Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Résumé

Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l'interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique.

Résumé

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Introduction

Les interactions protéine-protéine (PPI); la formation et la dissociation des complexes de protéines, sont des événements clés dans de nombreux processus biologiques (par exemple, la replication, la transcription, la traduction, la signalisation, la communication cellule-cellule). Études semi-quantitative de PPI sont souvent effectuées à l'aide déroulant ou expériences immuno-précipitation. Cependant, ces techniques (et similaires) sont limités dans la gamme des affinités qui peut être mesurée (à faible et une plus grande affinité micromolaire) en raison des étapes de lavage qui sont inhérents à ces techniques. Ces techniques "point final" ne peuvent pas identifier les interactions d'affinité transitoires ou basses qui sont souvent de grandes conséquences biologiques. En outre, la résolution temporelle de ces approches est extrêmement limitée, généralement ordres de grandeur plus lent que les taux de la réaction. SPR surmonte ces lacunes en raison de sa sensibilité accrue et une résolution temporelle supérieure ^1,2. SPR est un procédé sans étiquette, et en tant que telinteraction moléculaire peut être mesurée (à condition que les changements de masse peuvent être détectées). En plus de l'IPP, il a été largement utilisée pour caractériser la protéine-ligand, protéine-médicament (ou une petite molécule), la protéine-ADN et les interactions protéine-ARN ^3-5. Les résultats sont enregistrés et tracés en temps réel, ce qui permet la modification rapide des conditions expérimentales et la conception expérimentale flexible.

Le principe physique derrière instruments basés SPR est l'utilisation d'un système optique qui mesure un changement de l'indice de réfraction sur la surface du capteur change masse sur ^deux. L'un des partenaires d'interaction de ligands (ci-après) est immobilisée sur une puce à matrice de polymère et la deuxième molécule (ci-après analyte) est coulé sur la surface. Analyte liaison au ligand modifie la masse sur la surface de la puce. Ce changement de masse est directement liée et proportionnellement à l'évolution de l'indice de réfraction de la surface. Les résultats sont tracés en temps réel etprésenté sous forme d'unités de réponse (RU) en fonction du temps. Un tel complot est appelé sensogramme (par exemple, la figure 1). Depuis SPR suit le cours du temps complet de l'interaction, de pré-équilibre constantes cinétiques sont dérivés, en plus de l'équilibre affinités. Comme détaillé ci-dessous, le comportement d'un système donné pré-équilibre détient beaucoup d'informations, et offre une perspective très différente de l'équilibre seul. Une fois que le système est étalonné, des expériences sont très rapides et ne ont besoin que de petites quantités de matière protéique (microgramme à des quantités nanogramme). La collecte de l'information cinétique complète d'un système donné peut être réalisé en quelques jours. La grande sensibilité de SPR offre mesures qui ne sont pas possible en utilisant toute autre technique ^6. Cependant, cette sensibilité élevée est une «arme à double tranchant» car il peut être une source importante pour les données faussement positifs. Tout facteur qui affecte l'indice de réflexion est enregistrée et tracée sur l'sensogramme. En tant que tel, apcontrôles propriées doivent être utilisés pour éliminer les faux positifs, et le soutien des approches complémentaires est fortement conseillé.

La figure 1 illustre la progression d'une expérience SPR utilisant une puce de capteur revêtue de NTA. Le Sensogramme dans le panneau A montre l'injection des ions nickel sur la matrice NTA (données non soustraites), et des panneaux BD afficher les données après la soustraction du signal dérivé à partir de la cellule témoin négatif. Flèches rouges et bleus montrent début d'injection et à la fin, respectivement. Immobilisation du ligand sur la puce modifie progressivement la masse jusqu'à ce que l'injection est terminée. Le plateau stable observée après la fin de l'injection de ligand reflète l'association stable du ligand à la surface (figure 1B, le cycle 2). Une fois une ligne de base stable soit atteint, un tampon est injecté sur le ligand et la cellule de référence (figure 1B, cycle 3) .Cet injection sert de «contrôle à blanc", et serasoustrait lors de l'analyse. Lors de l'injection, des changements mineurs sont enregistrés, ce qui reflète un flux de masse à travers la puce. Ensuite, dans un cycle séparé (figure 1B, le cycle 4), l'analyte est injectée; l'augmentation progressive de RU représente l'association de l'analyte au ligand. Les sites de liaison deviennent progressivement occupées jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint. Dès que se termine l'injection, une diminution de EF reflète la dissociation du complexe. De tels sensograms constantes de vitesse pré-équilibre et d'équilibre peuvent être dérivées (voir plus loin). La figure 1 représente une interaction transitoire entre le ligand et l'analyte. Lorsque l'interaction est plus stable, la baisse du niveau RU est plus lent, reflétant une plus faible k _d.

