一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

要約

BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。

要約

BDNFは、神経細胞の生存、分化、および機能のいくつかのファセットに重要な役割を果たしている。軸索における構造的および機能的障害は、ますますアルツハイマー病（AD）およびハンチントン病（HD）を含む神経変性疾患の早期の特徴とみなされる。未だ不明な軸索損傷が誘導される機構（単数または複数）である。私たちは、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）モノビオチン、生物学的に活性な生産する新規な技術の開発を報告した。量子ドットで標識されたBDNF（QD-BDNF）がmBtBDNFに量子ドット655を結合させることにより作製した。マイクロ流体デバイスは、ニューロン細胞体から軸索を単離するために使用した。軸索コンパートメントへのQD-BDNFを添加すると、軸索におけるBDNF輸送のライブイメージングを可能にした。私たちは、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒の移動速度で、非常に少数のポーズで、逆行本質的に排他的に移動させることを実証した。このシステムは私を調査するために使用することができADまたはHDビデオで破砕軸索機能だけでなく、他の変性疾患のchanisms。

概要

ニューロンは、高度が長く、多くの場合、非常に精緻化プロセスの確立及び神経回路の構造および機能を維持するための基本である細胞を分極されている。軸索はシナプスとの間で貨物を運ぶ重要な役割を果たしている。細胞体で合成されたタンパク質および細胞小器官は、神経機能をサポートするために、シナプス前末端に到達するために軸索を通って輸送される必要がある。これに対応して、遠位軸索で受信された信号は、形質導入し、細胞体に搬送する必要がある。これらのプロセスは、ニューロンの生存、分化および維持に必須である。いくつかのニューロンにおけるその軸索輸送が距離を通って1000倍以上細胞体の直径を行わなければならないでは、可能性は容易に小さくても赤字は著しく、神経回路機能に影響を与える可能性があることが想定される。

脳由来神経栄養因子（BDNF）、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ミリアンペアで存在する海馬、大脳皮質、および前脳基底核を含むニューヨークの脳領域、。 BDNFは、認知回路に関与するニューロンの生存、分化、および機能をサポートすることによって、認知および記憶形成において重要な役割を果たしている。 BDNFは、それがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（MAPK / ERK）、ホスファチジルイノシトール3 - キナーゼを含むのTrkB媒介性シグナル伝達経路を活性化する軸索末端に、その受容体、チロシンキナーゼのTrkBに結合する（PI3K）およびホスホリパーゼC-ガンマ（PLCγ）。これらのシグナル伝達経路に関与するタンパク質を、逆行性神経細胞の細胞体に輸送され、エンドソーム^{1-6シグナリング} BDNF / TrkBのを形成するために、エンドサイトーシス小胞構造にパッケージ化されています。

マイクロ流体培養チャンバーは、通常の条件下でだけでなく、怪我や病気^7,8の設定で軸索生物学を研究するための非常に便利なプラットフォームです。軸索を分離することにより細胞体から、デバイスは、1つの軸索^8-10で特異的に輸送を研究することができました。本研究で用いた450μmでマイクログルーブの障壁とPDMSベースのマイクロ流体プラットフォームは、商業的に（材料の表を参照）から購入した。 BDNF輸送を調べるために、モノビオチン化BDNF（mBtBDNF）を生成するための新規な技術を開発しました。私たちは（またAviTagをとして知られている）のビオチンアクセプターペプチドは、APを利用しました。これは、特に、大腸菌酵素ビオチンリガーゼ、BirAをすることによって、ビオチンに連結することができるリジン残基を含む15アミノ酸配列である。私たちは、PCR（ 図1A）、マウスプレproBDNF cDNAのC末端にAviTagを融合。構築物は、哺乳動物発現ベクター、をpcDNA3.1 mycを、彼のベクターにクローニングした。またをpcDNA3.1のmyc彼のベクターに細菌のBirA DNAをクローン化した。二つのプラスミドを一過両方のタンパク質を発現させるためにHEK293FT細胞に同時トランスフェクトした。 BirAをはビオのライゲーションを触媒するモノビオチン化BDNFモノマーを製造するために：1の比率、特にリジンの1でBDNFのC末端にAviTagを内に存在する。 〜18 kDaの分子量を有するビオチン化、成熟BDNFをNi-樹脂（ 図1C）を用いて培地から回収して精製した。イムノブロッティング（ 図1D）で修正されていないBDNFを検出することができないことによって判断されるようにBDNFのビオチン化は、完了した。ストレプトアビジン共役量子ドット、量子ドット655は、QD-BDNFを作るためにmBtBDNFを標識するために使用された。 mBtBDNFは、リン酸化のTrkB（ 図1E）を活性化し、組換えヒトBDNF（rhBDNF）程度に神経突起伸長（ 図1F）を刺激することができたとしてAviTagをの存在は、BDNFの活性を妨害しませんでした。免疫染色は、QD-BDNFはQD-BDNFは、生物活性（ 図1G）であることを示す、海馬軸索でのTrkBと共局在することが示さ。 BDNF輸送を研究するために、QD-BDNFは、遠位軸索区画に添加したラットE18海馬ニューロン（ 図2A）を含むマイクロ流体文化。軸索内のQD-BDNF逆行性輸送を赤色蛍光タグ（ 支援動画S1、S2）のリアルタイムライブイメージングによって捕獲された。生成されたカイモグラフを分析することによって、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒（ 図3A）の移動速度で逆行性に輸送されることが観察された。 GFPまたはmCherryをタグ付きBDNFは、BDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。主な欠点は、それらが単一分子研究のための十分に明るいではないということです。また、順行性および逆行性BDNFの動きの両方の存在は、それが困難な逆行性輸送BDNFは、ニューロトロフィン/受容体複合体にあったかどうかを評価することができる。

このビデオでは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内にQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証する。 ultrabrightnessと量子ドットのMAKの優れた光安定性エスことが可能BDNF輸送の長期的な追跡を実行する。これらの技術は、AD、HD、および他の神経変性疾患において、軸索機能の研究を強化するために利用することができる。

プロトコル

外科および動物の手順は厳密に実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って行われる。動物の使用を含む全ての実験は、UCSDの施設内動物管理使用委員会によって承認されています。

1プラスミドのクローニング、モノビオチン化BDNFの発現および精製（mBtBDNF）

注：HEK293FTセル¹⁰におけるpcDNA3.1ベクターと共発現に予めproBDNFaviとBirAをするcDNAを構築します。 mBtBDNFは、成熟生物学的に活性モノビオチン神経成長因子^{（mBtNGF）10を}製造する以前に公開された方法に従ってのNi-NTAビーズを用いて精製する。

マイクロ流体チャンバーの調製

マイクロ流体ニューロン培養装置は、流体ニューロン細胞体から軸索を単離することができる。右の各解剖前にコーティングされたばかりカバースリップでチャンバーを組み立てます。使用マイクロ流体室このプロトコルで、商業的に（資機材の表を参照）を購入している。手洗いや5-6xまでの再利用、商業的に購入室。

1. 手洗い1％Alconoxマイクロ流体室。 30分ごとにミリQ水で3回すすいでください。手を70％エタノールで再びチャンバを洗浄する。
2. 層流フード中でパラフィルム上で乾燥さ室をレイアウト。 UV下で20分間チャンバーの両側を照射し、滅菌する。ストアは、室温でパラフィルムで密封し、滅菌15cmの皿にチャンバを滅菌した。
3. ガラス容器に24×40ミリメートル1号カバーガラスを配置します。一晩回転装置に35％の塩酸でカバースリップを浸す。翌日、30分水でそれぞれにカバースリップを3回すすいでください。
4. カバースリップを100％エタノールに各カバースリップを浸漬し、ブンゼンバーナーの上に炎によって一枚ずつ滅菌する。無菌ペトリ皿に乾燥カバースリップを保存し、コーティングまで室温で保管してください。
5. OUを置き15cmの培養皿にカバースリップはt。コー​​ト0.01％ポリ-L-リジン（PLL）0.7mlを各カバースリップとは、室温でフード内でインキュベートする。
6. 1時間後、カバースリップを滅菌水で3回リンス。ドライカバーガラス、真空とし、6cmの培養皿に各カバースリップを配置。
7. マイクロ流体チャンバーを組み立てるために、マイクログルーブに触れないように注意して、PLLコーティングしたカバーガラス上に下部にマイクログルーブ側でチャンバーを配置。優しく室が密閉されたことを確認するためにピペットチップでチャンバーを押し下げる。

チェンバースでの神経文化、プレートの3解剖

1. 1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mMのHEPESと2ミリリットル解剖バッファー（HBSS、無カルシウム、ないマグネシウムを含む15ミリリットルコニカルチューブ中で解剖2 E17-E18ラット海馬（1脳）を配置します。組織をすすぎ5mlで3倍解剖できる限り解剖バッファを削除してください。たびにバッファリングし、新鮮なディ900μlのを追加ssectionバッファ。
2. 組織を消化するために、1×作業濃度を作るために解剖バッファーに10倍のトリプシン（2.5％）の100μlを添加する。 37℃の水浴中で円錐管を置き。消化の10分後、1 mg / mlの周りの最終濃度に10 mg / mlのDNase Iを100μlのを追加します。
3. ファイアーポリッシュパスツールガラスピペットを使用して、静かにピペッティング5〜10倍によって組織を粉砕する。右粉砕後、（10％FBS、2mMのグルタマックス、2％のB27とのNeurobasal）培地めっき2mlのトリプシンをクエンチする。
4. 組織のいずれ破片が底に落ち着くことができるように5分間フード内のサンプルのままにしておきます。慎重に細胞をペレットに5分間200×gで清潔な無菌の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清の2ミリリットルを削除します。 50μlのメッキメディアでペレットを再懸濁
5. 血球計算板を用いて細胞を数える。負荷のマイクロ流体チャンバーの1区画への15〜20μlの細胞懸濁液（〜40,000細胞）。チャンバーを配置細胞がカバーグラスに付着することを可能にする10分間インキュベーター中。 10分後、チャンバーの両方の区画を埋めるために、よりメッキメディアを追加。
6. 解剖の二日目に、完全に細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地（2mMのグルタマックス、2％のB27と神経基本）でメッキのメディアを交換してください。海馬ニューロンからの軸索は、3日目に微小溝を渡り、一日5-7間の軸索コンパートメントに到達するために開始します。この期間中、新鮮な維持培地ごとに24〜48時間で培養培地の半分を交換してください。

QD-BDNFの4軸索輸送

1. 徹底的に2時間BDNFフリー、無血清神経基本培地で両方の区画ごとに、30分をすすぐことにより、マイクロ流体チャンバーの細胞体と軸索のコンパートメントの両方からのBDNFを枯渇、QD-BDNF軸索輸送のイメージングを生きる前に。
2. BDNFの枯渇時には、QD-BDNF結合体を準備します。モノビオチン化BDの50 nMのミックスNFの神経基礎培地中の50 nMのQD655-ストレプトアビジン抱合体と二量体と60分間氷上でインキュベートする。
3. 軸索コンパートメントにメディアを取り出し、37℃で4時間、0.25 nMでの最終濃度で300μlのQD-BDNFを追加します。細胞体区画にQD-BDNFの拡散を最小限に抑えるためには、常に軸索区画におけるよりも細胞体コンパートメント内のメディアのより高いレベルを維持することは非常に重要である。ライブイメージングの前インキュベーション後に、結合していないQD-BDNFを洗い流す。
4. 100X油対物レンズを備えた倒立顕微鏡を用いてQD-BDNF輸送のライブイメージングを実施する。範囲および一定温度（37℃）とCO _{2（5％）、}それに取り付けられた環境室を温める。 QD655信号を可視化するためにテキサスレッド励起/発光キューブのセットを使用してください。
5. 取得しCCDカメラを用いて2分間、合計1フレーム/秒の速度で中間軸索内のタイムラプス画像を取り込む。股関節のない軸索とマイクログルーブを使用してくださいtは浸潤のコントロールとして何QDので、無信号がありません。
6. 任意の画像解析ソフトウェアまたはNIHのImageJを使用して、BDNF輸送を分析します。

結果

生産と生物学的に活性なモノビオチン化BDNFの精製

AviTagをシーケンス（GGGLNDIFEAQKIEWHE）と融合したBDNFの発現ベクターは、以前に公開されたプロトコル¹⁰に従って作成されました。完全長融合タンパク質の分子量は〜32kDaのが（であると予測されたhttp://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ）18 kDaの（ 図1A）の予測...

ディスカッション

本研究では、生物学的に活性な生成するための新しい技術の開発を報告し、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）がモノビオチン化。量子ドットストレプトアビジンにタンパク質をコンジュゲート、およびマイクロ流体チャンバを使用することにより、この方法は、1つはリアルタイムでかつ空間的及び時間的解像度で、単一分子感度を有する一次ニューロンにお...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
d-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
silver staining kit	G-Biosciences	786-30
human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24x40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101