膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

要約

表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。

要約

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

概要

タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）タンパク質複合体の形成および解離は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な事象（ 例えば 、複製、転写、翻訳、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション）である。 PPIの半定量的研究は、多くの場合、プルダウンまたは免疫沈降実験を用いて行われる。しかしながら、これらの（および類似の）技術により、このような技術に固有の洗浄工程に（低マイクロモルより高い親和性）を測定することができる親和性の範囲が限られている。このような「エンドポイント」技術は、多くの場合、大きな生物学的結果のある一過性または低親和性相互作用を同定することはできない。さらに、このようなアプローチの時間分解能は、反応の速度より通常数桁遅い極めて限られている。 SPRは、その高まり感度と優れた時間分解能^1,2に、これらの欠点を克服する。 SPRは、ラベルフリーの方法であり、等（質量変化を検出することができる限り、）分子相互作用を測定することができる。 PPIに加えて、広範囲のタンパク質-リガンド、タンパク質-薬物（または小分子）、タンパク質、DNA、およびタンパク質-RNA相互作用^3-5を特徴付けるために使用されている。結果は、実験条件と柔軟な実験設計の迅速な変更を可能にする、リアルタイムで記録し、プロットした。

SPRベースの計測器の背後にある物理的原理は^、2を変更質量にセンサ表面に屈折率の変化を測定する光学系の利用である。相互作用パートナー（以下、リガンド）の一つは、ポリマーマトリックスチップと第二の分子（以下、分析物）の表面上に流している上に固定されている。リガンドに結合する分析物は、チップ表面上の質量を変化させる。この質量変化は、直接的に比例して表面の屈折率の変化に関連している。結果をリアルタイムでプロットし、時間の関数として応答単位（RU）として提示する。このようなプロットは、センサーグラムと呼ばれる（ 例えば 、 図1）。 SPRは、相互作用の完全な時間経過をたどるので、予め平衡反応速度定数は親和性を平衡に加えて、導出される。以下に詳述されるように、与えられたシステムのプレ平衡挙動は、多くの情報を保持しており、単独の均衡よりも非常に異なる視点を提供します。システムが校正されると、実験は非常に高速であり、タンパク質材料（金額ナノグラムするマイクログラム）を少量しか必要とします。与えられたシステムの完全な運動情報を収集する日で達成することができる。 SPRの高感度は、他の技法^6を使用して可能でない測定値が得られる。しかし、この高感度は、偽陽性のデータのための主要な源とすることができるので、「両刃の剣」である。反射率に影響を与える要因を記録し、センサーグラム上にプロットされている。そのような、APとしてpropriateコントロールは、偽陽性を排除するために使用されなければならない、と補完的なアプローチからの支援を強くお勧めします。

図1は NTAでコーティングされたセンサーチップを用いたSPR実験の進行を示している。パネルAのセンソグラムはNTAマトリックス（非サブトラクションデータ）上のニッケルイオンの注入を示し、パネルはBDは、陰性対照細胞由来の信号を減​​算した後にデータを表示する。赤と青の矢印は、注入の開始と終了を示す。注入が終了するまで、チップ上へのリガンドの固定化は徐々に質量を変化させる。リガンドの噴射の終了後に観察され、安定した高原は、表面へのリガンド（ 図1B、サイクル2）の安定な会合を反映している。安定なベースラインが達成されると、バッファは、リガンド上に注入し、基準セル（ 図1B、サイクル3）。この注射は、「ブランクコントロール」として機能しているであろう分析中に差し引か。注射の際、多少の変更は、チップを通して質量の流れを反映して、記録されている。その後、独立したサイクル（ 図1B、サイクル4）で、分析物を注入されます。 RUの緩やかな増加は、リガンドへの検体の関連を表します。平衡に達するまで、結合部位は、徐々に占有になる。とすぐに注入が終了すると、RUはの低下が複雑なの解離を反映している。予備平衡平衡速度定数を導出することができるようなセンサーグラムから（後述）。 図1は、リガンドとアナライトとの間の過渡的な相互作用を示している。相互作用がより安定しているとき、RUレベルの減少はより低いk _dを反映遅い。