Nous décrivons ici une expérience SPR visant à caractériser l'interaction entre un transporteur membranaire (détergent solubilisé) et son partenaire fonctionnelle, son substrat apparenté protéines ^6,7 contraignant. Le mod choisiel est un système ATP binding cassette (ABC) transporteur, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Ce système a été choisi pour ses résultats hautement reproductibles, haute rapport signal sur bruit, et classique "on / off" taux. En outre, les transporteurs ABC homologues sont disponibles pour servir de témoins négatifs importants. Le transporteur, ModBC (ligand A) est extrait de la membrane avec un détergent, purifiée et immobilisée sur la puce. Son partenaire d'interaction soluble, moda, est l'analyte. Comme un ligand témoin négatif, un transporteur ABC différente RbsBC est utilisé ("ligand B").

Protocole

1. protéine échantillon et le tampon Préparation

1. Préparation de l'échantillon: purifier les protéines d'intérêt et se assurer que tous les agrégats sont éliminés, par injection de la protéine avant l'expérience sur une colonne de filtration sur gel ou par ultracentrifugation (habituellement 10 minutes à 100 000 xg est suffisante).
   NOTE: Bien que souhaitables préparations de protéines, très pures ne sont pas un must. SPR a été utilisé avec succès par purifications moins-que-parfait et même avec ^8,9 extrait total.
2. Buffer préparation:
   1. Préparer le tampon de l'expérience (appelé "tampon en cours", ou RB). Pour le protocole décrit ici, en utilisant du Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM et 0,05% (p / v) DDM (β-D-maltoside de n-dodécyle). Gardez à l'esprit que le choix de la composition du tampon peut être facilement modifiée en fonction du système étudié.
   2. Filtrer tous les tampons et les échantillons de protéines en utilisant des filtres de 0,22 um. Assurez-vous à l'avance que les filtres sont protéinocompatible. En général, les plates-formes SPR récemment commercialisés contiennent un de-Gasser en ligne; si ce ne est pas le cas, de gaz les tampons avant de l'utiliser.
   3. Dialyser nuit ou diluer les échantillons contre le RB à éviter les décalages de tampons. Dialyse (ou toute autre méthode d'échange de tampon) est particulièrement recommandé lors de l'utilisation de produits chimiques de haute viscosité (par exemple, le saccharose, le glycérol, le DMSO). Avant de raccorder la bouteille de RB à l'entrée de la pompe garder de côté 10 ml de la RB dans un tube séparé.
3. Diluer le ligand mère concentrée dans RB à une concentration finale de ~ 20 pg / ml. En règle générale, pour l'immobilisation stable ligand, utiliser de faibles concentrations de ligands avec plus injections à faible débit, par opposition à des concentrations élevées, haut débit et des injections plus courtes.
4. Diluer l'analyte dans le RB à la concentration désirée. Typiquement, tester la gamme de concentrations pour un système d'affinité inconnue de 10 pM à 10 nM dans des dilutions de dix fois. Toujours commenceravec les concentrations plus faibles en premier.

2. Sensor Chip

1. sélection de puce: Utilisez un acide nitrilotriacétique (NTA) couplé à puce adaptée pour capturer des protéines avec une étiquette de oligo-histidine.
2. l'utilisation de la puce:
   1. Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, prendre la puce à partir de la gaine, rincer doucement avec de l'eau bidistillée (DDW), sécher soigneusement liquides restants utilisant essuie délicates, et assurez-vous de ne pas toucher la surface de la couche d'or. Placez la puce dans son fourreau dans le bon sens (l'insertion est lisse lorsque la puce est correctement placé).
   2. Lors de la réutilisation d'une puce, prendre la puce stockées dans la mémoire tampon, rincer abondamment à l'DDW et sécher délicatement comme indiqué ci-dessus, et la placer dans son fourreau d'origine.
      NOTE: L'accumulation de matériaux de récupération non spécifique sur la puce peut affecter sa «viabilité». Ceci peut être contrôlé en comparant les EF avant et après l'immobilisation du ligand de décapage. Bien que de nombreuses mesures peuvent êtrefait en utilisant la même puce NiNTA, la question de sa longévité ne est pas une «claire» et varie considérablement entre les différentes puces.
3. Chip accueil: Ouvrez la porte de la puce de capteur et placer la puce dans son fourreau. Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, le numéro de série de la puce entrée de garder une trace d'utilisation. Fermez la porte et appuyez sur «puce de quai».

3. Réglages de température

1. Régler la température de cellule de la puce à 25 ° C (ou la température de l'expérience de préférence).
2. Facultatif: régler le compartiment échantillons à 7 ° C pour garder les protéines stable tout au long de l'expérience.

