Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

Résumé

Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.

Résumé

BDNF joue un rôle important dans plusieurs aspects de la survie neuronale, la différenciation et la fonction. Les déficits structurels et fonctionnels dans les axones sont de plus en plus considérés comme une caractéristique précoce des maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer (MA) et la maladie de Huntington (HD). Ne sait pas encore, c'est le mécanisme (s) par lequel des lésions axonales est induite. Nous avons signalé le développement d'une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. Quantum dot marqué BDNF (QD-BDNF) a été produit par la conjugaison de points quantiques 655 à mBtBDNF. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour isoler les axones des corps cellulaires des neurones. Ajout de QD-BDNF dans le compartiment axonal permis imagerie en temps réel du transport du BDNF dans les axones. Nous avons démontré que QD-BDNF déplacé essentiellement exclusivement rétrograde, avec très peu de pauses, à une vitesse de l'ordre de 1,06 um / s en mouvement. Ce système peut être utilisé pour enquêter sur moicanismes de la fonction axonale perturbé dans AD ou HD, ainsi que d'autres maladies dégénératives.

Introduction

Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L'axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l'hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l'endosome ^1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB.

La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies ^7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d'étudier un transport spécifiquement dans les axones ^8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d'étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s'agit d'une séquence d'acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l'extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d'expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l'ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d'exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l'extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l'aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l'incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n'interfère pas avec l'activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d'activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l'hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d'cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l'hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l'étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l'ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu'ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d'évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur.

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d'effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d'autres maladies neurodégénératives.

Protocole

Les interventions chirurgicales et animales sont réalisées dans le strict respect de la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences impliquant l'utilisation d'animaux sont approuvés par l'UCSD institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1. plasmide de clonage, expression et purification de Mono-biotinylé BDNF (mBtBDNF)

REMARQUE: construire pré-proBDNFavi et BirA ADNc dans le vecteur pcDNA3.1 et coexprimer dans les cellules HEK293FT ^10. Purifiez mBtBDNF utilisant des billes de Ni-NTA selon la méthode précédemment publiée de la production du facteur de croissance nerveuse monobiotinylé mature et biologiquement active (mBtNGF) ^10.

2 Préparation de microfluidiques Chambers

Dispositif microfluidique neurone de culture permet d'isoler fluidiquement axones des corps cellulaires des neurones. Assemblez chambres avec lamelles fraîchement enduites juste avant chaque dissection. Chambres microfluidiques utilisésdans ce protocole sont achetés dans le commerce (voir matériaux et la table de l'équipement). Lavage à la main et réutilisés chambres achetés dans le commerce jusqu'à 5-6x.

1. Lavage à la main des chambres microfluidiques en 1% Alconox. Rincer trois fois avec de l'eau Milli-Q pendant 30 min chacun. chambres à nouveau dans 70% d'éthanol de lavage des mains.
2. Disposez chambres à sécher sur du parafilm dans la hotte à flux laminaire. Irradier et stériliser les deux côtés des chambres de 20 minutes sous UV. Magasin chambres stérilisée en 15 cm plat stérile scellée avec du parafilm à la température ambiante.
3. Placer 24 x 40 mm n ° 1 des lamelles de verre dans un récipient en verre. Tremper les lamelles de 35% de l'acide chlorhydrique nuit sur un agitateur. Le jour suivant, les lamelles rincer trois fois pendant 30 minutes chacune avec de l'eau.
4. Stériliser les lamelles couvre-objet, un par un en trempant chaque lamelle couvre-objet dans de l'éthanol à 100% et plus de flammes d'un brûleur Bunsen. Rangez les lamelles sèches dans une boîte de Pétri stérile et le laisser à température ambiante jusqu'à ce que le revêtement.
5. Poser oust les lamelles dans une boîte de culture de 15 cm. Manteau de chaque lamelle avec 0,7 ml de 0,01% de poly-L-lysine (PLL) et incuber à la hotte à température ambiante.
6. Après 1 heure, rincez les lamelles à trois reprises avec de l'eau stérile. Lamelles sèches avec vide et le lieu de chaque lamelle dans une boîte de culture de 6 cm.
7. Pour assembler la chambre microfluidique, placez la chambre à côté microsillon en bas sur la lamelle enduit PLL avec prudence pour ne pas toucher les microsillons. Doucement pressé vers le bas dans la chambre avec une pointe de pipette afin d'assurer la chambre est hermétiquement scellée.

3. Dissection neuronale Culture et plaque sur les chambres

1. Placez deux hippocampes E17-E18 rat (un cerveau) disséqués dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de tampon de dissection (HBSS, sans calcium, pas de magnésium, avec 1% stylo / angine et HEPES 10 mM. Rincer les tissus 3x avec 5 ml dissection tampon à chaque fois. Retirez le tampon de dissection autant que possible et ajouter 900 ul de di fraisssection tampon.
2. Pour digérer le tissu, ajouter 100 pl de 10x la trypsine (2,5%) dans le tampon de dissection à faire 1x concentration de travail. Placer le tube conique dans un bain d'eau à 37 C °. Après 10 minutes de digestion, ajouter 100 ul de 10 mg / ml de DNase I à une concentration finale d'environ 1 mg / ml.
3. En utilisant une pipette en verre de Pasteur polie au feu, triturer doucement les tissus par aspiration et refoulement 5-10x. Juste après trituration, étancher la trypsine avec 2 ml de placage milieu Neurobasal (avec 10% de FBS, 2 mM de Glutamax, 2% de B27).
4. Laisser l'échantillon dans la hotte pendant 5 minutes pour permettre à tous les débris des tissus de s'installer au fond. Retirez délicatement 2 ml de surnageant dans un tube de 15 ml conique stérile et centrifuger à 200 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules. Reprendre le culot dans 50 ul placage médias
5. Compter les cellules avec un hémocytomètre. Charge de 15 à 20 ul de suspension cellulaire (~ 40 000 cellules) dans un compartiment de la chambre microfluidique. Placer la chambredans l'incubateur pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle. Après 10 min, ajouter des médias plus placage de remplir les deux compartiments de la chambre.
6. Le deuxième jour de la dissection, remplacer complètement les milieux d'étalement avec support de maintien (Neurobasal avec Glutamax 2 mM, 2% de B27) à la fois dans le corps de la cellule et le compartiment de l'axone. Les axones des neurones de l'hippocampe commencent à traverser les microsillons dans les jours 3 et atteindre le compartiment axone entre le jour 5-7. Au cours de cette période de temps, remplacer la moitié du milieu de culture avec des milieux d'entretien frais tous les 24 ~ 48 h.

4. axonale Transport de QD-BDNF

1. Avant de vivre l'imagerie de QD-BDNF transport axonal, épuiser BDNF à la fois du corps cellulaire et l'axone compartiments de la chambre microfluidique par rincer soigneusement les deux compartiments avec BDNF-libres, du milieu sans sérum Neurobasal toutes les 30 min pendant 2 h.
2. Au cours de BDNF épuisement, préparer les conjugués QD-BDNF. Mélanger 50 nM de mono-biotinylé BDNF dimère avec 50 nM conjugués QD655-streptavidine dans les médias Neurobasal et incuber sur de la glace pendant 60 min.
3. Retirez le support dans le compartiment axone et ajouter 300 ul QD-BDNF avec une concentration finale de 0,25 nM pendant 4 heures à 37 ° C. Pour réduire au minimum le diffuseur de QD-BDNF dans le compartiment du corps de la cellule, il est très important de maintenir toujours un niveau supérieur de support dans le compartiment du corps de la cellule que dans le compartiment de l'axone. Laver non lié QD-BDNF après incubation avant l'imagerie en direct.
4. Faire de l'imagerie en temps réel des transports QD-BDNF l'aide d'un microscope inversé équipé d'une huile 100X objectif. Chauffer le cadre et la chambre de l'environnement qui s'y rattachent à une température constante (37 ° C) et CO ₂ (5%). Utilisez un ensemble de Texas cubes rouge d'excitation / émission de visualiser le signal de QD655.
5. Acquérir et capturer des images en accéléré dans les axones moyen à la vitesse de 1 image / s pour un total de 2 min à l'aide d'une caméra CCD. Utilisez microsillons sans axones that n'ont pas QD et donc aucun signal de contrôle pour l'infiltration.
6. Analyser le transport du BDNF utilisant n'importe quel logiciel d'analyse d'image ou NIH ImageJ.

Résultats

Production et purification de biologiquement active BDNF Mono-biotinylé

Le vecteur d'expression de BDNF fusionnée avec une séquence AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) a été réalisé selon un protocole précédemment publié ^10. La masse moléculaire de la protéine de fusion pleine longueur a été prévue pour être ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) monobiotinylé BDNF mûr avec une masse m...

Discussion

Dans cette étude, nous rapportons le développement d'une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. En conjuguant la protéine de quantum dot de la streptavidine, et en utilisant une chambre microfluidique, le procédé permet de détecter le transport axonal de BDNF dans les neurones primaires avec sensibilité molécule unique, en temps réel et avec une résolution spatiale et temporelle. Les outils utili...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101