ここで、我々は、その同族基質タンパク質^6,7結合膜輸送（洗剤が可溶化）とその機能的パートナーとの相互作用を特徴づけることを目的としSPR実験について説明します。選ばれたMODエル·システムは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、ArcheaglobusのフルギダスのModBC-Aである。このシステムは、信号対雑音比、および古典的な「オン/オフ」速度にその再現性の高い結果が、高信号のために選択した。さらに、同族体ABCトランスポーターが重要な負の対照として役立つために利用可能である。トランスポーター、ModBC（配位子A）がチップ上に精製し、固定化され、界面活性剤を用いて膜から抽出される。その可溶性相互作用パートナー、MODAは、分析対象である。陰性対照リガンドとして、別のABCトランスポーターRbsBCは（「リガンドB」）が使用されている。

プロトコル

1.タンパク質サンプルおよびバッファの準備

1. サンプル調製：目的のタンパク質を精製し、ゲルろ過カラムにまたは超遠心分離により、実験前にタンパク質を注入することにより、すべての集計が削除されていることを確認し（100,000 XGが十分で通常10分で）。
   注：望ましいが、高純度のタンパク質調製物は必須ではありません。 SPRが正常より少なくより完璧な精製であっても全抽出物の^8,9で使用されてきた。
2. バッファーの調製：
   1. （「バッファを実行している」と呼ばれる、またはRB）実験のバッファを準備します。プロトコルは、ここで説明のために、50mMのトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaClおよび0.05％（w / v）のDDM（n-ドデシルβ-D-マルトシド）を使用する。緩衝液組成の選択が容易に研究し、システムに応じて変更することができることに留意してください。
   2. 0.22μmのフィルターを使用してすべてのバッファとタンパク質サンプルをフィルタリングします。フィルタは、タンパク質であることを事前に確認してください互換性。一般に、最近市販SPRプラットフォームは、インライン脱ガッサーを含む。そうでない場合には、脱ガスバッファ使用前。
   3. 一晩透析またはバッファの不一致を回避するために、RBに対してサンプルを希釈。高粘度（ 例えば 、スクロース、グリセロール、DMSO）の化学物質を使用した場合、透析（または緩衝液交換の他の方法）が特に推奨される。ポンプ入口にRBボトルを接続する前に別のチューブに置いRBの10ミリリットルを保つ。
3. 〜を20μg/ mlの最終濃度になるようにRBに濃縮リガンドストックを希釈する。経験則として、安定したリガンド固定化のために、高濃度の、高流量と短​​い注射とは対照的に、低流量でより長い注射で低リガンド濃度を使用しています。
4. 所望の濃度にRBに検体を希釈する。一般的に、10倍希釈で10 nMの10μMから未知の親和性のシステムのための濃度の範囲をテストします。常に開始最初のより低い濃度で。

2.センサーチップ

1. チップ選択：三酢酸（NTA）、オリゴヒ​​スチジンタグを有するタンパク質を捕捉するのに適した結合されたチップを使用してください。
2. チップの使用状況：
   1. 新しいチップを使用する場合は、シースからチップを取り出して再蒸留水（DDW）で軽くすすいで、繊細なワイパーを使って慎重に残りの液体を乾燥し、金層の表面に触れないように注意してください。 （チップが適切に配置されたときに挿入がスムーズです）正しい方向に戻す鞘にチップを置きます。
   2. チップを再利用する場合、バッファから格納されたチップを取り出し、上記のように優しくDDWとドライで十分に洗い流し、そして、元の鞘に入れる。
      注：チップ上の非特異的なジャンク材料の蓄積は、その「可能性」を影響を与えることができます。これは、リガンド固定ポストストリッピングする前のRUを比較することによってモニターすることができる。多くの測定が可能ですが同じのNiNTAチップを使用して行わ、その長寿の問題は、「明確な」ものではなく、異なるチップ間で大きく異なる。
3. チップドッキング：センサチップのドアを開いて、その鞘にチップを置く。新しいチップを使用する場合は、入力チップのシリアル番号が使用記録を維持する。ドアを押して「ドックチップ」を閉じます。

3.温度設定

1. 25°C（または好適な実験温度）チップ電池温度を設定する。
2. オプション：実験を通して安定した蛋白質を保つために7℃までのサンプルコンパートメントを設定します。

