Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Özet

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Özet

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Giriş

Protein-protein etkileşimleri (ÜFE); oluşumu ve protein kompleksleri ayrışma, birçok biyolojik süreçler (örneğin, replikasyon, transkripsiyon, çeviri, sinyal, hücre-hücre iletişim) anahtar olaylardır. ÜFE Yarı kantitatif çalışmalar genellikle çekme-aşağı veya immün-yağış deneyleri kullanılarak yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu (ve benzeri) teknikleri nedeniyle bu tür teknikler doğasında olan yıkama adımları için ölçülebilir afinite aralığında (düşük mikromolar ve daha yüksek afinite) sınırlıdır. Bu tür "son nokta" teknikleri genellikle büyük biyolojik sonuçları vardır geçici veya düşük afinite etkileşimleri tespit edemez. Buna ek olarak, bu yaklaşımların zamansal çözünürlüğü derece, reaksiyon oranlarının daha yavaş büyüklük genellikle sipariş sınırlıdır. SPR nedeniyle artan hassasiyet ve üst temporal çözünürlük ^1,2 bu eksikliklerin üstesinden gelir. SPR gibi ve bir etiket içermeyen bir yöntemdir(kütle değişiklikleri tespit edilebilir olduğu sürece) moleküler etkileşim ölçülebilir. PPI ek olarak, geniş bir protein-ligand ve protein-ilaç (veya küçük molekülü) ve protein-DNA ve protein-RNA etkileşimi ^3-5 karakterize etmek için kullanılmaktadır. Sonuçlar kaydedildi ve deneysel koşullar ve esnek deneysel tasarım hızlı değiştirilmesini sağlar gerçek zamanlı, çizilir.

SPR temelli araçların arkasında fiziksel prensibi kütle ² değiştirir üzerine sensör yüzeyinde kırılma endeksi bir değişiklik ölçen bir optik sistemin kullanılmasıdır. Etkileşim ortakları (bundan sonra ligand) biri polimer matris çip ve ikinci molekülün (bundan sonra analit) yüzey üzerinde aktı üzerine immobilize edilir. Analit, liganda çip yüzeyi üzerinde kitle değiştirir. Bu kütle değişim, doğrudan ve oransal yüzeyin kırılma indeksi değişikliklerle ilgilidir. Sonuçlar, gerçek zamanlı olarak çizilir vezamanın bir fonksiyonu olarak cevap birimleri (RU) olarak sunulmuştur. Böyle bir komplo, bir sensogram olarak adlandırılır (örneğin, Şekil 1). SPR etkileşimi tamamen zaman sürecini takip ettiğinden ön denge kinetik hız sabitleri afinitelere denge ek olarak elde edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak, belirli bir sistemin ön denge davranışı çok bilgi tutar ve yalnız denge çok farklı bir bakış açısı sağlar. Sistem kalibre sonra, deneyler çok hızlı ve (tutarlar nanogram için mikrogram) protein malzemesinin sadece küçük miktarlarda gerektirir. Verilen bir sistemin kinetik bilgi toplanması gün içinde elde edilebilir. SPR yüksek hassasiyet başka bir teknik kullanılarak ⁶ mümkün değildir ölçümleri tanıyor. Ancak, bu yüksek hassasiyet yanlış pozitif veriler için önemli bir kaynak olabilir çünkü bir 'iki ucu keskin bir kılıç "dir. Yansıtıcı endeksi etkileyen herhangi bir faktör kaydedildi ve sensogram üzerine çizilir. Örneğin, ap Adıpropriate kontrolleri yanlış pozitif ortadan kaldırmak için kullanılması gerekir, ve tamamlayıcı yaklaşımlar destek son derece tavsiye edilir.

Şekil 1, bir NTA-kaplı sensör çipi kullanan bir SPR deney ilerlemesini göstermektedir. Panel A sensogram NTA matris üzerinden nikel iyonlarının (çıkartılmamış veri) enjeksiyonu gösterir ve paneller BD negatif kontrol hücresinden elde edilen sinyal çıkarıldıktan sonra verileri görüntüler. Kırmızı ve mavi oklar sırasıyla, enjeksiyon başlangıç ​​ve bitiş göstermektedir. Enjeksiyon sona kadar çip üzerine ligand İmmobilizasyonu yavaş yavaş kitle değiştirir. ligandın enjeksiyon sona ermesinden sonra gözlenen istikrarlı plato yüzeyi (Şekil 1B, çevrim 2) ligand istikrarlı bir ilişki yansıtır. Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra bir tampon ligand ve .Bu enjeksiyon bir 'boş kontrolü "olarak hizmet vermektedir referans hücresi (döngüsü 3 Şekil 1B) üzerine enjekte edilir, ve olacaktırAnaliz sırasında çıkarılır. Enjeksiyon üzerine, küçük değişiklikler çip sayesinde kitle akışını yansıtan, kaydedilir. Daha sonra, ayrı bir döngü (Şekil 1B, program 4) içinde, analit, enjekte edilir; RU kademeli artış bağına Analitin dernek temsil eder. dengeye ulaşana kadar, bağlanma yerleri yavaş yavaş işgal hale gelir. En kısa sürede enjeksiyon biter gibi, RUs bir düşüş Kompleksin ayrışma yansıtır. Ön denge ve denge hız sabitleri elde edilebilir tür öz sensogramlar itibaren. (Daha sonra bakın) 1 ligand ve analit arasındaki geçici etkileşim tasvir Şekil. Etkileşim daha stabil olduğunda, RU düzeyinde düşüş daha düşük bir k _d yansıtan, yavaştır.

Bu yazıda, aynı kökten gelen substrat proteini ^6,7 bağlayıcı bir membran taşıyıcısı (deterjan çözülebilir) ve fonksiyonel ortağı arasındaki etkileşimi karakterize amaçlayan bir SPR deney tarif. seçilen model sistem, bir ATP bağlama kaseti (ABC), taşıyıcı, Archeaglobus fulgidus arasında ModBC-A'dır. Bu sistem oranları 'on / off', onun yüksek tekrarlanabilir sonuçlar için gürültü oranı yüksek sinyal seçilir ve klasik oldu. Ayrıca, homologları ABC taşıyıcıları olarak önemli negatif kontroller hizmet etmek vardır. taşıyıcı, ModBC (ligant A) deterjan saflaştırılmış ve çip üzerinde hareketsiz kılınmış kullanılarak membran elde edilir. Onun çözünebilir etkileşim ortağı, Moda, analit olduğunu. Negatif kontrol ligand olarak, farklı bir ABC transportör RbsBC ("bağ B") kullanılır.

Protokol

1. Protein Numune Hazırlama ve Tampon

1. Numune hazırlama: ilgi konusu proteinleri saflaştırmak ve bir jel filtrasyon kolonu üzerine ya da ultra-santrifüj ile deney öncesinde proteini enjekte edilerek, tüm gruplar kaldırılır emin olun (100,000 x g yeterlidir genellikle 10 dak).
   NOT: arzu edilen, yüksek ölçüde saf protein preparatları bir zorunluluk olmamakla birlikte,. SPR başarıyla az-daha-mükemmel arındırmalardan ve hatta toplam özü ^8,9 ile kullanılmıştır.
2. Tampon hazırlama:
   1. ("Tampon çalışan" olarak adlandırılan, veya RB) deney tampon hazırlayın. Protokol, burada açıklandığı için, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl ve% 0.05 (ağırlık / hacim) DDM (n-Dodesil β-D-maltozit) kullanın. Tampon bileşiminin seçimi kolayca çalışılan sisteme göre modifiye edilebilir unutmayın.
   2. 0.22 mikron filtreleri kullanarak tüm tamponları ve protein örnekleri Filtre. Filtreler protein olduğundan önceden emin olunUyumlu. Genel olarak, son zamanlarda pazara SPR platformlar bir in-line de-gasser ihtiva eder; Bu durumda, de-gaz değilse önce tamponlar kullanın.
   3. Gecede Dialyze veya tampon uyuşmazlıklarını önlemek için RB karşı örnekleri sulandırmak. Yüksek viskozite kimyasal kullanıldığında Diyaliz (ya da tampon alışverişi başka bir yöntemle), özellikle tavsiye edilmektedir (örneğin, sükroz, gliserol, DMSO). Pompa girişine RB şişe bağlamadan önce ayrı bir tüp içinde bir kenara RB 10 ml tutmak.
3. 20 ug / ml olan bir son konsantrasyona kadar RB içine konsantre bağ stokunu. Yüksek konsantrasyonlarda, yüksek akış ve kısa enjeksiyon aksine kural olarak, istikrarlı ligand Hareketsizleştirmesi için, düşük debide daha uzun enjeksiyonları ile düşük ligand konsantrasyonları kullanın.
4. Istenen konsantrasyona RB içine analit sulandırmak. Tipik haliyle, on misli seyreltmeler 10 nM ile 10 uM bilinmeyen afinite bir sistem için konsantrasyonlarının aralığı test edin. Her zaman başlayacakbirinci alt konsantrasyonlar mevcut olabilir.

2. Sensör Çip

1. Çip seçme a nitrilotriasetik asit (NTA), bir oligo-histidin etiketi olan proteinleri tutulması için müsait bağlanmış çip kullanın.
2. Çip kullanımı:
   1. Yeni bir çip kullanırken, kılıfından çipi çıkarmak çift distile su (DDW) ile hafifçe yıkayın, hassas silecekler kullanılarak dikkatlice kalan sıvıları kapalı kuru ve altın tabakası yüzeyine dokunmamaya dikkat edin. (Çip düzgün yerleştirildiğinde ekleme pürüzsüz) doğru yönde geri kılıf içine çip yerleştirin.
   2. Bir çip yeniden yaparken, tampon saklanan çip almak, yukarıda belirtildiği gibi yavaşça DDW ve kuru ile iyice durulayın ve orijinal kılıf içine yerleştirin.
      NOT: çip üzerinde spesifik olmayan önemsiz malzeme birikimi onun 'canlılığı' etkileyebilir. Bu ligand hareketsizleştirme ve sonrası sıyırma önce RUs karşılaştırarak izlenebilir. Birçok ölçümler olabilir rağmenAynı Ninta çip kullanılarak yapılır, onun uzun ömürlü sorunu 'kesin' değildir ve farklı yongaları arasında büyük ölçüde değişir.
3. Çip yerleştirme: sensör çipi kapağını açın ve kılıf içinde çip yerleştirmek. Yeni bir çip kullanırken, giriş çipin seri numarası kullanım kaydını tutmak için. Kapı ve basın 'dok çip' kapatın.

3. Sıcaklık Ayarları

1. 25 ° C (ya da tercih deney sıcaklığı) çip hücre sıcaklığını ayarlayın.
2. İsteğe bağlı: deney boyunca sabit proteinleri tutmak için 7 ° C örnekleri bölme ayarlayın.

Yükleme ve Sıyırma 4. Çözümler

_H2O RB (RB gibi nihai bir konsantrasyona kadar EDTA çözeltisi deterjan ekleme) RB 0.5 mM _NiCl2, 350 mM EDTA,% 0.25 SDS ve H 100 mM HCI: yükleme ve sıyırma için aşağıdaki çözümleri hazırlanması ₂ O. Mikro santrifüj küvet kullanıldığındaes ve belirlenen tüpler SPR, tüplerin kapaklarını kesmek unutmayın.

5. Başbakan SPR Enstrüman RB ile

6. Yeni Run Başlat

1. Deney sırasında kullanılacak akış hızını ayarlayın. Burada anlatılan sonuçları elde etmek için 50 ul / dk akış ayarlayın.
   NOT: Bu parametre deney sırasında değiştirilebilir.
2. Akış yolları ve referans çıkarma tanımlayın. Burada açıklanan yolları Fc = 1 ve Fc = 2, çıkarma Fc = 2-1 set sonuçlar elde etmek için.
   NOT: Program gerçek zamanlı olarak ölçülen iki hücre çıkarma gösterecektir. Bu parametre deney sırasında değiştirilemez unutmayın.
3. Uygun numune raf seçin (örnek hacmi tüketimini etkileyebilir).
4. Sonuçlar dosyayı kaydedin.

7. Deney döngüleri

Her deney döngüleri oluşur, ea yapılan enjeksiyonlar net bir kaydını tutmakch döngüsü ve ligandlar 'yükleme, tamponunun boş enjeksiyon, ve farklı döngüleri içine analit enjeksiyonu ayrı.

1. Döngü 1: Chip hazırlama ve nikel yükleme
   1. 6.1 ve 6.2 adıma göre akış ve yolları ayarlanmış olduğundan emin olun.
   2. 1 dk kalanlar yıkayacak için 350 mM EDTA enjekte.
   3. 10 ul / dk akış ayarlayın.
   4. 2 dakika boyunca 0.5 mM _NiCl2 enjekte edilir.
      NOT: Şimdi çip reçine nikel iyonlarının tarafından kaplanır.
2. Döngü 2: immobilizasyonunu ligandlar
   1. 15 ul / dk, akış yolu Fc = 2 Set akışı.
   2. Moleküler ağırlığının 10-20 misli olan RU değerleri elde edilene kadar bir ligand enjekte edilir. Örneğin, RU 500-1,000 kadar 50 kDa'lık bir ligand yükleyin. Elde RU değer bir kaydını tutun.
   3. 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 Set akışı.
   4. Ligand A. bu kontrol yardımcı on-line çıkarma sensogram (Fc = 2-1) Monitör aynı RU değerine kadar ligand B (kontrol) enjekteEnjeksiyon uzunluğu.
   5. 50 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2 Set akışı, başlangıçta kadar 5-20 dakika yıkayın sistemi (Fc = 2-1) stabilize.
3. Döngü 3: Boş enjeksiyonu. Bu enjeksiyon, bu nedenle analitin kendi dışında bir analit ile birlikte enjekte edilecek olan tüm bileşenleri içeren boş çıkarma hizmet edecektir.
   NOT: Enjeksiyon uzunluğu denge (sinyal yaylalar) ulaşmak için gereken süre bağlı olarak değişebilir.
   1. 15 ul / dk, akış yolu Fc = 1 ve Fc = 2, Fc = 2-1 çıkarma Set akışı.
   2. 30 saniye ('bekle' olarak bundan sonra anılacaktır) 'bekle' komutunu yerleştirin (istikrarlı bir temel sağlamak için).
   3. 15 sn RB enjekte.
      Not: enjeksiyon süresi öncesi denge kinetik sabitler (çoğunlukla _k) bağlı olarak, farklı sistemleri arasında değişir.
   4. Ayrışma safhasının kaydetmek için 120-600 saniye.
      NOT: Bu adım uzunluğu göre değişir k _d: ayrışma artık bu adımı olmalıdır yavaş. Çok yavaş ayrıştıracak kompleksleri (k _d <10 ^-4 sn ^-1) için, 10-15 dakika bekleyin ve sonra (daha sonra bakın) rejenerasyon yüzey geçin.
4. Döngü 4: analit enjeksiyon
   1. Kopya / referans enjeksiyonu (döngüsü 3) bu yüzden bu iki enjeksiyonları sonra çıkartılabilir kullanılan tam koşullar yapıştırın. Analit çözümü tutan bir kontrol çözümü tutan birinden rafa yuvanın yerini değiştirin. Beklenen K _D biraz üzerinde bir konsantrasyon seçin. Hiçbir ön bilgi varsa, iyi bir başlangıç ​​noktası olarak 1 mcM seçin.
5. Döngü 5: Tampon enjeksiyon
   1. Tekrar döngüsü 3.
6. Döngü 6: analit enjeksiyon
   1. Tekrar döngüsü 4.
7. Döngü 7: Chip kapalı şerit
   1. 50 ul / dk akış ayarlayın.
   2. 1 dakika için 350 mM EDTA enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın.
   3. 1 dakika boyunca% 0.25 SDS enjekte edilir. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Bu çip zarar verebilir 3 dakika tek bir enjeksiyon kullanmayın.
   4. Taban çizgisi seviyesi ulaşılamaması halinde, ilave sıyırma aşaması olarak 1 dakika için 100 mM HCI enjekte edilir.
   5. Bekleme moduna geçer 'uç koşmak' komutunu yerleştirin.
8. Çip depolama
   1. Sensör çip çıkarın ve cihazın dışarı almak.
   2. Kendi kılıfından sensörü çıkartın yüzeyine dokunmaktan kaçının, DDW ile durulayın ve RB içeren 50 ml'lik bir tüp içinde yer. 4 ° C'de saklayın.

8. Veri Analizi Değerlendirme Yazılımı Belirlenmiş kullanma

1. Kinetik parametrelerin türetme önce SPR tarafından elde edilen ham verilerin işlenmesi için aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Değerlendirme yazılımını kullanarak, açıksonuç dosyası seçin döngüleri 3-6 Fc = 2-1 (referans verilerini çıkarılır).
   2. Eksen kayması:
      1. Ekran döngüleri 3-6.
      2. Sıfır dört eğriler için taban (her döngüsünde ilk 30 sn bekleme süresi) Y-ekseni değeri.
   3. Dört Eğrilerin X eksenini hizalayın. Belirgin özellikleri seçin (örneğin, enjeksiyon başlangıç ​​veya bitiş zamanları) mükemmel X-ekseni boyunca dört eğrileri hizalamak için. Sıfıra analit (veya kontrol tamponu) başladığı zamanı ayarlayın.
2. Referans çıkarma
   1. Kullan Y-ekseninde bulunabilir eğri çıkarma işlemi menüsünü kaydırır döngüsü 6. eğriden döngüsü 4 ve döngüsü 5 eğrisinin gelen döngüsü 3 eğrisini çıkarılarak arka plan yanıtı çıkartın.
      NOT: Bu yüzey kırılma indeksi etkilemiş olabilir (analit ilgisiz) herhangi bir spesifik olmayan bileşenleri iptal etti bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir.
      1. T çıkarılır eğrileri kaydetO farklı bir isim altında projenin sac.
   2. "Çifte çıkarılır eğriler" olarak bu eğrilerin bakın: İlk çıkarma hem enjeksiyonlar gerçekleştirilir 2-1 çıkarma ve ikinci diğerinden eğrinin çıkarma olduğunu.
      NOT: Bu tür çift referans SPR deneyler altın standarttır.
   3. Daha önce açıklandığı gibi eksen kayması gerçekleştirerek çıkarılır eğrileri Yerleşimi.
3. Kinetik sabitler ve model montaj belirlenmesi
   1. Bir kinetik deney yapılması
      1. Kinetik sabitlerin belirlenmesi için güvenilir bir veri için 6-7 analit konsantrasyonları bir dizi enjekte edilir. Dan analit konsantrasyonunu seçin 2-3 kat seyreltilerde, tahmin K _D altında 10 kat yukarıda 10 kat. Daha sonra (yukarıya bakınız) çift referans çıkarma için kullanılan "sıfır" konsantrasyonu, ekleyin. Üçlü ve rastgele sırayla enjeksiyonları Davranış.
      2. Hizalamave model uydurma denemeden önce Y-ekseni ve X-eksenine göre tüm eğrileri çıkarma.
   2. Model uydurma
      1. Uygun analiz programı seçin.
         NOT: Çoğu mevcut montaj programları uydurma ve kinetik sabitleri tayini için uygulanabilir çeşitli modeller sunuyoruz.
      2. Analit ve montaj için ligand arasındaki etkileşimi 1: geri dönüşümlü bir 1 varsayarak basit modeli (Langmuir) uygulayın. Veri ikna daha karmaşık bir etkileşim varlığı için diğer deneysel yöntemler kullanılabilir sürece, her zaman basit, Langmuir modeli kullanın.

Sonuçlar

Burada tarif edilen bir sistemde, Ninta çip His ile etiketlenmiş zar taşıyıcı ^6,7 hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Bir homo-dimer olmak, her taşıyıcı iki kat onun Ninta çip bağlanması iyileştirilmesi, etiketlenir. Nikel yükleme, ligand A (faiz taşıyıcı) ardından RU 3,500 ~ kadar, Fc = 2 üzerine immobilize edilir (protokol döngüsü 2, Şekil 2A siyah etiket). Ardından, aynı akışı ve enjeksiyon süresi, ligand B (kontrol ligandı) kullanarak başlangıçt...

Tartışmalar

SPR moleküler etkileşimleri incelemek için son derece hassas bir yöntemdir ve geçici (henüz önemli) etkileşimlerin gerçek zamanlı izleme sağlar tek yaklaşım genellikle. Bir örnek başka bir yöntemle (açılan deneyleri, lipozomlar sedimantasyon tahlilleri ⁶⁾ tarafından tespit edilememiştir burada sunulan geçici etkileşim vardır. Diğer yöntemler (nicel veya nitel olsun) ölçümleri denge sınırlıdır Dahası, SPR da ön denge kinetiği ölçmek tek tekniklerden biridir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab