양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

요약

BDNF, 신경 영양 인자의 축삭 수송은 여러 신경 인구의 생존과 기능을 위해 중요하다. 일부 퇴행성 질환은 축삭 구조와 기능의 장애로 표시됩니다. 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여 주었다.

초록

BDNF는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능의 몇 가지 측면에서 중요한 역할을한다. 축색 돌기의 구조 및 기능 적자는 점점 알츠하이머 병 (AD)와 헌팅턴 병 (HD)을 포함한 신경 퇴행성 질환의 초기 기능으로 볼 수 있습니다. 아직까지 불분명 축삭 손상이 유발되는 메커니즘 (들)입니다. 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)는 monobiotinylated. 양자점 표지 BDNF (QD-BDNF)가 mBtBDNF에 양자점 655 공역에 의해 제작되었다. 미세 유동 장치는 신경 세포체에서 축삭을 분리하는데 사용되었다. 축삭 구획 QD-BDNF의 추가 축삭에서 BDNF 수송의 라이브 영상을 허용했다. 우리는 QD-BDNF는 약 1.06 μm의 / sec의 이동 속도에서 거의 일시 정지와 역행 본질적으로 독점적으로 이동 있음을 보여 주었다. 이 시스템은 저를 조사하는 데 사용할 수 있습니다AD 또는 HD에서 중단 축삭의 기능뿐만 아니라 다른 퇴행성 질환의 chanisms.

서문

신경 세포는 고도의 그 긴 종종 고도로 정교한 프로세스 확립 및 신경 회로의 구조와 기능을 유지하기위한 기본이되는 셀을 편광된다. 축삭과 시냅스에서화물을 운반하는 중요한 역할을한다. 소마 세포에서 합성 된 단백질은 신경 세포 소기관 및 기능을 지원하는 시냅스 전 말단에 도달하는 축삭을 통해 전송 될 필요가있다. 대응하여, 신호는 말단 축색 돌기가 형질 도입 될 필요가 수신 및 소마로 반송. 이러한 프로세스는 신경 세포의 생존, 분화 및 유지 관리에 필수적이다. 일부 신경 축삭에서 그 전송을 통해 거리보다 1000 배 세포체의 직경을 수행해야에서 가능성 용이 심지어 작은 결손이 현저하고 신경 회로 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것을 구상한다.

뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF), 성장 인자의 뉴로 트로 가족의 일원은, 엄마의 존재해마, 대뇌 피질과 기저 전뇌를 포함하여 뉴욕의 뇌 영역. BDNF는인지 회로에 참여하는 신경 세포의 생존, 분화 및 기능을 지원하여인지와 기억 형성에 중요한 역할을한다. BDNF는 그것이 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 / 세포 외 신호 - 조절 된 단백질 키나제 (MAPK / ERK), 포스파티딜 이노시톨 3 - 키나제 포함 TrkB-매개 신호 전달 경로를 활성화 축삭 말단, 수용체, 티로신 키나아제 TrkB에 바인딩 (PI3K) 및 포스 포 리파제 C-감마 (PLCγ). 이러한 신호 전달 경로에 참여하는 단백질은 다음 역행 신경 소마로 이송하는 엔도 좀 ^1-6 신호 BDNF / TrkB를 형성하는 세포 내 이입 기공 구조에 포장됩니다.

마이크로 유체 문화 실 정상 조건에서뿐만 아니라 부상과 질병 ^7,8의 설정에서 축삭 생물학 연구를위한 매우 유용한 플랫폼이다. 분리 축삭으로세포 기관에서, 장치는 축삭 ^8-10에 구체적으로 교통을 연구하는 일을 허용했다. 본 연구에 사용 된 450 μm의 마이크로 그루브 장벽 PDMS 기반의 미세 유체 플랫폼은 상용 (재료 표 참조)을 구입 하였다. BDNF 전송을 조사하기 위해, 우리는 monobiotinylated BDNF (mBtBDNF)를 생산하는 새로운 기술을 개발했다. 우리는 (또한 AviTag라고도 함) 비오틴 수용체 펩타이드, AP를 이용했다. 그것은 특히 대장균 효소 리가 비오틴, 피라 의해 바이오틴에 결찰 될 수 리신 잔기를 포함하는 15 개의 아미노산 서열이다. 우리는 PCR (도 1a)에 의해 마우스 cDNA를 미리 proBDNF의 C-말단에 융합 AviTag. 구조체는 포유류 발현 벡터, 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 클로닝 하였다. 또한 한 pcDNA3.1-myc의 자기 벡터에 피라 세균의 DNA를 클로닝. 두 플라스미드 모두 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293FT 세포로 공동 - 형질 감염시켰다. 피라는 비오의 결찰 촉매특히 라이신이 일에서 BDNF의 C-말단에 AviTag 내에 상주에서 : 1의 비율로 BDNF의 단량체를 monobiotinylated 생성한다. 비오틴은 ~ 18 kDa의 분자량의 BDNF와 성숙 회수 및 Ni-수지 (도 1C)를 사용하여 미디어에서 정제 하였다. (그림 1D)를 발현 수준에 의해 수정되지 않은 BDNF 감지 할 수없는 심판으로 BDNF의 바이오 티 닐화는 완전했다. 스트렙 타비 딘 결합 된 양자점, QD 655는 QD-BDNF를 만들기 위해 mBtBDNF 라벨을 사용 하였다. mBtBDNF이 인산화 TrkB (그림 1E)를 활성화하고 재조합 인간 BDNF (rhBDNF)의 정도에 신경 돌기의 파생물 (그림 1 층)을 자극 할 수 있다는 AviTag의 존재는 BDNF의 활동을 방해하지 않았다. QD-BDNF는 QD-BDNF는 생리 활성 (그림 1G) 인 것을 나타내는, 해마 축삭에서 TrkB와 colocalized 것으로 나타 면역 염색. BDNF 전송을 연구하기 위해, QD-BDNF는 원위부 축삭 구획에 추가쥐 E18 해마 신경 세포 (그림 2A)를 포함하는 마이크로 유체 문화. 축삭 내 QD-BDNF 역행 전송은 적색 형광 태그 (지원 영상 S1, S2)의 실시간 라이브 영상에 의해 체포됐다. 생성 kymograph를 분석함으로써, QD-BDNF는 약 1.06 μM / 초 (도 3a)의 이동 속도로 역행 수송 될 것으로 관찰되었다. GFP 또는 mCherry - 태그 BDNF는 BDNF의 축삭 이동을 추적하는 데 사용되었다. 주요 단점은 단일 분자 연구에 충분히 밝은하지 수 있다는 점을들 수있다. 또한, 선행 성 모두와 역행 BDNF 움직임의 존재 어려운 역행 수송 BDNF는 뉴로 트로 / 수용체 복합체에 참여할지 여부를 평가하기 위해 만든다.

이 비디오에서는, 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여줍니다. ultrabrightness 및 양자점 살려 우수한 광 안정성에스 것이 가능 BDNF 수송의 장기 추적을 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 AD, HD, 및 다른 신경 퇴행성 질환에서 축삭의 기능 연구를 향상시키기 위해 이용 될 수있다.

프로토콜

수술과 동물의 절차는 관리에 대한 NIH 지침 및 실험 동물의 사용에 따라 엄격하게 수행된다. 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

1 플라스미드 복제, 모노 - 비오틴 BDNF의 발현과 정제 (mBtBDNF)

참고 : HEK293FT 셀 ^(10)의 한 pcDNA3.1 벡터와 같이 발현에 사전 proBDNFavi과 피라의 cDNA를 구축합니다. mBtBDNF 성숙 및 생물학적 활성 monobiotinylated 신경 성장 인자 (mBtNGF) ^{(10)의 제조} 이전에 발행 방법에있어서의 Ni-NTA 비드를 사용하여 정제 하였다.

미세 유체 챔버의 2 준비

신경 미세 배양 장치는 유체 적 신경 세포체에서 축삭을 분리하는 것을 가능하게한다. 바로 각 해부하기 전에 갓 코팅 된 커버와 챔버를 조립합니다. 사용되는 미세 유체 챔버이 프로토콜에서 상업적으로 (재료 및 장비의 표 참조) 구입. 핸드 워시와 5-6x까지 다시 상업적으로 구입 한 실.

1. 손세탁 1 % Alconox에서 미세 유체 챔버. 30 분마다 밀리-Q 물로 3 회 씻어. 70 % 에탄올에 다시 손 세척 챔버.
2. 층류 후드에서 파라 필름에 건조 챔버를 배치. 방출 및 UV 하에서 20 분 동안 챔버의 양측 소독. 쇼핑몰 실온에서 파라 필름으로 밀봉 멸균 15cm 접시에 멸균 챔버.
3. 유리 용기에 24 X 40mm 1 위 유리 커버 슬립을 놓습니다. 밤새 회에 35 % 염산 산에서 커버 슬립을 적 십니다. 다음 날, 30 분 물 각각에 대한 커버 슬립을 세 번 헹군다.
4. 100 % 에탄올로 각각의 커버 슬립을 침지하고 분젠 버너 위에 불타는하여 커버 슬립을 하나씩 소독. 멸균 페트리 접시에 건조 된 커버를 저장하고 코팅까지 실온에서 보관하십시오.
5. OU를 놓는다15cm 배양 접시에 커버 슬립을 t. 코트 0.01 % 폴리-L-라이신 (PLL)의 0.7 ml의 각각과 커버 슬립을 실온에서 배양 후드.
6. 1 시간 후, 커버 슬립에게 멸균 수로 3 회 씻어. 6cm의 배양 접시에 진공과 장소 각 coverslip에 건조 된 커버.
7. 미세 유체 챔버를 조립하기 위해, 마이크로 그루브를 만지지 않도록주의 PLL 코팅 된 커버 슬립 위에 하단에 마이크로 그루브면이 챔버를 배치합니다. 부드럽게 챔버는 단단히 밀봉 된 보장하기 위해 피펫 팁과 챔버를 눌렀습니다.

챔버에 3의 연결을 문화의 해부 및 플레이트

1. 1 % 펜 / 패 혈성 및 10 mM의 HEPES 2 ㎖의 해부 버퍼 (HBSS, 아니 칼슘, 아니 마그네슘을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 해부 두 E17-E18 쥐의 해마 (뇌의)를 배치합니다. 조직을 5 ㎖로 3 배 씻어 해부 최대한 해부 버퍼를 제거합니다. 때마다 버퍼와 신선한 디의 900 μl를 추가ssection 버퍼입니다.
2. , 조직을 소화 1X 작업 농도를 확인하기 위해 해부 버퍼에 10 배 트립신 (2.5 %)의 100 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 원뿔 튜브를 놓습니다. 소화 10 분 후, 1 ㎎ / ㎖의 주위에 최종 농도 10 ㎎ / ㎖의 DNase I의 100 μl를 추가합니다.
3. 화재 연마 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 아래로 5-10x 피펫 팅에 의해 조직을 씹다. 오른쪽 분쇄 한 후, (10 % FBS, 2 mM의 GlutaMax, 2 % B27와 Neurobasal) 평판 배지 2 ㎖의 트립신으로 급랭.
4. 바닥에 정착하기 위해 조직의 파편을 할 수 있도록 5 분 동안 후드 샘플을 둡니다. 조심스럽게 펠릿 세포 5 분 동안 200 XG에 깨끗한 무균 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 상층 액 2 ㎖를 제거합니다. 50 ㎕의 도금 미디어에서 펠렛을 재현 탁
5. 혈구와 세포를 계산합니다. 로드 미세 유체 챔버의 한 구획에 15 ~ 20 ㎕의 세포 현탁액 (~ 40,000 세포). 챔버를 배치배양기에서 10 분 세포가 커버 슬립에 첨부 할 수 있도록합니다. 10 분 후, 챔버의 두 구획을 채우기 위해 더 도금 미디어를 추가 할 수 있습니다.
6. 해부의 두 번째 날, 완전히 세포체와 축삭 구획 모두 (2 mM의 GlutaMax, 2 % B27와 Neurobasal) 유지 보수 매체와 도금 미디어를 교체합니다. 해마 신경 세포의 축삭은 3 일에 마이크로 그루브를 건너 일 5-7 사이의 축삭 구획에 도달하기 시작합니다. 이 기간 동안, 보수 신선한 매체 매 24 ~ 48 시간 배양하여 매체의 절반을 대체.

QD-BDNF의 4 축삭 전송

1. , QD-BDNF 축삭 수송의 영상을 살고있는 마이크로 유체 챔버의 세포체와 축삭 구획 모두에서 BDNF 고갈에 앞서 철저히하여 2 시간 동안 BDNF-무료, 무 혈청 Neurobasal 매체 매 30 분 간격으로 두 구획을 씻어.
2. BDNF 고갈 동안, QD-BDNF 접합체를 준비합니다. 모노 - 바이오틴 BD의 50 nm의 혼합NF의 neurobasal 매체에서 50 nM의 스트렙 타비 딘 - 컨쥬 게이트 QD655와 다이머 및 60 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
3. 축삭 함에서 용지를 제거하고 37 ° C에서 4 시간 동안 0.25 nm의 최종 농도로 300 ㎕의 QD-BDNF를 추가합니다. 세포체 납부에 QD-BDNF의 확산을 최소화하기 위해, 항상 축삭 구획보다 세포체 함의 매체의 높은 수준을 유지하는 것이 매우 중요하다. 라이브 영상 전에 배양 한 후 언 바운드 QD-BDNF를 씻으십시오.
4. 100X 오일 대물 렌즈가 장착 된 거꾸로 현미경을 사용하여 QD-BDNF 수송의 라이브 영상을 수행하십시오. 범위 및 일정한 온도 (37 ° C) 및 CO ₂ (5 %)에 부착 된 환경 챔버를 따뜻하게. QD655 신호를 시각화하기 위해 텍사스 레드 여기 / 방출 큐브 집합을 사용합니다.
5. 획득 및 CCD 카메라를 사용하여 2 분의 1에 대한 전체 프레임 / 초의 속도로 중간 축삭 내의 저속 이미지를 캡처. 더 축삭과 함께 사용 마이크로 그루브 그쪽으로t는 QD 따라서 침투에 대한 제어와 같은 신호가 없다.
6. 어떤 화상 해석 소프트웨어 또는 NIH ImageJ에 BDNF를 사용 수송 분석.

결과

생산 및 생물 학적 활성 모노 - 바이오틴 BDNF의 정화

AviTag 순서 (GGGLNDIFEAQKIEWHE)와 융합 BDNF의 발현 벡터는 이전에 발행 된 프로토콜 ^(10)에 따라 작성되었습니다. 전체 길이 융합 단백질의 분자량은 ~ 32 kDa의이 (것으로 예측 하였다 http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) 18 kDa의 (도 1a)의 예측 된 분자량을 가진 성...

토론

본 연구에서 우리는 생물학적 활성을 생산하는 신규 한 방법의 개발을보고, BDNF의 축삭 수송을 추적하는 데 사용될 수 BDNF (mBtBDNF)를 monobiotinylated. 양자점 스트렙에 단백질 컨쥬 게이트, 및 마이크로 유체 챔버를 사용함으로써, 상기 방법은 하나는 실시간 및 시공간 해상도와 단일 분자 감도 차와 뉴런의 BDNF의 축삭 전송을 검출 할 수있다. 여기에서 사용 된 도구는 건강과 질병에서 신경 세포에서 B...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
d-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
silver staining kit	G-Biosciences	786-30
human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24x40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101