ロードとストリップ4.ソリューション

H ₂ O中RB（RBのように最終濃度にEDTA溶液に洗剤を追加）でRBさ0.5mmのNiCl _2、350 mMのEDTA、0.25％SDS、及びHで100 mMの塩酸：ロードおよびストリッピングのために、以下のソリューションを準備₂ O.マイクロ遠心機用浴槽を使用している場合ESとしない指定されたチューブをSPR、チューブのキャップを遮断することを忘れないでください。

5. RBと首相SPR計測器

6.新しいファイル名を指定して実行を開始します

1. 実験中に使用される流量を設定する。ここに記載された結果を得るために50μL/分への流れを設定する。
   注：このパラメータは、実験中に変更することができます。
2. 流路及び基準減算を定義します。ここに記載された結果を得るためにFcが= 1およびFc = 2、減算のFc = 2-1のパスを設定する。
   注：このプログラムは、リアルタイムで測定された2つのセルの減算が表示されます。このパラメータは実験中に変更できないことに注意してください。
3. 適切な検体ラックを選択し（これは試料容量の消費に影響を与えることができる）。
4. 結果ファイルを保存します。

7.実験サイクル

各実験は、EAで行わ注射の明確な記録を保持し、サイクルで構成されているCHサイクル、およびリガンド」のローディング、バッファのブランク注入、および異なるサイクルへの分析物の注入を分離する。

1. サイクル1：チップの準備とニッケルのロード
   1. フローとパスがステップ6.1および6.2に応じて設定されていることを確認。
   2. 残り物を洗い流すために1分間350 mMのEDTAを注入。
   3. 10μL/ minに設定の流れ。
   4. 2分間0.5 mMののNiCl _2を注入。
      注：ここでチップ樹脂ニッケルイオンによってコーティングされている。
2. サイクル2：固定化リガンド
   1. 15μL/分、流路のFc = 2に設定の流れ。
   2. その分子量の10〜20倍であるRU値に到達するまで配位子Aを注入。例えば、500〜1,000のRUに50kDaの体のリガンドをロードします。達成RU値の記録を保管してください。
   3. 15μlの/分、流路のFc = 1に設定流量。
   4. 制御しやすくするためにオンライン減算センソグラム（FC = 2-1）を監視するリガンドAのと同じRU値までリガンドB（コントロール）を注入注射の長さ。
   5. を50μl/分で、流路のFc = 1およびFc = 2に設定されたフローは、ベースラインになるまで5〜20分間システムを洗浄（のFc = 2-1）が安定する。
3. サイクル3：ブランク注入。この注入は、分析物自体を除いて、検体と注入されるすべてのコンポーネントが含まれ、したがって、空白の減算に役立つ。
   注：注入長さは、平衡（シグナルプラトー）に到達するのに要する時間に応じて変えることができる。
   1. 15μlの/分、流路のFc = 1およびFc = 2は、Fc = 2-1減算に設定流量。
   2. 30秒間（「待つ」と以後呼ぶ）「待つ」コマンドを挿入します（安定したベースラインを持っている）。
   3. 15秒RBを注入。
      注：注射の継続時間は、それらの前平衡反応速度定数（主にk個の_A）に応じて、異なるシステム間で異なります。
   4. 解離相を記録するために120から600秒待ってください。
      注：このステップの長さは、に応じて変化する K _D：長い解離遅いこのステップでは、する必要がある。非常に遅い解離性複合体（K _dは <10 ^-4秒^-1）の場合は、10〜15分待ってから（後述）の再生を表面に進みます。
4. サイクル4：検体注入
   1. コピー/基準噴射（サイクル3）で使用される正確な条件ので、これら2回の注射を後で減算することができる貼り付けます。検体溶液を保持しているものに制御ソリューションを保持して1からラック内のスロットの場所を変更します。少し期待されるK _Dの上にある濃度を選択してください。事前の知識が使用できない場合は、出発点として1μMを選択する。
5. サイクル5：バッファインジェクション
   1. 繰り返しサイクル3。
6. サイクル6：検体注入
   1. 繰り返しサイクル4。
7. サイクル7：チップは取り除く
   1. 50μL/ minに設定の流れ。
   2. 1分間350 mMのEDTAを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。
   3. 1分間の0.25％SDSを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。
   4. ベースラインレベルに達していない場合は、追加のストリッピング工程として1分間の100mMのHClを注入する。
   5. スタンバイモードに切り替わり '末端の実行」コマンドを挿入します。
8. チップ収納
   1. センサチップのドッキングを解除すると、機器の外にそれを取る。
   2. DDWで洗い流し、表面に触れないように、その鞘からセンサーを取り出し、とRBを含む50 mlチューブ内の場所。 4℃で保存。

