In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

Riepilogo

Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.

Abstract

BDNF svolge un ruolo importante in molti aspetti della sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la funzione. Deficit strutturali e funzionali in assoni sono visti sempre più come una caratteristica precoce di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e la malattia di Huntington (HD). Per quanto ancora poco chiaro è il meccanismo (s) di cui danno assonale è indotta. Abbiamo riportato lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Quantum dot-marcato BDNF (QD-BDNF) è stato prodotto da coniugando quantum dot 655 a mBtBDNF. Un dispositivo di microfluidica è stato utilizzato per isolare gli assoni da corpi cellulari dei neuroni. L'aggiunta di QD-BDNF al compartimento assonale consentito l'imaging dal vivo di trasporto BDNF negli assoni. Abbiamo dimostrato che QD-BDNF spostato in sostanza esclusivamente retrograda, con pochissime pause, ad una velocità di spostamento di circa 1,06 micron / sec. Questo sistema può essere usato per studiare mechanisms di perturbato funzione assonale in AD o HD, così come altre malattie degenerative.

Introduzione

I neuroni sono cellule altamente polarizzate i cui processi lunghi e spesso altamente elaborati sono fondamentali per stabilire e mantenere la struttura e la funzione dei circuiti neurali. L'assone svolge un ruolo fondamentale nel portare carichi da e sinapsi. Le proteine ​​e organelli sintetizzati nel soma cellulare devono essere trasportati attraverso gli assoni per raggiungere il terminale presinaptico per supportare la funzione neuronale. Di conseguenza, i segnali ricevuti assoni distali devono essere trasdotte e convogliati al soma. Questi processi sono essenziali per la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la manutenzione. In tale trasporto assonale in alcuni neuroni deve essere condotta attraverso distanze più di 1.000 volte il diametro del corpo cellulare, la possibilità è facilmente previsto che anche i piccoli deficit potrebbero avere un impatto marcatamente funzione neuronale e del circuito.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membro della famiglia dei fattori di crescita neurotrofina, è presente in maregioni cerebrali ny, tra cui l'ippocampo, la corteccia cerebrale, e prosencefalo basale. BDNF svolge un ruolo cruciale nella formazione conoscenza e la memoria sostenendo la sopravvivenza, la differenziazione e la funzione dei neuroni che partecipano a circuiti cognitivi. BDNF si lega al suo recettore, il TrkB tirosina chinasi, al terminale dell'assone dove attiva vie di segnalazione TrkB-mediata, tra cui la proteina chinasi attivata da mitogeni / extracellulare proteina chinasi segnale-regolata (MAPK / ERK), fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) e fosfolipasi C-gamma (PLCγ). Le proteine ​​che partecipano a queste vie di segnalazione sono confezionati su strutture vescicolari endocitiche per formare il BDNF / TrkB segnalazione endosome ^1-6 che vengono poi retrograda trasportato al soma neuronale.

La camera di coltura microfluidica è una piattaforma molto utile per studiare biologia assonale in condizioni normali sia in ambito di lesioni e malattia ^7,8. Con assoni isolantidai corpi cellulari, il dispositivo ha permesso di studiare un trasporto specificatamente assoni ^8-10. Le piattaforme basate microfluidica PDMS con 450 micron barriere microsolchi utilizzati in questo studio sono stati acquistati in commercio (vedi tabella Materials). Per esaminare i trasporti BDNF, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per la produzione di monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Abbiamo approfittato del peptide biotina accettore, AP (noto anche come AviTag). Si tratta di una sequenza di acido 15 aminoacidi che contiene un residuo di lisina che possono essere specificamente ligato ad un biotina dal coli ligasi enzima biotina Escherichia, Bira. Abbiamo fuso il AviTag al C-terminale del mouse pre-proBDNF cDNA mediante PCR (Figura 1A). Il costrutto è stato clonato nel vettore di espressione di mammifero, pcDNA3.1-myc suo vettore. Abbiamo anche clonato il DNA batterico Bira nel pcDNA3.1-myc suo vettore. I due plasmidi sono stati transitoriamente co-trasfettate in cellule HEK293FT di esprimere entrambe le proteine. Bira catalizzata la legatura di Biotin particolare per la lisina risiedere nel AviTag al C-terminale di BDNF in un rapporto 1: 1 per produrre monobiotinylated BDNF monomero. Biotinilato, maturo BDNF con una massa molecolare di circa 18 kDa è stato recuperato e purificato dal supporto utilizzando Ni-resina (Figura 1C). La biotinilazione di BDNF era completa, come giudicato dalla incapacità di rilevare non modificato BDNF mediante immunoblotting (Figura 1D). Streptavidina punti quantici coniugati QD 655, sono stati usati per etichettare mBtBDNF per fare QD-BDNF. La presenza del AviTag non interferisce con l'attività di BDNF come mBtBDNF era in grado di attivare TrkB fosforilata (Figura 1E) e stimolare la crescita dei neuriti (Figura 1F) nella misura del BDNF umano ricombinante (rhBDNF). Immunostaining dimostrato che QD-BDNF colocalizzava con TrkB in assoni ippocampali, indicando che QD-BDNF è bioattivo (Figura 1G). Per studiare il trasporto BDNF, QD-BDNF è stato aggiunto al compartimento assonale distale diculture microfluidica contenenti ratto E18 neuroni dell'ippocampo (Figura 2A). QD-BDNF trasporto retrogrado all'interno di assoni è stato catturato da in tempo reale di immagini dal vivo del tag fluorescente rossa (supporto video S1, S2). Analizzando il chimografo generato, QD-BDNF è stato osservato per essere trasportato retrograda ad una velocità di movimento intorno 1,06 micron / sec (Figura 3A). GFP o mCherry-tagged BDNF sono stati utilizzati per tracciare il movimento assonale di BDNF. I principali svantaggi sono che non sono abbastanza luminose per gli studi di singola molecola. Inoltre, la presenza di entrambi anterograda e movimenti retrogradi BDNF rende difficile valutare se il BDNF retrograda trasportato era in un complesso neurotrofina / recettore.

In questo video, dimostriamo le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari. Il ultrabrightness ed eccellente fotostabilità dei punti quantici makes 'possibile effettuare il monitoraggio a lungo termine del trasporto BDNF. Queste tecniche possono essere sfruttati per migliorare gli studi di funzione assonale in AD, HD, e altre patologie neurodegenerative.

Protocollo

Le procedure chirurgiche e animali sono eseguite rigorosamente secondo la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti che comportano l'uso di animali sono approvati dal UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.

1 plasmidi clonazione, espressione e purificazione di Mono-biotinilato BDNF (mBtBDNF)

NOTA: Construct pre-proBDNFavi e Bira cDNA in pcDNA3.1 vettoriale e coesprimere nelle cellule HEK293FT ^10. Purificare mBtBDNF utilizzando Ni-NTA perline secondo il metodo precedentemente pubblicata di produrre fattore maturo e biologicamente attiva di crescita nervoso monobiotinylated (mBtNGF) ^10.

2 Preparazione di microfluidici Chambers

Microfluidic dispositivo neurone coltura rende possibile isolare fluidicamente assoni provenienti da corpi cellulari dei neuroni. Montare camere con vetrini rivestiti di fresco giusto prima di ogni dissezione. Camere di microfluidica usatein questo protocollo sono regolarmente acquistati (vedi Materiali e tabella di attrezzature). Lavare a mano e riutilizzati camere di commercio acquistati fino a 5-6x.

1. Lavaggio a mano camere di microfluidica in 1% Alconox. Risciacquare tre volte con acqua Milli-Q per 30 minuti ciascuno. Camere di lavaggio a mano di nuovo in etanolo al 70%.
2. Stendere camere ad asciugare su Parafilm in cappa a flusso laminare. Irradiare e sterilizzare entrambi i lati delle camere per 20 minuti sotto UV. Conservare sterilizzato camere in un piatto 15 centimetri sterile sigillato con Parafilm a temperatura ambiente.
3. Mettere 24 x 40 mm N. 1 vetrini in un contenitore di vetro. Mettere a bagno i coprioggetti in 35% acido cloridrico durante la notte su un rotatore. Il giorno seguente, sciacquare i vetrini tre volte per 30 minuti ciascuno con acqua.
4. Sterilizzare i coprioggetti uno per uno per immersione ogni coprioggetto in 100% etanolo e fiammeggiante su un becco Bunsen. Conservare coprioggetto secco in una capsula di Petri sterile e tenerlo a temperatura ambiente fino al rivestimento.
5. Lay out i coprioggetti in un piatto di coltura 15 cm. Coat ogni coprioggetto con 0,7 ml di 0,01% di poli-L-lisina (PLL) e incubare nel cappuccio a temperatura ambiente.
6. Dopo 1 ora, sciacquare i vetrini tre volte con acqua sterile. Coprioggetto secco con vuoto e posto ogni coprioggetto in un piatto di cultura 6 cm.
7. Per assemblare la camera microfluidica, posizionare la camera con il lato microsolchi in basso sul coprioggetto rivestito PLL con cautela per non toccare i microsolchi. Premuto delicatamente verso il basso la camera con un puntale per garantire la camera è stata ermeticamente chiusi.

3. Dissezione di Cultura neuronale e piastra su Chambers

1. Posizionare due ippocampi E17-E18 ratto (un cervello) sezionato in un tubo da 15 ml contenente 2 ml di tampone di dissezione (HBSS, no calcio, no magnesio, con 1% pen / strep e HEPES 10 mM. Sciacquare i tessuti 3x con 5 ml dissezione tampone ogni volta. Rimuovere il buffer dissezione per quanto possibile e aggiungere 900 ml di di frescotampone ssection.
2. Per digerire il tessuto, aggiungere 100 ml di tripsina 10x (2,5%) nel buffer dissezione per rendere concentrazione di lavoro 1x. Posizionare il tubo conico in un bagno di 37 ° C Acque. Dopo 10 min di digestione, aggiungere 100 ml di 10 mg / ml di DNasi I a una concentrazione finale di circa 1 mg / ml.
3. Usando una pipetta Pasteur di vetro lucidati a fuoco, triturare delicatamente i tessuti pipettando su e giù 5-10x. Subito dopo triturazione, placare la tripsina con 2 ml di placcatura medio (Neurobasal con 10% FBS, 2 Glutamax mM, 2% B27).
4. Lasciare il campione nella cappa per 5 minuti per consentire eventuali detriti dei tessuti di stabilirsi sul fondo. Rimuovere con cautela 2 ml di surnatante in una sterile tubo da 15 ml pulito e centrifugare a 200 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere il pellet in 50 microlitri mezzi placcatura
5. Contare le cellule con emocitometro. Carico 15-20 microlitri di sospensione cellulare (~ 40.000 cellule) in uno scomparto della camera microfluidica. Posizionare la camerain incubatrice per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare alla coprioggetto. Dopo 10 minuti, aggiungere i media più in piastra per riempire entrambi i comparti della camera.
6. Il secondo giorno della dissezione, sostituire completamente i terreni in piastra con i media manutenzione (Neurobasal con 2 Glutamax mM, 2% B27), sia nel corpo cellulare e il vano assone. Gli assoni dei neuroni dell'ippocampo iniziano a varcare i microsolchi in giorno 3 e raggiungere il vano assone tra il giorno 5-7. Durante questo periodo di tempo, sostituire la metà dei mezzi di coltura con terreno di mantenimento fresco ogni 24 ~ 48 ore.

4 assonale Trasporto di QD-BDNF

1. Prima di vivere l'imaging di QD-BDNF trasporto assonale, esaurire BDNF sia dal corpo cellulare e assone compartimenti della camera microfluidica da sciacquare entrambi i comparti con BDNF-liberi, siero media liberi Neurobasal ogni 30 min per 2 ore.
2. Durante BDNF esaurimento, preparare i coniugati QD-BDNF. Mescolare 50 nM di mono-biotinilato BDNF dimero con 50 Nm coniugati QD655-streptavidina nei media Neurobasal e incubare in ghiaccio per 60 min.
3. Rimuovere il supporto nel vano assone e aggiungere 300 microlitri QD-BDNF con una concentrazione finale di 0,25 nM per 4 ore a 37 ° C. Per ridurre al minimo la diffusione del QD-BDNF nel vano corpo cellulare, è molto importante mantenere sempre un livello superiore di supporto nel vano corpo cellulare che nel vano assone. Lavare non legato QD-BDNF dopo incubazione prima di imaging dal vivo.
4. Eseguire l'imaging dal vivo di trasporto QD-BDNF utilizzando un microscopio invertito dotato di un olio lente obiettivo 100X. Scaldare la portata e la camera ambientale collegato ad esso per una temperatura costante (37 ° C) e CO ₂ (5%). Utilizzare un set di Texas cubi rossi di eccitazione / emissione di visualizzare il segnale QD655.
5. Acquisire e catturare immagini time-lapse all'interno dei assoni centrali alla velocità di 1 fotogramma / sec per un totale di 2 min con una camera CCD. Utilizzare microscanalature senza assoni that non hanno QD e quindi nessun segnale di come controllo per l'infiltrazione.
6. Analizzare il trasporto BDNF utilizzando qualsiasi software di analisi dell'immagine o NIH ImageJ.

Risultati

Produzione e purificazione di biologicamente attivi BDNF Mono-biotinilato

Il vettore di espressione di BDNF fuso con una sequenza AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) è stato creato secondo un protocollo già pubblicato ^10. La massa molecolare della proteina di lunghezza completa di fusione è stato previsto per essere ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated BDNF maturo con una massa molecol...

Discussione

In questo studio, riportiamo lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Con coniugando la proteina di quantum dot streptavidina, e l'utilizzo di una camera microfluidica, il metodo permette di rilevare il trasporto assonale di BDNF in neuroni primari con sensibilità singola molecola, in tempo reale e con risoluzioni spaziali e temporali. Gli strumenti utilizzati in questo documento forni...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101