מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Summary

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

Abstract

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI); ההיווצרות והניתוק של קומפלקסי חלבונים, הם אירועי מפתח בתהליכים ביולוגיים רבים (למשל, שכפול, שעתוק, תרגום, איתות, תקשורת תאי תאים). מחקרים חצי כמותית של PPI לעתים קרובות מתבצעים באמצעות נפתחים או ניסויים חיסוניים ממטרים. עם זאת, בטכניקות אלה (ודומים) מוגבלים בטווח של זיקות שניתן למדוד (מייקרו הנמוך וזיקה גבוהה יותר) בשל צעדי הכביסה כי הם טבועים בטכניקות כאלה. טכניקות "נקודת סיום" כזה לא יכול לזהות אינטראקציות זיקה חולפות או נמוכות, כי הם לעתים קרובות השלכות ביולוגיות גדולות. בנוסף, ההחלטה הזמנית של גישות כגון מוגבלת מאוד, בדרך כלל בסדרי גודל איטי יותר מאשר שיעורי התגובה. SPR מתגבר חסרונות אלה בשל רגישותו והחלטה זמנית מעולה ^1,2. SPR הוא שיטה ללא תווית, ובתור שכזואינטראקציה מולקולרית ניתן למדוד (כל עוד ניתן לאתר את שינויי המסה). בנוסף למדד המחירים ליצרן, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין חלבון ליגנד, חלבון תרופתי (או מולקולה קטנה), חלבון ה- DNA, ואינטראקציות החלבון-RNA ^3-5. תוצאות נרשמות וזממו בזמן אמת, המאפשר שינוי מהיר של תנאי ניסוי ועיצוב ניסיוני גמיש.

העיקרון הפיזי מאחורי מכשירים מבוססים SPR הוא הניצול של מערכת אופטית המודדת שינוי של מקדם השבירה על פני השטח החיישן על המסה משתנה ^2. אחד מהשותפים באינטראקציה (ליגנד להלן) הוא משותק על גבי שבב מטריצת פולימר והמולקולה השנייה (אנליטי להלן) הוא זרם על פני השטח. אנליטי מחייב ליגנד משנה את המסה על פני השטח השבב. שינוי מסה זו באופן ישיר ויחסי הקשורים לשינויים במדד השבירה של פני השטח. התוצאות נרשמות בזמן אמת ומוצג כיחידות תגובה (RU) כפונקציה של זמן. כגון עלילה נקראת sensogram (למשל, איור 1). מאז SPR עוקב אחרי מסלול הזמן השלם של האינטראקציה, קבועי קצב הקינטית מראש שיווי משקל נגזרים, בנוסף לשיווי משקל זיקות. כפי שיפורט להלן, מראש שיווי משקל התנהגותה של מערכת נתונה מחזיקה הרבה מידע, ומספקת נקודת מבט שונה מאוד משיווי המשקל לבד. ברגע שהמערכת מכוילת, ניסויים הם מהירים מאוד ודורשים רק כמויות קטנות של חומר חלבונים (מיקרוגרם לננוגרם כמויות). איסוף המידע הקינטית המלא של מערכת נתונה ניתן להשיג בימים. הרגישות הגבוהה של SPR מאפשרת מדידות שאינן אפשריים באמצעות כל טכניקה אחרת ^6. עם זאת, רגישות גבוהה זה היא "חרב פיפיות" שכן הוא יכול להיות מקור עיקרי לנתונים חיוביים כוזבים. כל גורם המשפיע על המדד רעיוני נרשם וזמם על sensogram. ככזה, apבקרות propriate יש להשתמש כדי לחסל שווא-תוצאות חיוביות, ותמיכה מגישות משלימות מומלצת מאוד.

איור 1 מדגים את ההתקדמות של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן מצופה נת"ע. Sensogram בפנל מראה את הזריקה של יוני ניקל על מטריצת נת"ע (נתונים unsubtracted), וBD לוחות להציג את הנתונים לאחר הפחתת האות נגזרת מתא הבקרה השלילי. אדום וחצים כחולים מראים תחילת הזרקה וסופו של דבר, בהתאמה. קיבוע של יגנד על השבב משנה בהדרגה את המסה עד ההזרקה מסתיימת. הרמה היציבה נצפתה לאחר סיום ההזרקה של יגנד משקפת את העמותה היציבה של יגנד אל פני השטח (איור 1, מחזור 2). ברגע שבסיס יציב מושגת חיץ מוזרק מעל ליגנד ותא ההתייחסות (איור 1, מחזור 3) הזרקת .זה משמש כ'ביקורת ריקה ", ויהיהנגרע במהלך ניתוח. על הזריקה, שינויים קלים נרשמים, המשקפים זרימת המונית דרך השבב. לאחר מכן, במחזור נפרד (איור 1 ב, מחזור 4), אנליטי מוזרק; העלייה ההדרגתית בRU מייצגת עמותה של אנליטי ליגנד. אתרי הקישור הופכים בהדרגה הכבושה עד שיגיע לשיווי המשקל. ברגע שההזרקה מסתיימת, ירידה בRUS משקפת ניתוק של המתחם. מsensograms כזה ניתן לגזור קבוע שיעור ריבית לפני שיווי משקל ושיווי המשקל (ראה בהמשך). איור 1 מתאר אינטראקציה בין חולפת יגנד ואנליטי. כאשר האינטראקציה היא יציבה יותר, הירידה ברמת RU היא איטית יותר, המשקף _ד k נמוך יותר.

במסמך זה, אנו מתארים ניסוי SPR שנועד לאפיין את האינטראקציה בין טרנספורטר קרום (חומר ניקוי solubilized) והשותף הפונקציונלי שלה, מצעו המקור שלה מחייב חלבון ^6,7. Mod נבחרמערכת אל היא טרנספורטר קלטת מחייבת ATP (ABC), ModBC-של fulgidus Archeaglobus. מערכת זו נבחרה לתוצאות מאוד לשחזורה, גבוהה יחס אות לרעש, וקלאסי "on / off" שיעורים. בנוסף, מובילי homologues ABC זמינים לשרת בקרות שליליות חשובות. טרנספורטר, ModBC (ליגנד) מופק מקרום שימוש בחומרי ניקוי, מטוהר ומשותק על השבב. שותפו המסיס באינטראקציה, Moda, הוא אנליטי. כיגנד שליטה שלילי, RbsBC טרנספורטר ABC שונה משמש ("ליגנד B").

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. לדוגמא חלבון והצפת הכנה

1. לדוגמא הכנה: לטהר את החלבונים של עניין ולוודא שכל אגרגטים יוסרו, על ידי הזרקת החלבון לפני הניסוי על עמודת ג'ל סינון או על ידי ultracentrifugation (בדרך כלל 10 דקות ב 100,000 XG הוא מספיק).
   הערה: למרות הכנות רצויות, טהורות מאוד חלבון אינן חובה. SPR שמש בהצלחה עם purifications פחות מ-מושלם ואפילו עם סך ^8,9 תמצית.
2. הכנת חיץ:
   1. הכן את החיץ של הניסוי (שמכונה "חיץ ריצה", או RB). לפרוטוקול מתואר כאן, להשתמש 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ"מ NaCl ו 0.05% (w / v) DDM (β-D-maltoside n-Dodecyl). זכור כי הבחירה של הרכב חיץ ניתן לשנות בקלות על פי השיטה למדה.
   2. לסנן את כל המאגרים ודגימות חלבון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. ודא מראש כי מסנני חלבוניםתואם. באופן כללי, פלטפורמות SPR שווקו לאחרונה להכיל דה-גאסר באונליין; אם זה לא המקרה, דה-גז המאגרים לפני שימוש.
   3. Dialyze הלילה או לדלל את הדגימות נגד RB, כדי למנוע חוסר התאמה חיץ. דיאליזה (או כל שיטה אחרת של חילופי חיץ) מומלצת במיוחד בעת שימוש בכימיקלים של צמיגות גבוהה (למשל, סוכרוז, גליצרול, DMSO). לפני חיבור בקבוק RB לכניסת המשאבה לשמור בצד 10 ​​מיליליטר של RB בצינור נפרד.
3. לדלל את מניות יגנד מרוכזות לRB לריכוז סופי של ~ 20 מיקרוגרם / מיליליטר. ככלל אצבע, לקיבוע יגנד יציב, להשתמש בריכוזים נמוכים יגנד עם זריקות כבר בזרימה נמוכה, בניגוד לריכוזים גבוהים, תזרים גבוה וזריקות קצרות יותר.
4. לדלל את אנליטי לRB לריכוז הרצוי. בדרך כלל, לבדוק את הטווח של ריכוזים למערכת של זיקה לא ידועה מ10 מיקרומטר עד 10 ננומטר בדילולים של פי עשרה. תמיד להתחילעם הריכוזים הנמוכים הראשון.

2. שבב חיישן

1. בחירת שבב: השתמש בחומצת nitrilotriacetic (נת"ע) שבב בשילוב מתאים ללכידת חלבונים עם תג אוליגו-היסטידין.
2. שימוש בשבב:
   1. בעת השימוש בשבב חדש, לקחת את השבב החוצה מהנדן, לשטוף בעדינות עם מים מזוקקים כפולים (DDW), לייבש את הנוזלים שנותרו בזהירות באמצעות מגבים עדינים, ולוודא שלא לגעת במשטח שכבת זהב. מניחים את השבב בחזרה לנדנה בכיוון הנכון (ההכנסה היא חלק כאשר השבב ממוקם כראוי).
   2. כאשר שימוש חוזר שבב, להוציא את השבב מאוחסן מהחיץ, לשטוף היטב עם DDW ויבש בעדינות כאמור לעיל, והנח לנדנה המקורי.
      הערה: ההצטברות של זבל חומר שאינו ספציפי על השבב יכולה להשפיע על "הכדאיות" שלה. זה יכול להיות במעקב על ידי השוואת RUS לפני קיבוע יגנד ופוסט הפשטה. למרות מדידות רבות יכולות להיותנעשה שימוש באותו השבב NiNTA, הנושא של אריכות הימים שלו הוא לא "ברור" ומשתנה מאוד בין שבבים שונים.
3. עגינה שבב: פתח את דלת שבב חיישן ולמקם את השבב בנדנה. בעת שימוש בשבב חדש, המספר הסידורי של קלט השבב לשמור תיעוד שימוש. סגור את הדלת ולחץ על 'שבב מזח ".

3. הגדרות טמפרטורה

1. הגדר את טמפרטורת תא שבב 25 ° C (או בטמפרטורת הניסוי המועדפת).
2. אופציונאלי: להגדיר את תא הדגימות עד 7 מעלות צלזיוס כדי לשמור על החלבונים יציבים לאורך כל הניסוי.

4. פתרונות לטעינה ושלילה

הכן את הפתרונות לטעינה וההפשטה הבאים: 0.5 מ"מ NiCl ₂ בRB, 350 mM EDTA בRB (להוסיף חומר ניקוי לפתרון EDTA לריכוז סופי כמו בRB), 0.25% SDS בH ₂ O, ו -100 מ"מ HCl בH ₂ O. בעת שימוש באמבטית מיקרו צנטריפוגותes ולא SPR צינורות מיועדים, אל תשכח לנתק את הכובעים של הצינורות.

5. ראש Instrument SPR עם RB

6. התחל ניו הפעלה

1. הגדר את קצב הזרימה שישמש במהלך הניסוי. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הזרימה 50 μl / min.
   הערה: פרמטר זה יכול להיות שונה במהלך הניסוי.
2. הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור התייחסות. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הנתיבים Fc = 1 וFc = 2, Fc חיסור = 2-1.
   הערה: התכנית תציג בזמן אמת החיסור של שני תאים נמדדו. זכור כי פרמטר זה לא ניתן לשנות במהלך הניסוי.
3. בחר את מדף המדגם המתאים (זה יכול להשפיע על מדגם צריכת הנפח).
4. שמור את קובץ התוצאות.

7. מחזורי ניסוי

כל ניסוי מורכב ממחזורים, לשמור תיעוד ברור של הזריקות נעשו בeaמחזור ch, ולהפריד בין הטעינה 'ligands, ההזרקה ריקה של החיץ, וההזרקה אנליטי למחזורים שונים.

1. טעינת הכנת צ'יפ וניקל: מחזור 1
   1. ודא את הזרימה והנתיבים נקבעים בהתאם לצעד 6.1 ו -6.2.
   2. להזריק 350 mM EDTA ל1 דקות כדי לשטוף את השאריות.
   3. זרימה להגדיר עד 10 μl / min.
   4. הזרק 0.5 מ"מ NiCl ₂ למשך 2 דקות.
      הערה: עכשיו שרף השבב מצופה על ידי יוני ניקל.
2. מחזור 2: ligands קיבוע
   1. זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 2.
   2. הזרק יגנד עד שמגיעים ערכי RU כי הם 10-20 קפל של המשקל המולקולרי שלה. לדוגמא, טען יגנד של 50 kDa ל500-1,000 RUS. שמור תיעוד של ערך RU הושג.
   3. זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1.
   4. הזרק יגנד B (שליטה) עד אותו ערך RU לזה של א 'יגנד צג sensogram החיסור (Fc = 2-1) על השורה כדי לעזור לשלוט באורך הזרקה.
   5. זרימת סט 50 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, לשטוף את המערכת ל5-20 דקות, עד שהבסיס (Fc = 2-1) מייצב.
3. מחזור 3: הזרקה בלנק. הזרקה זה תשמש לחיסור ריק, ולכן כולל את כל המרכיבים שניתן להזריק עם אנליטי, למעט אנליטי עצמו.
   הערה: אורך הזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שנדרש כדי להגיע לשיווי משקל (מישורי אות).
   1. זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, Fc = 2-1 חיסור.
   2. הכנס את הפקודה "לחכות" (להלן כ 'לחכות') במשך 30 שניות (יש בסיס יציב).
   3. הזרק 15 שניות RB.
      הערה: משך ההזרקה ינוע בין מערכות שונות, בהתאם להקבועים מראש שיווי המשקל הקינטית (בעיקר k).
   4. חכה 120-600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק.
      הערה: אורכו של שלב זה משתנה בהתאם ל k _d: איטי דיסוציאציה עוד צעד זה צריך להיות. למתחמי dissociating איטיים מאוד _(ד k <10 ^-4 שניות ^-1), לחכות 10-15 דקות ולאחר מכן להמשיך אל פני השטח התחדשות (ראה בהמשך).
4. מחזור 4: הזרקה אנליטי
   1. העתק / דבק התנאים המדויקים המשמשים בהזרקת ההתייחסות (מחזור 3) ולכן שתי זריקות אלה יכולים להיות מופחתים מאוחר יותר. לשנות את המיקום של החריץ במעמד מהאחד מחזיק את פתרון שליטה לאחד שמחזיק את הפתרון אנליטי. בחר ריכוז שהוא מעט מעל _D K הצפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, לבחור 1 מיקרומטר כנקודת התחלה טובה.
5. מחזור 5: הזרקת מאגר
   1. מחזור חזור על 3.
6. מחזור 6: הזרקה אנליטי
   1. מחזור חזור על 4.
7. מחזור 7: צ'יפ לערטל
   1. זרימה להגדיר עד 50 μl / min.
   2. להזריק 350 mM EDTA דקות 1. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב.
   3. להזריק 0.25% SDS 1 דקות. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב.
   4. אם הוא לא הגיע לרמה בסיסית, להזריק 100 מ"מ HCl דקות 1 כצעד הפשטה נוסף.
   5. הכנס את הפקודה "לרוץ סוף 'שעוברת למצב המתנה.
8. אחסון שבב
   1. הפרד את שבב החיישן ומוציא אותו מהמכשיר זה.
   2. קח את החיישן החוצה מנדנה, להימנע מנגיעה במשטח, לשטוף עם DDW, ומקום בצינור 50 מיליליטר מכיל RB. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.

8. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה יעודיים להערכה

1. בצע את השלבים הבאים כדי לעבד את הנתונים הגולמיים שהושגו על ידי SPR לפני הגזירה של הפרמטרים קינטית.
   1. שימוש בתוכנת ההערכה, פתוחקובץ התוצאות, מחזורים בחרו 3-6 Fc = 2-1 (התייחסות מופחתים נתונים).
   2. משמרת ציר:
      1. מחזורי תצוגה 3-6.
      2. אפס ערך ציר ה- Y של נקודת ההתחלה (זמן ההמתנה 30 שניות הראשוניות בכל מחזור) לכל ארבעת העקומות.
   3. יישר את ציר X- של ארבע עקומות. בחרו תכונות בולטות (לדוגמא, קוצים של תחילת הזרקה או לסיים) כדי ליישר מושלם ארבע עקומות לאורך ציר ה- X. קבע את הזמן של תחילת אנליטי (או חיץ שליטה) לאפס.
2. חיסור התייחסות
   1. הפחת את תגובת רקע על ידי הפחתת עקומה של מחזור 3 מעקום של מחזור 4 ועקומה של מחזור 5 מעקום של מחזור 6. השתמש בפעולת חיסור עקומה שניתן למצוא בציר ה- Y משמרות תפריט.
      הערה: חשוב לבצע שלב זה כפי שהוא מבטל את כל רכיבים ספציפיים (שאינם קשורים לאנליטי) שאולי השפיעו על מקדם שבירת פני השטח.
      1. שמור את העקומות מופחתים בtהוא גיליון של הפרויקט תחת שם אחר.
   2. עיין בעקומות אלה כאל "עקומות מופחתים כפליים": החיסור הראשון הוא החיסור 2-1 מבוצע בשני הזריקות, והשני הוא החיסור של עקומה אחד למשנהו.
      הערה: התייחסות כפולה כזה היא סטנדרטי בניסויי SPR זהב.
   3. כיסוי העקומות מופחתים על ידי ביצוע שינוי ציר כפי שהוסבר קודם לכן.
3. קביעת קבועי קינטיקה ומתאימה מודל
   1. ביצוע ניסוי הקינטית
      1. הזרק סדרה של 6-7 ריכוזים אנליטי ליש לי אמין של נתונים לקביעת קבועים קינטית. בחר ריכוזים אנליטי מ10-לקפל מעל לפי 10 מתחת לאומדן K _D, בדילולי 2-3 פי. כולל ריכוז "אפס", מאוחר יותר המשמש לחיסור כפול התייחסות (ראה לעיל). לנהל זריקות בtriplicates ובסדר אקראיים.
      2. יישרולחסר כל העקומות ביחס לציר Y וציר ה- X לפני שתנסה מודל מתאים.
   2. מתאים מודל
      1. בחר תכנית ניתוח מתאימה.
         הערה: רוב התוכניות מתאימות הזמינות מציעות מספר דגמים שניתן להחיל על הולם ונחישות של קבועים קינטית.
      2. ליישם את המודל הפשוט ביותר (אנגמיור) בהנחת 1 הפיכה: אינטראקציה בין 1 אנליטי ויגנד למתאים. אלא אם כן לשכנע את הנתונים זמינים משיטות ניסיוניות אחרות לקיומה של אינטראקציה מורכבת יותר, תמיד להשתמש במודל אנגמיור פשוט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במערכת המתוארת במסמך זה, שבב NiNTA משמש כדי לשתק את טרנספורטר הקרום מתויג ^6,7. להיות הומו-דימר, כל טרנספורטר מתויג כפליים, שיפור שלה מחייב את שבב NiNTA. בעקבות טעינת ניקל, יגנד (טרנספורטר של עניין) הוא משותק על Fc = 2, עד ~ 3500 RU (מחזור 2 פרוטוקול, איור 2 א תווית שחורה). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

SPR הוא שיטה רגישה מאוד ללמוד אינטראקציות מולקולריות, ולעתים קרובות היא הגישה היחידה שמספקת ניטור של אינטראקציות חולפות (עדיין חשובות) בזמן אמת. דוגמה לכך היא האינטראקציה החולפת המוצגת כאן, שלא ניתן הייתה לזהות בכל דרך אחרת (מבחני נפתחים, מבחני שקיעת יפוזומים ^6). ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab