גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

Summary

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Abstract

תאי גזע אנושי pluripotent מושרה (hiPSCs) יכולים להיות שנוצרו עם מתודולוגיות תכנות מחדש מבוסס lentiviral. עם זאת, עקבות של גנים שעלולים להיות סרטניים שנותרו באזורים משועתקים של הגנום, להגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומים טיפוליים אדם ^1. בנוסף, אנטיגנים שאינם בני אדם נגזרים מתכנות מחדש של תאי גזע או הבידול לנגזרים רלוונטיים טיפולי מונעים hiPSCs אלה מלשמש בהקשר קליני בבני אדם ^2. בסרטון הזה, אנו מציגים הליך לתכנות מחדש וניתוח hiPSCs ללא גורם ללא transgenes אקסוגני. hiPSCs אלה לאחר מכן ניתן לנתח מומי ביטוי גנים באינטרון הספציפי המכיל את lentivirus. ניתוח זה יכול להיעשות באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז רגישה כמותית (PCR), שבו יש יתרון על פני טכניקות רגישות פחות השתמש בעבר כדי לזהות הבדלי ³ ביטוי גנים. המרה מלאה לתרגול בכיתה קלינית טוב ייצור תנאים (GMP), מאפשר רלוונטי קלינית בבני אדם. הפרוטוקול שלנו מציע כי קריטריונים בטוחים נמל נוכחי ירחיבו וכוללים נגזרים מבוססי hiPSC ללא גורם מאופיינים ליישומים לטיפוליים אנושיים הנובע hiPSCs כיתה GMP, שאמורה לחסל את כל סיכון חיסוני בשל אנטיגנים שאינם בני אדם שסופקה על-מתודולוגיה אחרת. פרוטוקול זה הוא רחב החלים על תאי lentiviral לתכנות מחדש של כל סוג ומספק שיטה לשחזור להמרת תאים לתכנות מחדש לתנאי כיתה GMP.

Introduction

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors^4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression⁶. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process⁷. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived⁸. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions.

Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction^3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics⁹. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions¹⁰. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance.

These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics¹¹.

We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions¹⁰. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

Protocol

הערה: שיטה זו שימשה במחקר דיווח נוראים et al ^10..

1. תכנות מחדש אדם הבוגר Dermal Fibroblasts עם STEMCCA

1. fibroblasts עורי מבוגר הפשרה אנושי (HUFs), מעבר 4 או פחות, באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, נזהר שלא להטביע את חלקו העליון של הבקבוקון עם מים.
2. מניחים את תערובת 1 מ"ל של fibroblasts אדם לתוך בקבוקון חרוטי 15 מ"ל ומניח לאט 4 מיליליטר של תקשורת HUF סטנדרטית, טרום חיממה עד 37 ° C, בצורה טיפה חכמה, כדי לדלל את sulfoxide דימתיל (DMSO) ו מחדש להשעות תאים.
3. צנטריפוגה הבקבוקון ב XG 200 במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant מחדש להשעות תאים בנפח מספק של תקשורת ליצור השעיה של 100,000 תאים / מיליליטר ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל ולאחת מצלחת שש היטב, מצופה מראש למשך 20 דקות עם ג'לטין 0.2%.
   הערה: אחות עם מספר שווה של תאים בכל שורה ומצב טוב צריכה להיות נזרעה for ספירת התאים / ריבוי של זיהום חישוב (משרד הפנים).
4. רוק בצד הצלחת לצד וקדימה ואחורה כדי לפזר באופן שווה את התאים. דגירה לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור humidified.
5. ביום של התמרה, להשיג ספירת תאים (שניות) מהאחות היטב כ 24 שעות (ים) לאחר ציפוי HUF ראשוני.
6. להפשיר 2 x 10 ⁸ TU, או תרכיז שווה ערך, lentiviral (STEMCCA) ולדלל עד 1 x 10 ⁸ TU / ml בתקשורת HUF.
7. Transduce תאים ביחס 10-משרד הפנים בתקשורת HUF השלים עם סוכן transfection 8 מיקרוגרם / מיליליטר. מערבבים בארות transduced באופן שווה ודגירת לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור humidified.
8. כ 24 שעות לאחר התמרה lentiviral, לעבור תקשורת HUF לתאי גזע pluripotent אדם בינוני סטנדרטי (PSC).
9. בימים 2 עד 6, לשנות תקשורת יומיומית עם מדיום PSC אנושי.
10. ביום 6, צלחת שתי צלחות 10 סנטימטרים מצופים ג'לטין 0.2% מ1.5 x 1.75 10 ⁶ MEFs שנלקח מעכברי CF1 בתקשורת HUF ^12.
11. ביום 7, נזהרת שלא צנטריפוגות יותר מ -100 XG, טריפסין טמפרטורת חדר שימוש כדי להרים את יום 7 fibroblasts תכנות מחדש מהיטב אחד של הצלחת והמעבר שש היטב ביחס 01:16, על ידי ציפוי את כל התאים באופן שווה בין שתי 10 צלחות סנטימטר, עם תקשורת טרי אנושית PSC, שהיו מצופים עם MEFs היום קודם לכן. להפיץ אגרגטים תא בתנועה ספירלית בכיוון השעון ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ humidified חממת הלילה.
12. כ -48 שעות לאחר זריעת התאים לתכנות מחדש על MEFs ובכל יום לאחר מכן, לשנות את תקשורת PSC אדם בילתה עם תקשורת טרי.
13. לאחר 3 עד 4 שבועות, לבחור מושבות בודדות עם ESC הטיפוסי כמו מורפולוגיה עם מחט 21-מד וsubclone החוצה אל צלחת 24 גם על ידי הצבת כ 8 עד 10 יצירות בודדות של מושבות ספציפיות לתוך בארות בודדות ב0.2% ג'לטין מצופה צלחת 24 גם פרה-סידed עם MEFs שנלקח מעכברי CF1 במדיום PSC אנושי.
    הערה: לאחר הרחבת מושבות הרימו, המושבות צריכה להיות מאופיינות כpluripotent על ידי היווצרות embryoid גוף וניתוח ביטוי של סמני pluripotency ברמת החלבון.