指定評価版ソフトウェアを使用して、8データ分析

1. 動力学的パラメータの導出前にSPRによって得られた生データを処理するために、次の手順を実行します。
   1. 評価ソフトウェアを使用して、オープン結果ファイルを選択しサイクル3-6のFc = 2-1（参照は、データを減算）。
   2. 軸シフト：
      1. 表示サイクル3-6。
      2. ゼロすべての4つの曲線のベースライン（各サイクルの最初の30秒の待ち時間）のY軸値。
   3. 4つの曲線のX軸の位置を合わせます。顕著な特徴を選択してください（ 例えば 、噴射開始または仕上げのスパイクは）完全にX軸に沿って4つの曲線を整列させる。ゼロに分析物（または対照緩衝液）の開始時刻を設定します。
2. 参考減算
   1. サイクル4サイクル6. Y軸のシフトメニューで見つけることができカーブ減算操作の曲線からサイクル5のカーブの曲線からサイクル3の曲線を減算することによってバックグラウンド応答を引く。
      注：それは、表面の屈折率に影響を与えた可能性（分析物に関係のない）非特異的要素をannulsとして、この手順を実行することが重要です。
      1. トンで減算曲線を保存彼は別の名前の下に、プロジェクトのシート。
   2. 「二重に差し引か曲線」として、これらの曲線を参照してください。第1の減算は両方の注射で行わ2-1引き算であり、第二は、別の1の曲線の引き算である。
      注：このような二重参照は、SPR実験でのゴールドスタンダードです。
   3. 前に説明したように軸シフトを行うことにより、減算、曲線オーバーレイ。
3. 動力学定数の決定とモデルフィッティング
   1. 速度実験を実施
      1. 反応速度定数の決定のためのデータの信頼性を持っている6-7の検体濃度の一連の注入。 2-3倍希釈で、推定K _Dの下に10倍に上記の10倍から分析物の濃度を選択してください。 （上記参照）、後に二重の基準減算に使用される「ゼロ」濃度を、含める。三重でランダムな順序で注射を実施する。
      2. 整列するモデルフィッティングを試みる前に、Y軸、X軸に対してすべての曲線を減算する。
   2. モデルフィッティング
      1. 適切な解析プログラムを選択します。
         注：ほとんどの利用可能なフィッティングのプログラムは、フィッティングと反応速度定数の決定のためにも適用することができるいくつかのモデルを提供します。
      2. 分析対象とフィッティングのためのリガンドとの間の1相互作用：リバーシブル1を想定した最も単純なモデル（ラングミュア）を適用します。説得力のあるデータをより複雑な相互作用の存在を他の実験方法から利用可能である場合を除き、常に単純なラングミュアモデルを使用します。

結果

本明細書に記載のシステムにおいて、のNiNTAチップは、Hisタグ、膜輸送体^6,7を固定するために使用される。ホモ二量体であること、各トランスポーターは、二重のはのNiNTAチップへの結合を改善し、タグ付けされている。ニッケルロード以下、リガンドA（関心のトランスポーター）〜3500 RU（プロトコルサイクル2、 図2A黒ラベル）までは、Fc = 2上に固定されている。その?...

ディスカッション

SPRは、分子相互作用を研究するための高感度な方法であり、多くの場合、一過性の（まだ重要な）相互作用のリアルタイム監視を提供する唯一のアプローチである。例は、他の方法（プルダウンアッセイ、リポソーム沈降アッセイ^6）によって検出することができなかった、本明細書に提示過渡相互作用である。他の方法（定量的または定性的のいずれか）の測定値を平衡に制限され...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab