль в формировании познания и памяти, поддерживая выживание, дифференциацию и функцию нейронов, которые участвуют в познавательных схем. BDNF связывается со своим рецептором, в тирозин-киназы TrkB, в аксона, где он активирует TrkB-опосредованного пути передачи сигналов, включая митоген активированной протеинкиназы / внеклеточной регулируемой протеинкиназы (МАРК / ERK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и фосфолипаза С-гамма (PLCγ). Белки, которые участвуют в этих сигнальных путей упакованы на эндоцитотических везикулярного структур для формирования BDNF / TrkB эндосомы ^1-6, которые затем ретроградно транспортируется к нейронов сомы сигнализации.

Микрожидкостных культура камера представляет собой очень удобную платформу для изучения аксонов биологию в нормальных условиях, а также при установлении травм и болезней, ^7,8. По изолирующих аксоновот клеточных тел, устройство позволило изучить транспорт специально в аксонов ^8-10. В основе PDMS микрожидкостных платформы с 450 мкм Microgroove барьеров, используемых в данном исследовании были коммерчески купил (см таблицу материалы). Чтобы изучить BDNF транспорт, мы разработали новую технологию для производства monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Мы воспользовались биотин акцепторной пептида, AP (также известный как AviTag). Это последовательность кислоты в 15 аминокислотных который содержит остаток лизина, которые могут быть специально лигировали с биотином по кишечной палочки фермент, биотин-лигазы, Бира. Мы слиты с AviTag к С-концу мыши предварительно proBDNF кДНК с помощью ПЦР (фиг.1А). Конструкцию клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, pcDNA3.1 MYC-вектора его. Мы также клонировали бактериальную ДНК Бира в pcDNA3.1 Мус-его вектора. Два плазмиды временно совместно трансфицировали в клетки HEK293FT выразить как белки. Бира катализирует перевязка БиоВ частности, в лизина находятся в пределах AviTag на С-конце ФРГМ в соотношении 1: 1, с получением monobiotinylated BDNF мономера. Биотинилированное, зрелые BDNF с молекулярной массой ~ 18 кДа был восстановлен и очищен от СМИ с использованием Ni-смолу (Рисунок 1в). Биотинилирование BDNF была завершена, о чем судили по невозможности обнаружить без изменений BDNF с помощью иммуноблоттинга (Фигура 1D). Стрептавидином сопряженных квантовых точек, QD 655, были использованы для обозначения mBtBDNF сделать КТ-BDNF. Наличие AviTag не вмешиваться в деятельность BDNF как mBtBDNF смог активировать фосфорилированную TrkB (Рисунок 1E) и стимулировать рост аксонов (Рисунок 1F) в той мере, рекомбинантного человеческого BDNF (rhBDNF). Иммуноокрашивание показали, что КТ-BDNF локализуется с TrkB в гиппокампа аксонов, указывая, что QD-BDNF является биологически активным (Рисунок 1G). Для изучения BDNF транспорта, КТ-ФРГМ был добавлен в дистальном отделе аксоновмикрофлюидных культуры, содержащие крысы E18 нейронов гиппокампа (рисунок 2А). QD-BDNF ретроградного транспорта в аксонов был захвачен в реальном времени живого изображения красной флуоресцентной метки (Поддержка видео S1, S2). Анализируя кимографе сгенерированный, QD-BDNF наблюдалось транспортировать ретроградно по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек (Рисунок 3А). GFP или mCherry-меченый BDNF были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF. Основные недостатки в том, что они не являются достаточно ярким для единичных исследований молекул. Кроме того, присутствие обоих антероградной и ретроградных движений BDNF делает его трудно оценить, был ли ретроградно транспортируется BDNF в комплексе нейротрофин / рецептор.

В этом видео мы продемонстрируем методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов. Ultrabrightness и отлично фотостабильность квантовых точек макES можно выполнять долгосрочное отслеживание BDNF транспорта. Эти методы могут быть использованы для повышения исследования аксонов функции в AD, HD, и других нейродегенеративных расстройств.

протокол

Хирургические и животных процедуры проводятся строго в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Все эксперименты, связанные с использованием животных утверждаются UCSD Уходу за животными и использованию комитета.

1 плазмиды Клонирование, экспрессия и очистка Mono-биотинилированного BDNF (mBtBDNF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Построить предварительный proBDNFavi и Бира кДНК в pcDNA3.1 вектора и coexpress в HEK293FT ячеек ^10. Очищают mBtBDNF использованием бисера Ni-NTA соответствии с ранее опубликованной способа получения зрелой и биологически активный фактор роста monobiotinylated нерва (mBtNGF) ^10.

2 Получение микрофлюидных палат

Микрожидкостных нейрон культивирование устройство позволяет гидравлически изолировать аксоны от нейронов клеточных тел. Соберите камеры с покровные недавно покрытых прямо перед каждой вскрытия. Микрожидкостных камеры, используемыев этом протоколе коммерчески купил (см материалы и таблицы оборудования к). Ручная стирка и повторно использованы коммерчески приобретенные камеры до 5-6x.

1. Ручная стирка микрофлюидных камеры в 1% Alconox. Промыть три раза Milli-Q воды в течение 30 мин каждый. Руки мыть Камеры снова в 70% этанола.
2. Выложите камеры для просушки на парафильмом в ламинарном боксе. Radiate и стерилизовать обе стороны камер в течение 20 мин при УФ. Магазин стерилизуют камеры в стерильной 15-см чашку герметичной парафильмом при комнатной температуре.
3. Поместите 24 х 40 мм № 1 покровные стекла в стеклянной таре. Замочите покровные в 35% соляной кислоты в течение ночи на ротатора. На следующий день, промыть покровные три раза в течение 30 мин каждый с водой.
4. Стерилизовать покровные один за другим погружением каждый покровное в 100% этанола и пылающий над горелкой Бунзена. Хранить сухие покровные в стерильную чашку Петри и держать его при комнатной температуре до тех пор, покрытие.
5. Положите НУт покровные в 15 см блюдо культуры. Шерсть каждого покровное с 0,7 мл 0,01% поли-L-лизин (PLL) и инкубируют в шкафу при комнатной температуре.
6. После 1 ч, промыть покровные три раза стерильной водой. Сухие покровные с вакуумом и место каждого покровного в 6 см блюдо культуры.
7. Чтобы собрать микрофлюидных камеру, разместить камеру с Microgroove стороне в нижней на покрытые покровным PLL с осторожностью, чтобы не коснуться микродорожек. Осторожно нажатой в камеру с наконечником пипетки, чтобы обеспечить камера плотно закрытыми.

3 Рассечение нейронов культуры и плиты на палат

1. Поместите два E17-E18 крысы гиппокампа (один мозга) расчлененные в 15 мл коническую пробирку, содержащую 2 мл рассечение буфера (HBSS, ни кальций, ни магний, с 1% пера / стрептококк и 10 мМ HEPES. Промыть ткани 3x с 5 мл рассечение буфера каждый раз. Удалить буфер рассечение, насколько это возможно, и добавить 900 мкл свежей диssection буфера.
2. Чтобы переварить ткани, добавить 100 мкл 10x трипсина (2,5%) в буфер рассечение сделать 1x рабочую концентрацию. Поместите коническую трубку в водяной бане при 37 °. Через 10 мин пищеварения, добавьте 100 мкл 10 мг / мл ДНКазы I до конечной концентрации около 1 мг / мл.
3. Использование огневой полировкой Пастер стеклянную пипетку, мягко растирают ткани с помощью пипетки вверх и вниз в 5-10 раз. Сразу после растирания, утолить трипсина с 2 мл обшивки среды (Neurobasal с 10% FBS, 2 мМ Glutamax, 2% B27).
4. Оставьте образец в капот в течение 5 мин, чтобы позволить любой мусор тканей поселиться на дно. Тщательно удалить 2 мл надосадочной жидкости в чистую стерильную 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин для осаждения клеток. Ресуспендируют гранул в 50 мкл покрытие СМИ
5. Граф клеток с гемоцитометре. Нагрузка 15-20 мкл клеточной суспензии (~ 40000 клеток) в один отсек микрожидкостной камеры. Поместите камерув инкубаторе в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к покровное. Через 10 мин, добавить больше обшивки СМИ пополнить обе отсеков камеры.
6. На второй день вскрытия, полностью заменить обшивки сред обслуживания средств массовой информации (Neurobasal 2 мМ Glutamax, 2% B27) как в теле клетки и аксона отсеке. Аксоны от нейронов гиппокампа начинают пересекать микродорожек в день 3 и достичь аксонов отсек между днем ​​5-7. В течение этого периода времени, вместо половины из культуральной среды с пресной обслуживания средств массовой информации каждые 24 ~ 48 час.

4 аксонов Перевозка QD-BDNF

1. До жить визуализации КТ-BDNF аксонов транспорта, истощают BDNF как от тела клетки и аксонов отсеках микрожидкостной камере тщательно промыть оба отсека с BDNF-бесплатно, сыворотки свободных СМИ Neurobasal каждые 30 мин в течение 2 часов.
2. Во время истощения BDNF, получения конъюгатов QD-BDNF. Смешайте 50 нМ моно-биотинилированное BDNF димера с 50 нм QD655-стрептавидин конъюгатов в Neurobasal массовой информации и инкубируют на льду в течение 60 мин.
3. Удалить носитель в отсеке аксонов и добавить 300 мкл QD-BDNF с конечной концентрацией 0,25 нМ в течение 4 ч при 37 ° С. Чтобы свести к минимуму диффундирующего из КТ-BDNF в тело клетки отсека, это очень важно, чтобы всегда поддерживать высокий уровень массовой информации в теле клетки отсеке, чем в аксона отсеке. Смыть несвязанного QD-BDNF после инкубации до живого изображения.
4. Провести Живая съемка QD-BDNF транспорта с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного нефти объектива 100X. Разминка сферу и окружающую камеру, прикрепленную к ней до постоянной температуры (37 ° C) и СО ₂ (5%). Используйте набор Texas кубов красного возбуждения / эмиссии визуализировать сигнал QD655.
5. Приобретать и захватить покадровой изображения в пределах средних аксонов со скоростью 1 кадр / сек в общей сложности 2 мин с использованием ПЗС-камеры. Используйте микродорожек с не аксонов тхат не имеют QD и, следовательно, отсутствие сигнала в качестве контроля для инфильтрации.
6. Анализ BDNF транспорт с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений или NIH ImageJ.

Результаты

Получение и очистка биологически активных моно-биотинилированного BDNF

Вектор экспрессии BDNF слиты с последовательностью AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) был создан в соответствии с ранее опубликованным протоколом ^10. Молекулярная масса белка полной длины гибридного было предсказа?...

Обсуждение

В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
d-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
silver staining kit	G-Biosciences	786-30
human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24x40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101