2. וקטור אינטגרציה ניתוח אתר וSTEMCCA כריתה

1. לנתח את אתר האינטגרציה STEMCCA על ידי ההגברה ליניארית שאינה מגבילה PCR כמתואר ^10.
2. לאחר מנסה לאמוד על מנת להבטיח אינטגרציה אחד לאזור רצוי של הגנום, STEMCCA בלו על ידי aspirating את מדיום ESC האנושי הישן. ואז, לשלב 45 μl של וירוס Adeno-Cre-PuroR המרוכז עם 8 מיקרוגרם / סוכן transfection מיליליטר ב 3 מיליליטר של תקשורת PSC סטנדרטית למשך 24 שעות.
3. לאחר תקופת הדגירה 24 שעות, לשאוב את supernatant ויראלי המעורב ולשטוף את התאים פעמיים עם תקשורת PSC אנושית. הנח תקשורת PSC אנושית טרי יחד עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin לתקופה של 5 ימים, לשנות את השנינות היומית התקשורתתקשורת h טרי ואנטיביוטיקה.
4. לאחר 5 ימים, subclone נותר מושבות עם מחט 21-מד על בארות מצופים ג'לטין 0.2%, בצלחת 12 גם מראש מצופה עם MEFs נגזר מCF1mice ולהרחיב כפי שפורט לעיל.
   הערה: לאחר הרחבה מספיק כדי להשיג המניה קפוא, נדרשת המרה לתנאי מזין ללא. מצפה לפחות 95% מות מושבה תאי גזע כמו רוב התאים לא transduced בהצלחה וייכנעו לאנטיביוטיקה בהשוואה לתקופה של 5 ימים של דגירה. למרות Adeno-Cre-PuroR משלב ביעילות% .001-1 לכרומוזומים מארח של תאים נגועים, reexposing מדגם של מושבות ללא גורם לpuromycin כדי להבטיח 100% מוות של תאים יאשרו אינטגרציה, לא התרחשה ^13.
5. להפשיר בקבוקון אחד של מטריצת קרום במרתף מראש aliquoted על קרח, על פני תקופה של כ -2 שעות (המלצות יצרן) עד המטריצה ​​היא נוזל ולדלל את ריכוז סופי של 1:30 בתקשורת בסיסית קרה. Coבמספר רצוי של בארות בצלחת שש היטב עם 1 מיליליטר לכל טוב. בואו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
6. צלב-צוהר (באמצעות מחט 18-מד, או "טיפ" זכוכית או פלסטיק) לפחות 20 עד 30 מושבות וממצופות בעבר עם MEFs. להיות זהיר כדי להפחית MEF מרומם ולהעביר מצלחת.
   1. צור מכשיר הקווקווים באמצעות מספר הגישות שונות, מהחימום המסובך יותר, מושך, וגימור של זכוכית פיפטה פסטר על להבה פתוחה, לשימוש הפשוט של קצה פיפטה פלסטיק סטרילי או, כמו במקרה שלנו, 21- ו / או 18-מד מחטים.
7. לשאוב את המטריצה ​​מהבאר לאחר הדגירה המצופה.
8. הסר פיסות המושבות על ידי גירוד עדין מהצלחת הישנה עם pipettor 200-μl ומניח בזהירות לתוך 3 מיליליטר של תקשורת המשולבת הטרי 1 בצלחת מצופה המטריצה. דגירה הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% ₂ חממה humidified CO. תקשורת שינוי 48 שעות לאחר passaging.
9. לחלץ הדנ"א הגנומי מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא, בלמעלה מ -80% confluency, באמצעות ערכות חילוץ DNA המסחרי.
10. ניתוח לכריתה נכונה עם פריימרים ספציפיים לאינטגרציות אקסוגני של lentivirus STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-קדימה, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-הפוך, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ". מחדש פריימרים lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות של 10 מיקרומטר.
11. הפעל PCR עם פרוטוקול חמשת השלבים הבאים: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 35 מחזורים של כל אחד מאלה: denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, חישול פריימר על 62 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וסיומת על 72 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות; אחרי ארכה אחת מחזור אחרון ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
12. הפוך ג'ל agarose 3% על ידי שקילה מתוך 1.5 גרם של agarose והצבתו לתוך 50 מיליליטר 1x חיץ טריס-אצטט-EDTA. מיקרוגל עד agarose הוא נמס והמקום בכתם ג'ל DNA בעמ 'דילול רופר, לערבב, ולוותר על נפח ראוי לקלטת ג'ל לבסס עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
13. עומס 12 μl של מוצר ה- PCR מעורבב עם 3 μl של צבע טעינה לג'ל agarose 3%. הפעל את ג'ל למשך 30 דקות ב 80 V.
14. דמיין עם אור אולטרה סגול על היעדריו של להקה המציין כריתה נכונה.

3. Quantitation של הבדלי ביטוי גנים על ידי שימוש בכמותי PCR מהקדם וhiPSCs נכרת-ההודעה

1. לחלץ RNA הכולל מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא באמצעות ערכות חילוץ RNA מסחריות.
2. הפוך-לתמלל עד 1 מיקרוגרם של RNA הכולל באמצעות ערכות מסחריות בהתאם להוראות היצרן. השתמש מעוגן-אוליגו (DT) ₁₈ ופריימרים hexamer אקראיים.
   הערה: ודא שפרוטוקול PCR מותאם לתעתיקי גנים של יותר מ או פחות מ -4 קילו. פריימרים ספציפיים יצטרכו להתבצע על i לפי גן STEMCCA המשולב במקורn כדי.
3. מחדש את פריימר lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות 20 מיקרומטר.
4. השתמש 5 ng של מדגם לכל 20 μl של תגובה שמורכבת מבדיקת UPL 10 מיקרומטר, 2x LightCycler 480 בדיקות הורים, ו -20 מיקרומטר קדימה לאחור פריימרים.

4. המרה לתנאי כיתה GMP

1. ביום הראשון של מעבר hiPSCs-נכרת ההודעה על תנאים בכיתה GMP, לעשות תערובת של תקשורת בהיקף של PSC האנושי בשילוב 1 (1 תקשורת משולבת) וכיתה קלינית בפועל ייצור טוב (GMP) תקשורת תואמת תקשורת תקשורת (בשילוב 2 ) בשעה 80:20 יחס.
2. לשאוב את התקשורת המשולבת הישנה 1 ומקום 3 מיליליטר של התקשורת המשולבת החדשה 1 ו- 2, מחומם מראש, ביחס 80:20. שינוי בתקשורת כל יום במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO _2.
3. ביום 4, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. לשאוב את המדיום וreplac הישניםדואר עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO _2.
4. ביום 7, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 20:80. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת מחוממת מראש, עם התקשורת המשולבת 1 ו -2 ביחס 20:80. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO _2.
5. ביום 10, להפוך את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. שינוי בתקשורת בכל יום ביחס הספציפי הזה. תאים נמצאים כעת בללא מדיה קסנו מוגדרת לחלוטין. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO _2.
   הערה: במהלך תהליך גיור כל זה, יש צורך בpassaging השגרתי עם מחט 18-מד לשמור גודל מושבה ראוי וצפיפות. תכנית על passaging תאים כל 4 עד 5 ימים על בסיס גודל מושבה, confluency, ובידול.
6. אחד מעיל גם בצלחת שש היטב עם מצע ללא קסנו מוגדר כמומלץ על ידי היצרן.
7. מעבר מכאני ומחוברות גם, שכבר הוסבו לחופשי קסנו-תנאי תקשורת, מצלחת שש היטב עם מחט 18-מד. חשוב לציין, למקם את המדיה חדשה (מדיה משולבת 2) בתאים עם מעכבי ROCK 1x עבור שעה 1, לפני passaging מראש מצב התקשורת.
8. לשאוב את פתרון המצע הסינתטי מהצלחת החדשה כי התאים מועברים ל. הסר את כל המדיה המכילה את גושי תאי גזע מהצלחת הישנה ולהעביר לצלחת חדשה.
9. תאי מקום בחזרה ל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור במשך 2 ימים עם הפרעה פיזית מינימאלית (באופן אידיאלי צלחות, פעם אחת בתוך חממה, לא נגעו ישירות בכל דרך) כדי לאפשר מרבי של קובץ מצורף.
   הערה: תאים ידרשו שינויים בתקשורת מדי יום. passagin המתמשךg כל 4 ימים יהיו חשובים. באמצעות מחט 21-מד, מעבר רק חלקים ממושבות עם מורפולוגיה אופטימלית כמו ESC (יחס nucleocytoplasmic גבוה). פעולה זו תבטיח את הבחירה למושבות hiPSC ראויות שתגדלנה היטב וסופו של דבר להניב מושבות הומוגנית. זמן הכולל לגזירה של ESC כמו מושבות הוא בין 15-20 ימים לאחר שינוי התקשורת המשולב הראשוני.
10. להקפיא את hiPSCs-נכרת לאחר כיתה GMP על ידי הפתח-צלב הראשון כל המושבות באמצעות מחט 18-מד. הרם את כל החתיכות באמצעות pipettor μl 200 ולהעביר את כל התקשורת המכילה את התאים לבקבוקון חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בעוד התאים צנטריפוגה, להפוך את תקשורת הקפאה מורכבת מכמויות שווה של תקשורת המשולבת הקרה 2 והקפאה בינונית עם ריכוז DMSO סופי של 7.5%.
12. לאחר תאי pelleted, לשאוב את המדיום ישן וירידה מבחינת מחדש להשעות את גלולה עם תקשורת ההקפאה. מייד transfer לבקבוקוני הקפאה ולהכניס למקפיא -80 מעלות צלזיוס.

5. hiPSCs נכרת-ההודעה אפיון כיתה GMP

1. כדי להבטיח ביטוי הולם של סמני pluripotency לאחר המרה, להשתמש QPCR לכמת ביטוי של סמני pluripotency מפתח (Sox2, Oct4, וNANOG) על ידי שימוש בצבעי היסוד המפורט בטבלה 1 עם אותם השלבים כאמור בשלב 3. מתודולוגיות QPCR המעקב אותם צעדים כפי שמופיע בשלב 3.
2. שימוש cytometry זרימה לזהות את החומצה שאינה בני האדם sialic Neu5Gc (חומצת -glycolylneuraminic N) בהתאם לתנאים סטנדרטיים המופיעים בערכה, כפי שפורסם בעבר ^10.
3. לשטוף בעדינות את צלחות תרבית תאים עם תאים באמצעות מלוח 1x פוספט שנאגרו (PBS).
4. לנתק את המושבות באמצעות מגיב ניתוק 1x במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
5. במהלך זמן הדגירה של 5 דק 'של שלב 5.4, להכין את פתרון החסימה (הניתן בערכה) על ידי ביצוע 0.5% חסימת הסוכן בPBS קר כקרח.
6. תווית הסט של צינורות לניתוח cytometry הזרימה הבא: בלא הכתם; 4 '6-Diamidino-2-phenylindole DAPI, (DAPI); שליטת נוגדן 1: 200; נוגדן ראשוני 1: 200; נוגדנים משני 1: 200 החמור נגד העוף IgG (H + L); MEFs מדגם; תאים-נכרת לאחר מדגם על מטריצה; ו- נכרתה הודעה לדוגמא תאים על מצע סינטטי.
7. בעדינות לעקור אגרגטים תא מצעד 5.4 על ידי הוספת 2 מיליליטר של חסימת תכני פתרון ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 80 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. שוטף את התאים פעמיים עם פתרון חסימה ו צנטריפוגות כאמור בשלב 5.7.
9. בעדינות מחדש להשעות כ 1 x 10 ⁶ תאים בחסימת פתרון עם מקביל דילול הנפח של כל נוגדן 100 μl. דגירה עם הנדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
10. חזור על שטיפות שלוש פעמים כמו בשלב 5.8.
11. להשעות מחדש את התא גלולה ב400 μl של diluent לBuffer (מערכה) עם 1: 100 של DAPI לצינורות 2, 6, 7, ו -8 כפי שמופיע מתחת לשלב 5.6.
12. תאי מתח דרך מסננת 40 מיקרומטר ולהפעיל באמצעות cytometer זרימה.

תוצאות

אנו מציגים פרוטוקול להפקת hiPSCs ללא גורם כיתה קלינית על ידי שימוש בגישת תכנות מחדש מבוססת lentiviral STEMCCA. איור 1 א מציג תמונה מייצגת של שלושה קווים שונים hiPSC-נכרת מראש, לאחר תכנות מחדש עם גישת STEMCCA על שכבת MEFs. היתרון העיקרי של גישת תכנות מחדש STEMCCA טמון בהצלחת תכנות מחד...

Discussion

אנו מתארים שיטה של ​​הפקת hiPSCs ללא גורם והופך אותם מבחינה קלינית רלוונטי על ידי המרת תאים אלה לתנאי כיתה GMP להתמיינות תאים במורד הזרם בתרופות אנושיות בעתיד. למרות שפרוטוקול זה הוא החלים רחב למגוון של סוגי תאים, בחרנו לתכנת מחדש fibroblasts עורי האנושי, בשל הקלות של חילוץ מה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5%	Invitrogen	15400-054	Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Basel, Switzerland)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium	Lonza (Basel, Switzerland)	12-769E
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatin, from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/transfection agent	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-well plates	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-well plates	VWR	29442-042
10-cm plates	Sigma-Aldrich	Z688819
18-gauge needle	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-gauge needle	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Combined media 1	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media			Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.