Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Zusammenfassung

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

Zusammenfassung

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Einleitung

Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche "Endpunkt" Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität Wechselwirkungen, die häufig von großem biologischen Konsequenzen sind. Zusätzlich wird die zeitliche Auflösung solcher Ansätze äußerst beschränkt, üblicherweise um Größenordnungen langsamer als die Raten der Reaktion. SPR überwindet diese Mängel durch seine erhöhte Sensibilität und überlegene Zeitauflösung ^1,2. SPR ist eine markierungsfreie Methode, und als solchemolekulare Wechselwirkung gemessen werden kann (solange die Massenänderung festgestellt werden kann). Neben PPI wurde extensiv verwendet, um Protein-Ligand, Protein-Arzneistoff (oder kleines Molekül), Protein-DNA und Protein-RNA-Interaktionen ^3-5 charakterisieren. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und in Echtzeit, was eine schnelle Abänderung der Versuchsbedingungen und Versuchs flexible Bauweise ermöglicht.

Das physikalische Prinzip hinter SPR basierte Instrumente besteht in der Verwendung eines optischen Systems, das eine Änderung des Brechungsindex misst auf der Sensoroberfläche auf Masse ändert ^2. Einer der Wechselwirkungspartner (hiernach Liganden) auf einer Polymermatrix-Chip und das zweite Molekül (nachstehend Analyt) wird über der Oberfläche floß immobilisiert. Analyt-Bindung an den Liganden verändert die Masse auf der Chipoberfläche. Diese Massenänderung ist direkt und proportional zu Änderungen des Brechungsindex der Oberfläche bezogen. Die Ergebnisse werden in Echtzeit aufgezeichnet undals Reaktionseinheiten (RU) als eine Funktion der Zeit dargestellt. Eine solche Handlung ist eine Sensogramm bezeichnet (zB Abbildung 1). Da SPR folgt die komplette zeitliche Verlauf der Wechselwirkung werden Vorgleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet sind, zusätzlich zu den Affinitäten Gleichgewicht. Wie unten beschrieben, die Vor-Gleichgewichtsverhalten eines Systems hält viele Informationen und bietet eine ganz andere Perspektive als Gleichgewicht allein. Nachdem das System kalibriert ist, sind Versuche sehr schnell und benötigen nur geringe Mengen an Proteinmaterial (Mikrogramm Mengen Nanogramm). Sammeln des kompletten kinetischen Daten von einem gegebenen System kann in Tagen erreicht. Die hohe Empfindlichkeit von SPR-Messungen liefert, die nicht durch ein anderes Verfahren ⁶ sind möglich. Ist diese hohe Empfindlichkeit jedoch ein "zweischneidiges Schwert", da es eine der Hauptquellen für falsch positive Daten sein. Jeder Faktor, der den Brechungsindex beeinflusst wird aufgezeichnet und auf der Sensogramm. Als solche apsprechende Kontrollen müssen genutzt werden, um falsch-positive zu beseitigen, und die Unterstützung von komplementären Ansätzen wird dringend empfohlen.

Abbildung 1 zeigt den Verlauf einer SPR-Experiment unter Verwendung einer NTA-beschichteten Sensorchip. Die Sensogramm in Tafel A zeigt die Injektion von der Nickelionen über die NTA-Matrix (unsubtrahierter Daten) und Platten BD die Daten anzeigen nach Abzug des aus der negativen Kontrollzell abgeleiteten Signals. Rote und blaue Pfeile zeigen Einspritzbeginn und das Ende auf. Immobilisieren des Liganden auf den Chip schrittweise verändert, bis die Masse Einspritzung beendet. Das nach Beendigung der Einspritzung von Ligand beobachtet stabiles Plateau spiegelt die stabile Assoziation des Liganden an der Oberfläche (1B, Zyklus 2). Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist ein Puffer gegenüber dem Liganden und der Referenzzelle (1B, Zyklus 3) .Dieses Injektion dient als "Blindkontrolle" eingespritzt, und werdenwährend der Analyse abgezogen. Nach der Injektion werden kleinere Änderungen aufgezeichnet, was eine Strömung von Masse durch den Chip. Dann in einem separaten Kreislauf (Abbildung 1B, Zyklus 4), der Analyt eingespritzt wird; Die schrittweise Erhöhung der RU stellt Verband des Analyten an den Liganden. Die Bindungsstellen allmählich besetzt, bis ein Gleichgewicht erreicht wird. Sobald Einspritzung endet, ein Rückgang der EVU spiegelt Dissoziation des Komplexes. Aus solchen Sensogramme Pre-Gleichgewicht und Gleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden können (siehe unten). Abbildung 1 zeigt eine transiente Interaktion zwischen dem Liganden und Analyten. Wenn die Interaktion ist stabiler, ist der Rückgang der EVU-Ebene langsamer, was auf einen geringeren k _d.

Hier beschreiben wir eine SPR-Experiment am Charakterisieren der Wechselwirkung zwischen einem Membrantransporter (solubilisiertem) und seine funktionellen Partner seinen zugehörigen Substrat-Bindungsprotein ^6,7 gerichtet. Die gewählte model-System ist ein ATP-Bindungs-Cassette (ABC) Transporter, ModBC-A von Archeaglobus fulgidus. Dieses System wurde für die sehr gut reproduzierbare Ergebnisse "on / off" Raten ausgewählt, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und klassisch. Darüber hinaus sind Homologen ABC-Transporter zur Verfügung als wichtige negative Kontrollen dienen. Der Transporter, ModBC (Ligand A) von der Membran mit Reinigungsmittel, gereinigt und auf den Chip immobilisiert extrahiert. Seine löslichen Interaktionspartner, ModA ist der Analyt. Als Negativkontrolle Ligand wird eine andere ABC-Transporter RbsBC verwendet ("Ligand B").

Protokoll

1. Proteinproben und Buffer Vorbereitung

1. Probenvorbereitung: Reinigung der Proteine ​​von Interesse und sicherzustellen, dass alle Aggregate entfernt werden, durch Injizieren des Proteins vor dem Experiment auf eine Gelfiltrationssäule oder durch Ultrazentrifugation (üblicherweise 10 Minuten bei 100.000 xg genügt).
   HINWEIS: Obwohl wünschenswert, hochreinen Proteinpräparate sind kein Muss. SPR wurde erfolgreich mit weniger-als-perfekte Reinigungen und sogar mit Gesamtextrakt ^8,9 verwendet.
2. Buffer Zubereitung:
   1. Bereiten des Puffers des Experiments (als "Laufpuffer" oder RB). Für das hier beschriebene Protokoll verwendet 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% (w / v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltosid). Denken Sie daran, dass die Wahl der Pufferzusammensetzung kann leicht nach dem untersuchten System geändert werden.
   2. Filter alle Puffer und Proteinproben mit 0,22 um-Filter. Vergewissern Sie sich vorher, dass die Filter Protein-kompatibel. Im allgemeinen enthalten kurzem vermarktet SPR Plattformen einen Inline-de-gasser; wenn dies nicht der Fall ist, de-Gas die Puffer vor der Verwendung.
   3. Dialyse über Nacht in verdünnter oder die Proben vor dem RB-Puffer zu Fehlanpassungen zu vermeiden. Dialyse (oder jede andere Methode der Pufferaustausch) empfiehlt sich insbesondere bei der Verwendung von Chemikalien von hoher Viskosität (zum Beispiel Saccharose, Glycerin, DMSO). Vor dem Anschluss des RB-Flasche zum Pumpeneinlaß beiseite stellen 10 ml des RB in einem separaten Röhrchen.
3. Konzentrierten Ligand Lager in RB auf eine Endkonzentration von ~ 20 & mgr; g / ml. Als Faustregel gilt, für eine stabile Liganden Immobilisierung nutzen niedrigen Ligandenkonzentrationen mit mehr Injektionen bei niedrigen Strömungs, im Gegensatz zu hohen Konzentrationen, hohe Strömungs und kürzere Injektionen.
4. Verdünne den Analyten in der RB auf die gewünschte Konzentration. In der Regel testen die Konzentrationsbereich für ein System von unbekannten Affinität von 10 um bis 10 nM in zehnfacher Verdünnung. Beginnen Sie immermit den niedrigeren Konzentrationen ersten.

2. Sensor Chip

1. Chip-Auswahl: Mit einem Nitrilotriessigsäure (NTA) gekoppelt Chip geeignet für die Aufnahme von Proteinen mit einem Oligo-Histidin-Tag.
2. Chip-Nutzung:
   1. Bei Verwendung einer neuen Chip, nehmen Sie den Chip aus dem Mantel, spülen Sie vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser (DDW), trocknen sorgfältig verbleibenden Flüssigkeiten mit empfindlichen Scheibenwischer, und sicherstellen, dass die Goldschichtoberfläche nicht zu berühren. Setzen Sie den Chip in die Scheide in der richtigen Ausrichtung (die Einfügung ist glatt, wenn der Chip richtig platziert ist).
   2. Bei Wiederverwendung einen Chip, nehmen Sie die gespeicherten Chip aus dem Puffer, gründlich mit DDW und trocken leise, wie oben angegeben, und legen Sie in die ursprüngliche Hülle.
      HINWEIS: Die Akkumulation unspezifischer Junk Materials auf dem Chip kann seine Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Dies kann durch den Vergleich der EVU vor der Liganden Immobilisierung und nach Abstreifen überwacht werden. Obwohl viele Messungen könnengetan mit der gleichen NiNTA Chip, die Frage der seine Langlebigkeit ist kein 'eindeutig' und variiert stark zwischen verschiedenen Chips.
3. Chip-Docking: Öffnen Sie den Sensorchip Tür und setzen Sie den Chip in der Scheide. Bei Verwendung einer neuen Chip, um die Seriennummer Eingang des Chips Verwendungsdatensatz zu halten. Schließen Sie die Tür und drücken Sie "Dock-Chip".

3. Temperatureinstellungen

1. Gesetzt den Chip Zelltemperatur auf 25 ° C (oder der bevorzugten Experiment Temperatur).
2. Optional: Legen Sie die Proben Raum auf 7 ° C, um die Proteine ​​während des gesamten Experiments stabil zu halten.

4. Lösungen für die Be-und Abisolieren

Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Laden und Abziehen: 0,5 mM NiCl ₂ in RB, 350 mM EDTA in RB (das Waschmittel zu EDTA-Lösung bis zu einer Endkonzentration wie in RB), 0,25% SDS in H ₂ O und 100 mM HCl in H ₂ O. Bei der Verwendung von Mikrozentrifugen Badewannees und nicht bezeichnet Rohre SPR, vergessen Sie nicht, schneiden Sie die Kappen der Rohre.

5. Minister die SPR Instrument mit RB

6. Starten Sie einen neuen Run

1. Die Durchflussrate, die während des Experiments verwendet werden. Um die hier beschriebenen Ergebnisse zu erzielen setzen die Strömung auf 50 ml / min.
   HINWEIS: Dieser Parameter kann während des Experiments geändert werden.
2. Definieren Sie die Fließwege und Bezugs Subtraktion. Um die hier beschriebenen setzen die Pfade Fc = 1 und Fc = 2, Subtraktion Fc = 2-1 Ergebnisse zu erzielen.
   HINWEIS: Das Programm wird in Echtzeit angezeigt werden die Subtraktion der beiden Messzellen. Beachten Sie, dass dieser Parameter nicht während des Experiments geändert werden.
3. Wählen Sie den geeigneten Probenträger (kann das Probenvolumen Verbrauch beeinflussen).
4. Speichern Sie die Ergebnisdatei.

7. Experiment Cycles

Jeder Versuch wird von Zyklen besteht, halten eine klare Aufzeichnung der Injektionen in ea getanch-Zyklus, und trennen Sie die Liganden 'Laden, leere Injektion des Puffers und den Analyten Injektion in verschiedenen Zyklen.

1. Zyklus 1: Chip Vorbereitung und Nickelbeladung
   1. Stellen Sie sicher, der Fluss und Wegen eingestellt werden gemäß Schritt 6.1 und 6.2.
   2. Injizieren Sie 350 mM EDTA für 1 min abzuwaschen Reste.
   3. Stellen Strom bis 10 ml / min.
   4. Injizieren 0,5 mM NiCl ₂ für ₂ min.
      HINWEIS: Nun ist die Chip Harz durch Nickelionen beschichtet.
2. Zyklus 2: Liganden Immobilisierung
   1. Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 2.
   2. Injizieren Ligand A bis zum Erreichen RU Werte 10-20fache seines Molekulargewichts sind. Legen Sie zum Beispiel einen Liganden von 50 kDa bis 500-1.000 EVU. Halten Sie eine Aufzeichnung des RU-Wert erreicht.
   3. Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1.
   4. Injizieren Ligand B (Kontrolle) bis zu der gleichen RU Wert wie der Ligand A. Überwachen Sie die Subtraktion Sensogramm (Fc = 2-1) Online, um die Kontrolle derInjektionslänge.
   5. Set Strom auf 50 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, waschen Sie das System für 5-20 Minuten, bis die Grundlinie (Fc = 2-1) stabilisiert.
3. Zyklus 3: Leer Injektion. Diese Injektion wird für leere Subtraktion dienen somit alle Komponenten, die mit dem Analyten injiziert werden, mit Ausnahme des Analyten selbst.
   HINWEIS: Injektionslänge kann in Abhängigkeit von der Zeit bis zum Gleichgewichtszustand (Signal Plateaus) erreichen dauert variieren.
   1. Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, Fc = 2-1 Subtraktion.
   2. Legen Sie die 'warten' Befehl für 30 Sekunden (im Folgenden als "warten" genannt) (eine stabile Basislinie haben).
   3. Injizieren Sie 15 Sek RB.
      HINWEIS: Die Dauer der Einspritzung zwischen verschiedenen Systemen variieren, abhängig von ihrer Vorgleichgewicht kinetischen Konstanten (meist k _a).
   4. Warten 120-600 sec, um die Dissoziationsphase aufzuzeichnen.
      HINWEIS: Die Länge dieser Schritt ist je nach der k _d: Je langsamer die Dissoziation der längere dieser Schritt sein muss. Für sehr langsam dissoziierende Komplexe (k _d <10 ^-4 s ^-1), warten Sie 10-15 Minuten und gehen dann an die Oberfläche Regeneration (siehe später).
4. Zyklus 4: Analyt Injektion
   1. Copy / die genauen Bedingungen in der Referenzeinspritz (Zyklus 3), so dass diese zwei Injektionen kann später abgezogen werden verwendet, einfügen. Ändern Sie die Position der Steckplätze im Rack von dem Halten der Kontroll-Lösung, eine, die den Analyten-Lösung hält. Wählen Sie eine Konzentration, die über dem erwarteten K _D leicht ist. Wenn keine Vorkenntnisse vorhanden ist, wählen Sie 1 uM als guter Ausgangspunkt.
5. Zyklus 5: Pufferinjektion
   1. Taktgeber 3.
6. Zyklus 6: Analyt Injektion
   1. Taktgeber 4.
7. Zyklus 7: Chip abzustreifen
   1. Stellen Strom auf 50 ml / min.
   2. Injizieren 350 mM EDTA für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen.
   3. Injizieren von 0,25% SDS für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen.
   4. Falls der Ausgangspegel nicht erreicht ist, zu injizieren 100 mM HCl für 1 min als zusätzliches Stripping-Schritt.
   5. Legen Sie die "End-Run" Befehl, den Standby-Modus schaltet.
8. Chip-Speicher
   1. Docken Sie den Sensorchip und nehmen Sie es aus dem Gerät.
   2. Nehmen Sie den Sensor heraus aus der Scheide, berühren nicht die Oberfläche gründlich mit DDW, und in einen 50-ml-Röhrchen mit RB. Lagerung bei 4 ° C.

8. Datenanalyse mit Ausgewiesene Auswertesoftware

1. Führen Sie folgende Schritte, um die von SPR vor Ableitung der kinetischen Parameter erhalten Rohdaten verarbeiten.
   1. Mit der Auswertesoftware, offendie Ergebnisdatei, wählen Zyklen 3-6 Fc = 2-1 (Referenz abgezogen Daten).
   2. Achsenverschiebung:
      1. Display-Zyklen 3-6.
      2. Null der Y-Achsen-Wert von der Grundlinie (der ersten 30 sec Wartezeit bei jedem Zyklus), um alle vier Kurven.
   3. Richten Sie die X-Achse der vier Kurven. Wählen ausgeprägten Funktionen (zB Spikes von Injektions Start oder das Ende), um perfekt richten Sie die vier Kurven entlang der X-Achse. Stellen Sie die Zeit des Beginns der Analyt (oder Steuerspeicher) auf Null gesetzt.
2. Referenz Subtraktion
   1. Subtrahieren Sie die Hintergrundantwort durch Subtraktion Kurve der Zyklus 3 von Kurve der Zyklus 4 und Kurve des Zyklus 5 von Kurve Zyklus 6. Verwenden Sie die Kurve Subtraktion, die in der Y-Achse zu finden ist verschiebt Menü.
      HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt, da es keine nicht-spezifischen Komponenten (die nicht mit dem Analyten), die die Oberfläche Brechungsindex beeinflusst haben könnten annulliert durchzuführen.
      1. Speichern Sie die abgezogen Kurven in ter Blatt des Projekts unter einem anderen Namen.
   2. Beziehen sich auf diese Kurven als "doppelt abgezogen Kurven": die erste Subtraktion ist 2-1 Subtraktion beider Einspritzungen durchgeführt wird, und das zweite ist die Subtraktion einer Kurve von einem anderen.
      HINWEIS: Eine solche Doppel Referenzierung ist der Goldstandard in der SPR-Experimente.
   3. Überlagern die Kurven subtrahiert, indem Achsenverschiebung, wie vorstehend erläutert.
3. Bestimmung der Kinetik-Konstanten und Modellanpassung
   1. Die Durchführung einer kinetischen Experiment
      1. Spritzen Sie eine Reihe von 6-7 Analytkonzentrationen, um eine zuverlässige Daten zur kinetischen Konstanten Bestimmung haben. Wählen Analytkonzentrationen von 10-fach über den 10-fach unter der geschätzten K _D, in 2-3-fach-Verdünnungen. Fügen Sie die "Null" Konzentration, später für Doppelreferenz Subtraktion verwendet (siehe oben). Führen Injektionen in dreifacher Ausführung und in zufälliger Reihenfolge.
      2. Ausrichtenund subtrahieren Sie alle Kurven in Bezug auf die Y-Achse und X-Achse, bevor Modellanpassung.
   2. Modellanpassung
      1. Wählen Sie einen geeigneten Analyseprogramm.
         HINWEIS: Die meisten verfügbaren passend Programme bieten mehrere Modelle, die für die Montage und die Bestimmung der kinetischen Konstanten angewendet werden können.
      2. Anwenden das einfachste Modell (Langmuir) unter der Annahme einer reversiblen 1: 1-Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Liganden für den Einbau. Es sei denn, überzeugende Daten aus anderen experimentellen Methoden für die Existenz einer komplexen Interaktion, immer den einfachen Langmuir-Modell.

Ergebnisse

In dem hier beschriebenen System wird eine NiNTA Chip verwendet, um die His-markierte Membrantransporter ^6,7 immobilisieren. Wobei ein Homodimer ist jedes Transporters doppelt markiert, die Verbesserung seiner Bindung zum NiNTA-Chip. Nach Nickelbeladung, Liganden A (der Transporter von Interesse) auf Fc = 2 immobilisiert, bis ~ 3500 RU (Protokoll Zyklus 2, 2A black label). Dann werden mit dem gleichen Strömungs und Einspritzdauer, Ligand B (Kontrollliganden) an Fc = 1 eingespritzt wird, zun?...

Diskussion

SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays ⁶⁾ festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualita...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab