Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Resumo

Superfície Plasmon Resonance (SPR) é um método livre de marcador para a detecção de interacções biomoleculares em tempo real. Nisto, um protocolo para uma proteína de membrana: interação experimento receptor é descrita, ao discutir os prós e contras da técnica.

Resumo

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Introdução

Interacções proteína-proteína (PPI); a formação e dissociação de complexos de proteínas, são eventos chave em muitos processos biológicos (por exemplo, a replicação, transcrição, tradução, sinalização, comunicação célula-célula). Estudos semi-quantitativa da PPI são muitas vezes realizados experimentos usando imuno-precipitação pull-down ou. No entanto, estas técnicas (e semelhantes) estão limitados na gama de afinidades que pode ser medida (micromolar baixa e maior afinidade), devido aos passos de lavagem que são inerentes a tais técnicas. Tais técnicas "ponto final" não é possível identificar interações afinidade transitórios ou baixos que muitas vezes são de grandes consequências biológicas. Além disso, a resolução temporal de tais abordagens é extremamente limitada, geralmente ordens de grandeza mais lento do que as taxas de reacção. SPR supera essas deficiências devido à sua sensibilidade e resolução temporal superior ^{a 1,2.} SPR é um método livre de marcador, e como talinteracção molecular pode ser medida (desde que as mudanças de massa pode ser detectado). Em adição a PPI, que tem sido extensamente usado para a caracterização da proteína-ligando, proteína-fármaco (ou molécula pequena), de ADN-proteína, e interacções proteína-RNA ^3-5. Os resultados são registados e representados graficamente em tempo real, que permite a modificação rápida das condições experimentais e desenho experimental flexível.

O princípio por trás física instrumentos baseados SPR é a utilização de um sistema óptico que mede uma alteração do índice de refracção na superfície do sensor sobre a massa muda ^2. Um dos parceiros de interacção ligando (daqui em diante) é imobilizada num chip de matriz de polímero e a segunda molécula (a seguir analito) é feito fluir através da superfície. Ligação do analito ao ligando altera a massa na superfície do chip. Essa mudança de massa é direta e proporcionalmente relacionada a mudanças no índice de refração da superfície. Os resultados são representados graficamente em tempo real eapresentadas como unidades de resposta (RU) como uma função do tempo. Uma tal trama é denominado um sensogram (por exemplo, Figura 1). Desde SPR segue o curso completo do tempo de interacção, pré-equilíbrio constantes de velocidade são derivados, em adição ao equilíbrio afinidades. Tal como pormenorizado abaixo, o comportamento de pré-equilíbrio de um dado sistema mantém muita informação, e fornece uma perspectiva muito diferente do que o equilíbrio sozinho. Uma vez que o sistema é calibrado, as experiências são muito rápidos e exigem apenas pequenas quantidades de material de proteína (microgramas de quantidades de nanogramas). A recolha de informação cinética completa de um dado sistema pode ser conseguida em dia. A elevada sensibilidade da SPR proporciona medições que não são possíveis usando qualquer outra técnica de ^6. No entanto, essa alta sensibilidade é uma "faca de dois gumes", pois pode ser uma importante fonte de dados falsos positivos. Qualquer fator que afeta o índice de reflexão é gravado e plotados no sensogram. Como tal, apcontroles ade- deve ser usado para eliminar falsos positivos, e apoio de abordagens complementares é altamente recomendado.

A Figura 1 ilustra a progressão de uma experiência de SPR utilizando um chip sensor revestido-NTA. O sensogram no painel A mostra a injecção dos iões de níquel sobre a matriz de NTA (dados unsubtracted), e painéis BD exibir os dados depois de subtrair o sinal obtido a partir da célula de controlo negativo. Setas vermelhas e azuis mostram início de injeção e final, respectivamente. A imobilização do ligando para o chip altera gradualmente até que a massa de injecção é terminada. O patamar estável observada após o término da injecção do ligando reflecte a associação estável do ligando à superfície (Figura 1B, ciclo 2). Uma vez que uma linha de base estável é conseguido um tampão é injectado sobre o ligando e a célula de referência (Figura 1B, ciclo 3) .Este injecção serve como um "controlo em branco", e serásubtraída durante a análise. Após a injecção, pequenas alterações são registadas, reflectindo um fluxo de massa através do chip. Em seguida, num ciclo separado (Figura 1B, ciclo 4), o analito é injectado; o aumento gradual no RU representa associação da substância ao ligando. Os sítios de ligação tornar-se gradualmente ocupada até que o equilíbrio seja atingido. Assim que termina a injeção, um declínio nos RUs reflete dissociação do complexo. A partir de tais sensograms constantes da taxa de pré-equilíbrio e equilíbrio podem ser derivadas (ver mais adiante). A Figura 1 representa uma interacção transiente entre o ligando e o analito. Quando a interação é mais estável, a queda no nível de RU é mais lento, refletindo uma menor k _d.

Relata-se um experimento SPR teve como objetivo caracterizar a interação entre um transportador de membrana (detergente solubilizado) e seu parceiro funcional proteína ^6,7, ligando o seu substrato cognato. O mod escolhidosistema el é um transportador de ATP cassete de ligação (ABC), ModBC-A da Archeaglobus fulgidus. Este sistema foi escolhido por seus resultados altamente reprodutíveis, alta relação sinal-ruído, e clássica "on / off" taxas. Além disso, os transportadores homólogos ABC estão disponíveis para servir como controlos negativos importantes. O transportador, ModBC (ligante A) é extraído a partir da membrana usando detergentes, purificada e imobilizada sobre o chip. Seu parceiro interagindo solúvel, moda, está a analisar. Como um ligando de controlo negativo, um transportador ABC RbsBC diferente é usado ("ligando B").

Protocolo

1. A amostra de proteína e tampão de preparação de

1. Preparação da amostra: purificar as proteínas de interesse e certificar-se de todos os agregados são removidos, através da injecção da proteína antes da experiência, numa coluna de filtração em gel ou por ultracentrifugação (geralmente de 10 minutos a 100.000 xg é suficiente).
   Nota: Embora desejáveis, preparações de proteínas altamente puras não são uma obrigação. SPR tem sido usado com sucesso com purificações menos-que-perfeito e mesmo com ^8,9 total de extrato.
2. Tampão de preparação:
   1. Preparar o tampão do experimento (chamado de "tampão de corrida", ou RB). Para o protocolo descrito aqui, utilizar 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,05% (w / v) DDM (n-dodecil β-D-maltósido). Tenha em atenção que a escolha da composição do tampão pode ser facilmente modificada de acordo com o sistema estudado.
   2. Filtre todos os tampões e amostras de proteína utilizando filtros de 0,22 um. Certifique-se de antemão que os filtros estão em proteínascompatível. Em geral, as plataformas SPR recentemente comercializados contêm um de-Gasser in-line; Se este não for o caso, de-gás buffers antes da utilização.
   3. Dialisar durante a noite ou diluir as amostras contra o RB evitar descasamentos de buffer. A diálise (ou qualquer outro método de troca de tampão) é especialmente aconselhável quando se utiliza produtos químicos de alta viscosidade (por exemplo, sacarose, glicerol, DMSO). Antes de ligar o frasco RB para a entrada da bomba 10 ml manter afastados do RB em um tubo separado.
3. Dilui-se o concentrado em estoque ligando RB para uma concentração final de ~ 20 ug / ml. Como regra geral, para a imobilização do ligando estável, use baixas concentrações ligando com injeções mais longos a baixo fluxo, ao contrário de altas concentrações, alto fluxo e injeções mais curtos.
4. Dilui-se o analito para o RB para a concentração desejada. Normalmente, testar a gama de concentrações para um sistema de afinidade desconhecida a partir de 10 mM a 10 nM em diluições de dez vezes. Comece semprecom as concentrações mais baixas primeiros.

2. Sensor Chip

1. Seleção Chip: Use um ácido nitrilotriacético (NTA) de chip acoplado adequada para captar as proteínas com uma tag oligo-histidina.
2. Uso Chip:
   1. Ao usar um novo chip, tomar o chip fora da bainha, lavar cuidadosamente com água bidestilada (DDW), secar cuidadosamente líquidos remanescentes usando limpadores delicados, e certifique-se de não tocar a superfície da camada de ouro. Coloque o chip na bainha na orientação correta (a inserção é suave quando o chip é colocado corretamente).
   2. Ao reutilizar um chip, tirar o chip armazenado a partir do buffer, lavar abundantemente com DDW e seque delicadamente como dito acima, e coloque em sua bainha de origem.
      NOTA: O acúmulo de material de sucata não específico no chip pode afetar a sua "viabilidade". Isto pode ser monitorizado através da comparação do EF antes da imobilização do ligando e pós-extracção. Embora muitas medições podem serfeito usando o mesmo chip NiNTA, a questão da sua longevidade não é uma 'clara' e varia muito entre as diferentes fichas.
3. Chip de ancoragem: Abra a porta do chip sensor e colocar o chip na bainha. Ao usar um novo chip, número de série de entrada do chip para manter registro de uso. Feche a porta e pressione "chip doca '.

3. Ajustes de Temperatura

1. Definir a temperatura da célula de chip para 25 ° C (ou a temperatura preferida experimento).
2. Opcional: definir o compartimento de amostras de 7 ° C para manter as proteínas estáveis ​​ao longo da experiência.

4. Soluções para carga e decapagem

Preparar as seguintes soluções de carregamento e extracção: 0,5 mM de _NiCl2 em RB, EDTA 350 mM em RB (adicionar detergente para solução de EDTA a uma concentração final como em RB), SDS a 0,25% em H ₂ O, e HCl 100 mM em H ₂ O. Ao utilizar banheira micro-centrífugaes e não SPR tubos designados, não se esqueça de cortar as tampas dos tubos.

5. Prime do Instrumento SPR com RB

6. Iniciar um novo Run

1. Definir o caudal que irá ser utilizado durante a experiência. Para obter os resultados descritos aqui definir o fluxo para 50 mL / min.
   NOTA: Este parâmetro pode ser modificado durante o experimento.
2. Definir os caminhos de fluxo e referência subtração. Para obter os resultados descritos aqui definidos os caminhos Fc = 1 e Fc = 2, subtração Fc = 2-1.
   Nota: O programa irá exibir em tempo real a subtração de duas células medidos. Tenha em mente que este parâmetro não pode ser alterado durante o experimento.
3. Selecione o suporte de amostras adequado (que pode influenciar o consumo de volume da amostra).
4. Salve o arquivo de resultados.

7. Experimento Cycles

Cada experiência é composto de ciclos, manter um registro claro das injeções feitas em eAciclo de ch, e separar o carregamento dos ligantes, injeção em branco do buffer, ea injeção analito em ciclos diferentes.

1. Ciclo 1: preparação Chip e níquel carregamento
   1. Certifique-se que o fluxo de caminhos e são definidas de acordo com a etapa 6.1 e 6.2.
   2. Injectar EDTA 350 mM para 1 min para lavar as sobras.
   3. Definir fluxo de 10 ul / min.
   4. Injectar 0,5 mM de _NiCl2 durante 2 min.
      NOTA: Agora, a resina de chip é revestido por iões de níquel.
2. Ciclo 2: Ligantes imobilização
   1. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 2.
   2. Injectar Um ligando até atingir valores UC que são 10-20 vezes do seu peso molecular. Por exemplo, carregar um ligante de 50 kDa para 500-1.000 RUs. Mantenha um registro do valor RU alcançado.
   3. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo Fc = 1.
   4. Injectar ligando B (controlo) até ao mesmo valor de EF enquanto que ligando o monitor A. sensogram subtracção (Fc = 2-1) em linha para ajudar a controlar acomprimento injecção.
   5. Conjunto de fluxo de 50 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, lavar o sistema para 5-20 min, até a linha de base (Fc = 2-1) estabiliza.
3. Ciclo 3: injeção em branco. Esta injecção irá servir para subtracção do branco, por conseguinte, incluir todos os componentes que vão ser injectados com a substância a analisar, com excepção do próprio analito.
   NOTA: Injecção comprimento pode variar dependendo do tempo que demora a atingir o equilíbrio (planaltos sinal).
   1. Conjunto de fluxo de 15 mL / min, caminho de fluxo = 1 Fc e Fc = 2, Fc = 2-1 subtracção.
   2. Insira o comando 'esperar' (referido a seguir como "esperar") durante 30 segundos (para ter uma linha de base estável).
   3. Injectar 15 seg RB.
      NOTA: A duração da injecção variará entre sistemas diferentes, dependendo de suas pré-equilíbrio constantes cinéticas (principalmente o k _a).
   4. Espere 120-600 sec para gravar a fase de dissociação.
      NOTA: A duração deste passo varia de acordo com o k _d: A mais lenta a dissociação do mais este passo precisa ser. Para os complexos dissociar muito lentas (k _d <10 ^-4 seg ^-1), esperar 10-15 minutos e então proceder à tona regeneração (ver adiante).
4. Ciclo 4: Injeção Analyte
   1. Copiar / colar as condições exatas usadas na injeção de referência (ciclo 3), de modo que essas duas injeções podem ser depois subtraído. Alterar a localização do slot no rack da que contém a solução de controle para aquele que detém a solução analisar. Escolha uma concentração que é um pouco acima do K _D esperado. Se nenhum conhecimento prévio está disponível, escolher um? M como um bom ponto de partida.
5. Ciclo 5: injeção de tampão
   1. Repita ciclo 3.
6. Ciclo 6: injeção Analyte
   1. Repita o ciclo de 4.
7. Ciclo 7: Chip despir
   1. Definir fluxo de 50 ul / min.
   2. Injectar EDTA 350 mM durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
   3. Injectar SDS a 0,25% durante 1 min. Repita este passo mais duas vezes. Não use uma única injeção de 3 min, pois isso pode danificar o chip.
   4. Se o nível da linha de base não for atingido, injetar HCl 100 mM durante 1 min como da fase de extracção adicional.
   5. Insira o comando 'run final' que muda para o modo de espera.
8. Armazenamento Chip
   1. Desencaixar o chip sensor e levá-la para fora do instrumento.
   2. Leve o sensor fora da bainha, evite tocar a superfície, enxagúe com DDW, e coloque em um tubo de 50 ml contendo RB. Armazenar a 4 ° C.

8. análise de dados usando o software designado Avaliação

1. Execute as seguintes etapas para processar os dados brutos obtidos por SPR antes derivação dos parâmetros cinéticos.
   1. Usando o software de avaliação, abertao arquivo de resultados, selecione ciclos 3-6 Fc = 2-1 (referência de dados subtraídos).
   2. Axis mudança:
      1. Ciclos de Exibição 3-6.
      2. Zero o valor do eixo Y da linha de base (o tempo de espera de 30 segundos em cada ciclo inicial) para todos os quatro curvas.
   3. Alinhamento do eixo X- das quatro curvas. Escolha recursos pronunciados (por exemplo, pontos de início de injeção ou acabamento) para alinhar perfeitamente os quatro curvas ao longo do eixo-X. Definir a hora de início de objecto de análise (ou tampão de controlo) a zero.
2. Subtração de Referência
   1. Subtrair a resposta de base por subtracção da curva do ciclo 3 a partir da curva de ciclo curva 4 e 5 do ciclo a partir da curva de ciclo 6. Utilização da operação de subtracção curva que pode ser encontrado no eixo Y desloca menu.
      ATENÇÃO: É importante realizar esta etapa em que anula quaisquer componentes inespecíficos (não relacionados à substância) que podem ter influenciado o índice de refração superfície.
      1. Salve as curvas subtraídos em tele folha do projeto com um nome diferente.
   2. Referem-se a estas curvas como "duplamente curvas subtraídos": o primeiro é a subtracção 2-1 subtracção realizada em ambas as injecções, e o segundo é a subtracção de uma curva de outro.
      NOTA: Essa referência dupla é o padrão ouro em experimentos SPR.
   3. Sobrepor as curvas subtraídos realizando mudança de eixo, como explicado antes.
3. Determinação de constantes cinéticas e os ajustes do modelo
   1. Realização de uma experiência cinética
      1. Injectar uma série de concentrações de analito 6-7 para ter um confiável de dados para determinação de constantes cinéticas. Escolha concentrações de analito a partir de 10 vezes superior a 10 vezes inferior à estimativa K _D, em diluições 2-3-dobra. Incluir o "zero" a concentração, mais tarde utilizado para subtração dupla referência (ver acima). Realizar injeções em triplicata e em ordem aleatória.
      2. Alinhare subtrair todas as curvas em relação ao eixo Y e eixo-X antes de tentar modelo de ajustamento.
   2. Montagem Modelo
      1. Selecione um programa de análise adequado.
         NOTA: A maioria dos programas de adaptação disponíveis oferecem vários modelos que podem ser aplicadas para a montagem e determinação das constantes cinéticas.
      2. Aplicar o modelo mais simples (Langmuir) assumindo uma reversível 1: 1 a interação entre o analito e o ligando para o encaixe. A menos que convencer os dados estão disponíveis a partir de outros métodos experimentais para a existência de uma interação mais complexa, use sempre o modelo de Langmuir simples.

Resultados

No sistema aqui descrito, um chip NiNTA é usado para imobilizar o transportador de membrana marcada com His ^6,7. Sendo um homo-dímero, cada transportador é duplamente marcado, melhorando a sua ligação ao chip NiNTA. Após o carregamento de níquel, ligando A (o transportador de interesse) é imobilizada em Fc = 2, até ~ 3500 RU (ciclo de protocolo 2, Figura 2A tarja preta). Em seguida, utilizando o mesmo caudal e da duração da injecção, ligando B (do ligando de controlo) injecta-se ...

Discussão

SPR é um método altamente sensível para estudar interações moleculares, e muitas vezes é a única abordagem que permite o monitoramento em tempo real das interações transitórios (mas importantes). Um exemplo é a interacção transiente aqui apresentada, que não poderia ser detectado por qualquer outro método (ensaios de pull-down, ensaios de lipossomas de sedimentação ^6). Além disso, enquanto que outros métodos são limitados ao equilíbrio medições (seja qualitativo ou quantitativo), SPR é...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab