Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

Resumo

O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.

Resumo

BDNF desempenha um papel importante em vários aspectos da sobrevivência neuronal, diferenciação e função. Défices funcionais e estruturais no axônios são cada vez mais vistos como uma característica precoce de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Huntington (DH). Como ainda é pouco claro o mecanismo (s) pelo qual é induzida lesão axonal. Nós relataram o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que pode ser utilizado para rastrear o transporte axonal de BDNF. Quantum dot marcado BDNF (QD-BDNF) foi produzido pela conjugação de ponto quântico 655 a mBtBDNF. Um dispositivo de microfluidos foi usada para isolar axónios de corpos celulares de neurónios. A adição de QD-BDNF ao compartimento axonal permitiu imagens ao vivo de transporte BDNF nos axônios. Nós demonstramos que QD-BDNF movido essencialmente exclusivamente retrogradamente, com muito poucas pausas, a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg. Este sistema pode ser utilizado para me investigarcanismos de função axonal interrompido no AD ou HD, bem como outras doenças degenerativas.

Introdução

Os neurônios são as células cujos processos longos e muitas vezes altamente elaborados são fundamentais para estabelecer e manter a estrutura ea função dos circuitos neurais altamente polarizada. O axônio desempenha um papel vital no que transportam cargas de e para as sinapses. As proteínas e organelas sintetizados no soma célula necessita de ser transportado por axónios para chegar ao terminal pré-sináptico para suportar a função neuronal. Do mesmo modo, os sinais recebidos pelo axónios distais devem ser transduzidas e transportado para o soma. Estes processos são essenciais para a sobrevivência neuronal, diferenciação e manutenção. Em que o transporte axonal em neurónios algumas deve ser conduzida através de distâncias mais do que 1000 vezes o diâmetro do corpo da célula, a possibilidade é facilmente imaginado que mesmo pequenos défices pode impactar significativamente a função neuronal e o circuito.

Derivado de factor neurotrófico cerebral (BDNF), um membro da família da neurotrofina de factores de crescimento, está presente na maregiões do cérebro, incluindo ny hipocampo, córtex cerebral, e do prosencéfalo basal. BDNF desempenha um papel crucial na formação da memória e cognição, através do apoio da sobrevivência, diferenciação e função de neurónios que participam em circuitos cognitivos. BDNF se liga ao seu receptor, a tirosina-cinase TrkB, no terminal axonal em que activa as vias de sinalização mediadas por TrkB, incluindo a proteína quinase activada por mitógeno / regulada por sinal extracelular da proteína cinase (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e fosfolipase C-gama (PLCy). As proteínas que participam nestas vias de sinalização são empacotados em vesículas de endocitose para formar o BDNF / TrkB sinalização endosome ^1-6 que são, então, transportado retrogradamente à soma neuronal.

A câmara de cultura de microfluidos é uma plataforma muito útil para estudar a biologia axonal, em condições normais, bem como na definição de lesões e doenças ^7,8. Por axônios isolandodos corpos celulares, o dispositivo tem permitido um para estudar o transporte especificamente em axônios ^8-10. As plataformas microfluídicos baseados PDMS com 450 mM barreiras microgroove utilizados neste estudo foram adquiridos comercialmente (ver tabela de materiais). Para examinar o transporte BDNF, desenvolvemos uma nova tecnologia para produzir monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Tiramos proveito do peptídeo biotina aceitante, AP (também conhecido como AviTag). É uma sequência de 15 aminoácidos que contém um resíduo de lisina, que pode ser especificamente ligado a uma biotina pela Escherichia coli enzima biotina ligase, BirA. Nós fundido a AviTag para o C-terminal do rato pré-proBDNF cDNA por PCR (Figura 1A). A construção foi clonada no vector de expressão de mamífero, pcDNA3.1 Myc-His vector. Nós também clonado o DNA bacteriano BirA na pcDNA3.1 Myc-His vector. Os dois plasmídeos foram co-transfectadas transientemente em células HEK293FT para expressar ambas as proteínas. BirA catalisou a ligadura da biotaem que especificamente a lisina residir no AviTag no C-terminal do BDNF a uma razão de 1: 1 para produzir monobiotinylated monómero BDNF. Biotinilado, BDNF madura com uma massa molecular de ~ 18 kDa foi recuperada e purificada a partir dos meios utilizando Ni-resina (Figura 1C). A biotinilação de FNDC estava completa, conforme avaliado pela incapacidade para detectar o BDNF não modificado por imunotransferência (Figura 1E). Estreptavidina conjugada pontos quânticos, QD 655, foram utilizados para marcar mBtBDNF fazer QD-BDNF. A presença do AviTag não interferir com a actividade do BDNF como o mBtBDNF foi capaz de activar TrkB fosforilada (Figura 1E) e estimular o crescimento de neurites (Figura 1F) até ao ponto de BDNF recombinante humano (rhBDNF). Acms mostrado que QD-BDNF colocalized com TrkB em axónios do hipocampo, indicando que QD-BDNF é bioactivo (Figura 1G). Para estudar o transporte de BDNF, QD-BDNF foi adicionado ao compartimento do axónio distaiculturas de microfluidos contendo rato E18 neurónios do hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de axônios foi capturado por em tempo real imagens ao vivo da etiqueta fluorescente vermelha (apoiando vídeos S1, S2). Ao analisar o quimógrafo gerado, QD-BDNF foi observada a ser transportados retrogradamente a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg (Figura 3A). GFP ou mCherry-BDNF com etiquetas ter sido usado para controlar o movimento axonal de BDNF. As principais desvantagens são que eles não são brilhantes o suficiente para os estudos de moléculas individuais. Além disso, a presença de ambos os movimentos anterógrada e retrógrada BDNF torna difícil avaliar se ou não o BDNF transportado retrogradamente era um complexo de neurotrofina / receptor.

Neste vídeo, demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários. O ultrabrightness e excelente fotoestabilidade de pontos quânticos makes-se possível realizar de seguimento a longo prazo de transporte BDNF. Estas técnicas podem ser explorados para reforçar estudos de função axonal em AD, HD, e outras desordens neurodegenerativas.

Protocolo

Os procedimentos cirúrgicos e de animais são realizadas estritamente de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos que envolvem o uso de animais são aprovados por UCSD Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1. plasmídeo Clonagem, expressão e purificação do mono-biotinilado BDNF (mBtBDNF)

NOTA: Construir pré-proBDNFavi e BirA cDNA em vetor pcDNA3.1 e co-expressar em células HEK293FT ^10. Purificar mBtBDNF utilizando pérolas de Ni-NTA de acordo com o método previamente publicado de produzir factor de crescimento do nervo monobiotinylated madura e biologicamente activa (mBtNGF) ^10.

2 Preparação de microfluídicos Chambers

Microfluídicos dispositivo neurônio cultura torna possível isolar fluidicamente axônios de corpos celulares neurônio. Montar câmaras com lamelas recentemente pintadas direito antes de cada dissecção. Câmaras microfluídicos usadosneste protocolo são comercialmente adquirido (ver materiais e tabela do equipamento). Lave à mão e reutilizados câmaras adquiridas comercialmente até 5-6x.

1. Somente lavagem à mão câmaras microfluídicos em 1% Alconox. Lavar três vezes com água Milli-Q durante 30 min cada. Câmaras de lavagem de mão novamente em etanol 70%.
2. Coloque para fora câmaras para secar em Parafilm na capela de fluxo laminar. Irradiar e esterilizar ambos os lados das câmaras, durante 20 min sob UV. Loja câmaras esterilizadas numa estéril 15 centímetros prato selado com Parafilm à temperatura ambiente.
3. Coloque 24 x 40 mm No. 1 lamínulas de vidro em um recipiente de vidro. Mergulhe as lamelas em ácido clorídrico a 35% durante a noite em um rotador. No dia seguinte, lavar as lamelas três vezes, durante 30 min cada, com água.
4. Esterilizar as lamelas, um por um, mergulhando cada lamela em etanol a 100% e ardor sobre um bico de Bunsen. Armazenar lamelas secas numa placa de Petri estéril e mantê-lo à temperatura ambiente até o revestimento.
5. Coloque UOt as lamelas em um 15 centímetros prato de cultura. Bata de cada lamela com 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) e incuba-se na capa, à temperatura ambiente.
6. Após 1 h, lavar as lamelas três vezes com água estéril. Lamelas secos com vácuo e coloque cada lamela em um prato de cultura 6 centímetros.
7. Para montar a câmara de microfluídica, coloque a câmara com o lado microgroove na parte inferior para a lamela PLL revestido com cuidado para não tocar nas estrias. Gentilmente pressionado a câmara com uma ponteira para garantir a câmara foi hermeticamente fechado.

3. Dissecção da Neuronal Cultura e Placa em Chambers

1. Coloque dois hipocampos E17-E18 rato (um cérebro) dissecados em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de dissecção (HBSS, sem cálcio, magnésio não, com 1% pen / strep e HEPES 10 mM. Lavar os tecidos 3x com 5 ml dissecção de tampão de cada vez. Remover o tampão de dissecção, tanto quanto possível, e adicionar 900 ul de di frescotampão ssection.
2. Para digerir o tecido, adicionar 100 ul de tripsina 10x (2,5%) no tampão de dissecção para tornar a concentração de trabalho 1x. Colocar o tubo cónico de 37 ° C Banho de água. Após 10 minutos de digestão, adicionar 100 ul de 10 mg / ml de ADNase I a uma concentração final de cerca de 1 mg / ml.
3. Usando uma pipeta Pasteur de vidro polido-fogo, triturar suavemente os tecidos pipetando para cima e para baixo 5-10x. Logo após a trituração, extinguir a tripsina com 2 ml de meio (chapeamento Neurobasal com 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27).
4. Deixar a amostra na capa por 5 minutos para permitir que todos os restos dos tecidos para se estabelecer para o fundo. Remover cuidadosamente 2 mL de sobrenadante para um tubo de 15 ml estéril cónico limpo e centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar as células. Ressuspender o sedimento em 50 mídia ul chapeamento
5. Contar as células com hemocitômetro. Carga 15-20 ul de suspensão de células (~ 40.000 células) em um compartimento da câmara de microfluidos. Coloque a câmarana incubadora durante 10 minutos para permitir que as células se fixem à lamela. Após 10 min, adicionar mídia mais chapeamento para encher ambos os compartimentos da câmara.
6. No segundo dia da dissecção, substituir completamente os meios de chapeamento com meio de manutenção (Neurobasal com GlutaMax 2 mM, 2% B27), tanto no corpo da célula e o compartimento do axónio. Os axônios dos neurônios do hipocampo começa a atravessar as estrias no dia 3 e atingir o compartimento do axônio entre os dias 5-7. Durante este período de tempo, substitua metade da media cultura com meio de manutenção fresco todos os 24 ~ 48 horas.

4. axonal Transporte de QD-BDNF

1. Antes da imagiologia de viver QD-BDNF transporte axonal, esgotar o BDNF, tanto do corpo da célula e os compartimentos de axónios da câmara de microfluidos por enxaguar ambos os compartimentos com o BDNF-livre, livre de soro mídia Neurobasal cada 30 min durante 2 horas.
2. Durante a depleção de BDNF, preparar os conjugados QD-BDNF. Misturar 50 nM de mono-biotinilado BDNF dímero com 50 nM QD655 conjugados com estreptavidina em meio Neurobasal e incubar em gelo durante 60 min.
3. Retirar mídia no compartimento axonal e adicionar 300 ul QD-BDNF com uma concentração final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar a difusão de QD-BDNF no compartimento do corpo da célula, é muito importante para manter sempre um nível mais elevado de meios no compartimento do corpo de célula do que no compartimento do axónio. Lavar desvinculado QD-BDNF após incubação antes de imagem ao vivo.
4. Realizar imagens ao vivo de transporte QD-BDNF usando um microscópio invertido equipado com uma lente objectiva de óleo 100X. Aquecer o escopo e a câmara ambiental a ela ligada a uma temperatura constante (37 ° C) e de CO ₂ (5%). Uso de um conjunto de cubos Texas excitação / emissão de vermelho para visualizar o sinal de QD655.
5. Adquirir e capturar imagens de lapso de tempo dentro dos axônios média na velocidade de um quadro / segundo para um total de 2 min usando uma câmera CCD. Use microgrooves sem axônios that não têm QD e, portanto, nenhum sinal de controlo para a infiltração.
6. Analisar transporte BDNF usando qualquer software de análise de imagem ou NIH ImageJ.

Resultados

Produção e Purificação de BDNF Mono-biotinilado Biologicamente Activo

O vector de expressão de BDNF fundida com uma sequência de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) foi criado de acordo com um protocolo previamente publicado ^10. A massa molecular da proteína de fusão de comprimento completo foi previsto para ser ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated BDNF maduro com uma massa molecu...

Discussão

Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que podem ser utilizados para rastrear o transporte axonal de BDNF. Conjugando a proteína a estreptavidina quantum dot, e usando uma câmara de microfluidos, o método permite detectar o transporte axonal de BDNF nos neurónios primários com sensibilidade única molécula, em tempo real e com resolução espacial e temporal. As ferramentas aqui utilizadas fornecer um meio pelo qual a es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101