4. Solutions pour le chargement et à dénuder

Préparer les solutions suivantes de chargement et de stripage: mM NiCl 0,5 ₂ dans RB mM, EDTA 350 RB (ajouter un détergent à la solution d'EDTA à une concentration finale en RB), 0,25% de SDS à H ₂ O et HCl 100 mM dans H ₂ O. Lors de l'utilisation de micro-centrifugeuse baignoirees et non SPR tubes désignés, ne oubliez pas de couper les bouchons des tubes.

5. Premier l'instrument SPR avec RB

6. Commencer un nouveau Run

1. Réglez le débit qui sera utilisé pendant l'expérience. Pour obtenir les résultats décrits ici régler le débit à 50 pl / min.
   NOTE: Ce paramètre peut être modifiée au cours de l'expérience.
2. Définir les chemins d'écoulement et la soustraction de référence. Pour obtenir les résultats décrits ici définir les chemins Fc et Fc = 1 = 2, la soustraction Fc = 2-1.
   NOTE: Le programme affiche en temps réel la soustraction de deux cellules mesurées. Gardez à l'esprit que ce paramètre ne peut être modifiée pendant l'expérience.
3. Sélectionner le rack d'échantillons approprié (qui peut influer sur la consommation de volume de l'échantillon).
4. Enregistrez le fichier de résultats.

7. Expérience Cycles

Chaque expérience est composé de cycles, garder une trace claire des injections faites dans eacycle de ch, et séparer loading les ligands, injection vierge de la mémoire tampon, et l'injection d'analyte dans différents cycles.

1. Cycle 1: préparation de Chip et le nickel chargement
   1. Assurez-vous que le flux et les chemins sont fixés selon l'étape 6.1 et 6.2.
   2. Injecter 350 mM d'EDTA pendant 1 min à lavent restes.
   3. Régler le débit à 10 pl / min.
   4. Injecter 0,5 mM NiCl ₂ pendant 2 min.
      NOTE: Maintenant la résine à puce est recouverte par des ions de nickel.
2. Cycle 2: l'immobilisation des ligands
   1. Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 2.
   2. Injecter ligand A jusqu'à atteindre des valeurs RU qui sont de 10 à 20 fois de son poids moléculaire. Par exemple, charger un ligand de 50 kDa à 500-1000 EF. Gardez une trace de la valeur RU atteint.
   3. Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1.
   4. Injecter ligand B (contrôle) jusqu'à la même valeur que celle de RU ligand A. surveiller les sensogramme de soustraction (Fc = 2-1) en ligne pour aider à contrôler lalongueur d'injection.
   5. Réglez le débit à 50 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1 et Fc = 2, laver le système de 5-20 min jusqu'à ce que la ligne de base (Fc = 2-1) se stabilise.
3. Cycle 3: injection Blank. Cette injection servira pour la soustraction vide, donc inclure tous les composants qui seront injectés avec l'analyte, sauf l'analyte lui-même.
   REMARQUE: longueur d'injection peut varier en fonction du temps nécessaire pour atteindre l'équilibre (signal de plateaux).
   1. Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1 et Fc = 2, Fc = 2-1 soustraction.
   2. Insérez la commande «wait» (appelée ci-après «wait ') pendant 30 secondes (pour avoir une ligne de base stable).
   3. Injecter 15 sec RB.
      REMARQUE: La durée de l'injection varie entre les différents systèmes, en fonction de leurs constantes cinétiques pré-équilibre (principalement le k _A).
   4. Attendez 120-600 sec pour enregistrer la phase de dissociation.
      NOTE: La longueur de cette étape varie selon le k _d: Le ralentissement de la dissociation plus long cette étape doit être. Pour les complexes dissociants très lentes (k _d <10 ^-4 s ^-1), attendez 10 à 15 min, puis procéder à la régénération de surface (voir plus loin).
4. Cycle 4: injection Analyte
   1. Copiez / collez les conditions exactes utilisées dans le injection de référence (cycle 3) de sorte que ces deux injections peuvent être soustraites tard. Modifier l'emplacement de la fente dans le rack par celui qui détient la solution de contrôle à celui qui détient la solution d'analyte. Choisissez une concentration qui est légèrement supérieur à la K attendue _D. Si aucune connaissance préalable ne est disponible, choisissez une uM comme un bon point de départ.
5. Cycle 5: injection Buffer
   1. Répétez le cycle 3.
6. Cycle 6: injection Analyte
   1. Répétez le cycle 4.
7. Cycle 7: Chip dépouiller
   1. Régler le débit à 50 pl / min.
   2. Injecter 350 mM d'EDTA pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce.
   3. Injecter 0,25% de SDS pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce.
   4. Si le niveau de base ne est pas atteint, injecter HCl 100 mM pendant 1 min comme étape d'extraction supplémentaire.
   5. Insérez la commande 'de fin de course »qui passe en mode veille.
8. stockage à puce
   1. Détacher la puce du capteur et de le sortir de l'instrument.
   2. Prenez le capteur hors de son fourreau, évitez de toucher la surface, rincer à DDW, et le placer dans un tube de 50 ml contenant RB. Conserver à 4 ° C.

8. Analyse des données en utilisant le logiciel désigné évaluation

1. Effectuez les étapes suivantes pour traiter les données brutes obtenues par SPR avant calcul des paramètres cinétiques.
   1. Utilisation du logiciel d'évaluation, ouvertle fichier de résultats, sélectionnez cycles 3-6 Fc = 2-1 (référence soustrait des données).
   2. Axe changement:
      1. Afficher cycles 3-6.
      2. Zéro, la valeur de l'axe Y de la ligne de base (initial des temps d'attente de 30 secondes dans chaque cycle) à l'ensemble des quatre courbes.
   3. Aligner l'axe des x de quatre courbes. Choisissez caractéristiques prononcées (par exemple, les pics de début d'injection ou d'arrivée) d'aligner parfaitement les quatre courbes le long de l'axe-X. Réglez l'heure du début de l'analyte (tampon ou de contrôle) à zéro.
2. Référence soustraction
   1. Soustraire la réponse de fond en soustrayant la courbe du cycle 3 de la courbe du cycle de 4 et la courbe de cycle de 5 de la courbe du cycle de 6. Utilisez l'opération de soustraction courbe qui peut être trouvé dans l'axe Y se déplace menu.
      NOTE: Il est important d'effectuer cette étape qu'il annule tous les composants non spécifiques (sans rapport avec l'analyte) qui ont pu influencer l'indice de réfraction de surface.
      1. Enregistrer les courbes soustraits à til Fiche de projet sous un nom différent.
   2. Reportez-vous à ces courbes que "courbes doublement soustraite»: la première soustraction est la soustraction 2-1 effectuée sur deux injections, et la seconde est la soustraction d'une courbe d'un autre.
      NOTE: Cette double-référencement est l'étalon-or dans les expériences SPR.
   3. Superposer les courbes soustraits en effectuant axe changement comme expliqué précédemment.
3. Détermination de la cinétique constantes et ajustement du modèle
   1. Mener une expérience cinétique
      1. Injecter une série de 6-7 concentrations d'analyte d'avoir un système fiable de données pour la détermination constantes cinétiques. Choisissez concentrations analyte de 10 fois supérieure à 10 fois inférieure au montant estimatif K _D, dans des dilutions 2-3-fold. Inclure la concentration "zéro", utilisé plus tard pour le double soustraction de référence (voir ci-dessus). Mener injections en triple et dans un ordre aléatoire.
      2. Aligneret soustraire toutes les courbes par rapport à l'axe Y et l'axe X avant de l'ajustement du modèle.
   2. Ajustement du modèle
      1. Sélectionnez un programme d'analyse approprié.
         REMARQUE: La plupart des programmes ajustés disponibles offrent plusieurs modèles qui peuvent être appliquées pour le montage et la détermination des constantes cinétiques.
      2. Appliquer le modèle le plus simple (Langmuir) en supposant une réversible 1: une interaction entre l'analyte et le ligand pour le montage. Sauf convaincre les données sont disponibles à partir d'autres méthodes expérimentales pour l'existence d'une interaction plus complexe, toujours utiliser le modèle de Langmuir simple.

Résultats

Dans le système décrit ici, une puce NiNTA est utilisée pour immobiliser le transporteur membranaire marquée par His ^6,7. Être un homo-dimère, chaque transporteur est doublement marqué, l'amélioration de sa liaison à la puce NiNTA. Après le chargement de nickel, ligand A (le transporteur d'intérêt) est immobilisé sur Fc = 2, jusqu'à ~ 3500 RU (cycle de protocole 2, Figure 2A label noir). Puis, en utilisant le même débit et la durée d'injection, le ligand B (le...

Discussion

SPR est une méthode très sensible pour étudier les interactions moléculaires, et est souvent la seule approche qui permet la surveillance en temps réel des interactions transitoires (mais importantes). Un exemple est l'interaction transitoire présentée ici, qui ne pouvait pas être détecté par toute autre méthode (dosages déroulants, liposomes sédimentation essais ^6). De plus, tandis que d'autres procédés sont limités à l'équilibre des mesures (que ce soit quantitative ou qualitat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab