Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Özet

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Özet

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) lentiviral bazlı yeniden programlama yöntemleri ile üretilebilir. Bununla birlikte, genomun aktif transkribe bölgelerde kalan potansiyel onkojenik genlerin izleri, insanlar için terapötik uygulamalar ¹ kullanım için potansiyelini sınırlamaktadır. Buna ek olarak, tedavi edici olarak uygun türevleri olarak, kök hücre yeniden programlanması ya da farklılaşma elde edilen insan olmayan antijenleri, insan klinik bağlamda ^2'de kullanılan bu hiPSCs engellemektedir. Bu videoda, biz yeniden programlanması ve eksojen transjenlerin ücretsiz faktör ücretsiz hiPSCs analiz etmek için bir prosedür sunuyoruz. Bu hiPSCs sonra lentivirüs ihtiva eden özel bir intron gen sentezleme anormallikleri analiz edilebilir. Bu analiz, önceden gen ekspresyonu farklılıklarını ³ tespit etmek için kullanılan daha hassas teknikler üzerinde bir avantaja sahiptir hassas bir kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Içine tam dönüşümKlinik dereceli iyi üretim uygulamaları (GMP) koşullar, insan klinik önemi veriyor. Bizim protokol sunan başka bir metodoloji sağlanan akım güvenli liman kriterleri genişletmek ve insan terapötik uygulamalar-nedeniyle insan olmayan antijenlere karşı herhangi bir immünojenisite riskini ortadan kaldırmak gerekir GMP dereceli hiPSCs, türetmek için faktör içermeyen karakterize hiPSC-tabanlı türevlerini içerir ki. Bu protokol, her tür lentiviral yeniden programlanması hücrelerin geniş çapta uygulanabilir GMP dereceli koşullarına programlanması hücreleri dönüştürmek için yeniden üretilebilir bir yöntem sağlar.

Giriş

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors^4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression⁶. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process⁷. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived⁸. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions.

Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction^3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics⁹. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions¹⁰. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance.

These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics¹¹.

We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions¹⁰. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

Protokol

Not:. Bu yöntem, Awe ark ^10'da rapor araştırmada kullanılmıştır.

STEMCCA 1. yeniden programlanması Yetişkin insan dermal fibroblastlarında

1. Çözülme yetişkin dermal insan fibroblastlarının (HUFS), 2 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde geçiş 4 ya da daha düşük, su ile şişenin üst batırmak için özen.
2. 15 ml konik bir şişe, insan fibroblast 1 ml'lik bir bulamaç koyun ve yavaş yavaş damla damla bir tarzda, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış, standart HUF ortam, 4 ml yerleştirmek, dimetil sülfoksit (DMSO) sulandırmak ve yeniden askıya hücreleri.
3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de şişe santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve / mi 100,000 hücre süspansiyonu elde etmek üzere ortam yeterli bir hacimde hücrelerin yeniden askıya ve daha sonra, altı gözlü bir plakanın bir kuyuya 2 mi ekleme,% 0.2 jelatin ile 20 dakika için önceden kaplanmış.
   NOT: hat ve durumun başına hücre eşit sayıda iyi bir kardeş fo seribaşı gerekiyorr hücre sayımı / enfeksiyon (İB) hesaplama çokluğu.
4. Eşit hücreleri dağıtmak için ileri geri yan ve plaka yan Kaya. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edin.
5. Transdüksiyon gününde hücre kardeş gelen sayısı (ler) de, ilk HUF sonra kaplama (lar) ile, takriben 24 saat elde edin.
6. 2 x 10 ⁸ TU, ya da eşdeğeri, lentiviral konsantre (STEMCCA) çözülme ve HUF medya 1 x 10 ⁸ TU / ml sulandırmak.
7. 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile takviye edilmiş HUF ortam içinde 10-İB oranında hücreleri nakletmek. Eşit kalıt kuyu karıştırın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edilir.
8. Lentiviral transdüksiyon sonra yaklaşık 24 saat, standart insan pluripotent kök hücre (PSC) orta HUF medya geçiş.
9. Gün 2 6 aracılığıyla, insan PSC orta günlük ortamı değiştirmek.
10. 6. günde, iki% 0.2 jelatin kaplı 10 cm plakayıHUF ortam ¹² CF1 fareler elde edilen 1,5 ila 10 x 1.75 ila ⁶ MEF'ler.
11. Günde 7 günü, dikkatli olmak arasında eşit tüm hücreleri kaplama ile, bir 1:16 oranında altı plaka ve geçit bir kuyudan günde 7 yeniden programlanması fibroblastlar kaldırın 100'den fazla xg, kullanım oda sıcaklığı tripsin santrifüj değil bir gün önce MEF'ler ile kaplandı taze insan PSC medya, iki 10 cm tabak,. 37 ° C bir saat yönünde sarmal hareket ve yer hücre toplulukları dağıtmak,% 5 _CO2, gece boyunca inkübatör nemlendirilmiş.
12. Yaklaşık 48 saat sonra MEF'ler ve her gün üzerine yeniden programlanması hücreleri tohumlama sonra, taze medya ile harcanan insan PSC medya dışarı değiştirmek.
13. 3-4 hafta sonra, bir 21 gauge iğne ile morfoloji gibi tipik ESC ile ayrı ayrı koloniler, çekme ve% 0.2 jelatin kaplı tek tek oyuklara belirli kolonilerin yaklaşık 8-10 bireysel parçaları yerleştirilerek 24 kuyucuklu plaka içerisine alt klonlamak 24-iyi plaka ön-çekirdekİnsan PSC ortamda CF1 fareler türetilen MEF'ler ile ed.
    NOT: seçilmiş kolonilerin büyütüldükten sonra, koloniler protein seviyesinde embriyoit vücut formasyonu ve Pluripotency markerlerinin ifadesi analizi ile pluripotent, özelliği gerekir.

2. Vektör Entegrasyon Site Analizi ve STEMCCA eksizyonu

1. ¹⁰ anlatıldığı gibi olmayan kısıtlayıcı doğrusal amplifikasyon PCR ile STEMCCA entegrasyon siteyi analiz.
2. Eski insan ESC orta kapalı aspire genomu, tüketim STEMCCA istenen alana bir entegrasyon sağlamak için tahlil sonra. Daha sonra, 24 saat süre ile standart PSC ortam 3 ml 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile konsantre Adeno Cre PuroR virüsünün 45 ul birleştirir.
3. 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, karışık bir viral süpernatan aspire ve insan PSC ortamı ile iki kez yıkama hücreleri. 5 gün arasında bir süre için 2 ug / ml puromisin ile taze insan PSC ortamlarını ortam günlük wit değiştirmekh taze medya ve antibiyotik.
4. 5 gün sonra, alt-klon 12-oyuklu bir plaka içerisinde,% 0.2 jelatin kaplı oyuklara üzerine 21-gauge iğne ile koloniler kalan CF1mice türetilen MEF'ler ile önceden kaplanmış ve yukarıda açıklandığı gibi genişletmek.
   Not: yeterli genişleme donmuş stok elde etmek üzere sonra besleyici içermeyen koşullar dönüştürme gereklidir. En hücreler başarılı bir şekilde transdüksiyona olmayacak ve kuluçkalama 5 günlük bir süre boyunca antibiyotiğe ölmek olarak en az% 95, kök hücre koloni ölümü bekliyoruz. Adeno Cre PuroR faktörü içermeyen koloni örnek reexposing, enfekte olmuş hücrelerin konukçu kromozomları içine 0.001-1 verimliliği% entegre olmasına rağmen, entegrasyon ¹³ oluştu doğrular% 100 hücre ölümünü sağlamak için puromisin için.
5. Matris bir sıvı olduğu kadar, yaklaşık 2 saat (imalatçının önerileri) bir süre boyunca buz üzerinde ön aliquoted taban membran matrisi bir vial çözülme ve soğuk bazal ortam içinde 1:30 arasında nihai bir konsantrasyona kadar sulandırmak. Cooyuk başına 1 ml bir altı yuvalı plaka içindeki yuvalara istenen sayıda. 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
6. Bir de daha önce MEF'ler ile kaplanmış 30 koloniler en az 20 (18 iğne, ya da bir cam veya plastik "ucu" kullanarak) çapraz çizgili. MEF canlandıran azaltmak ve plaka aktarmak dikkatli olun.
   1. Steril plastik pipet basit kullanımına açık alev üzerinde, daha karmaşık ısıtma, farklı yaklaşımların bir numara ile bir cam Pasteur pipet çekerek ve terbiye çapraz tarama cihazı üretmek ya, bizim olduğu gibi, 21- ve / veya 18 gauge iğne.
7. Kaplanmış de sonra inkübasyon matrisi aspire.
8. 200 ul pipet ile eski plaka hafif bir kazıma ile kolonilerin parçasını çıkarın ve dikkatli bir şekilde matris kaplı plaka taze kombine ortam 1, 3 ml içine koyun. 37 ° C,% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Değişim Medya 48 saat Pasajlanması sonra.
9. Ticari DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak,% 80'den fazla confluency, eksize-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs genomik DNA ayıklayın.
10. STEMCCA lentivirüs eksojen entegrasyon için özel primerler ile birlikte uygun bir eksizyon için Analiz: gDNA-Hendo-MycS ileri, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-ters, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. 10-uM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile Liyofilize primerler sulandırın.
11. Aşağıdaki beş aşamalı protokol ile bir PCR çalıştırın: ilk denatürasyon 3 dakika boyunca 95 ° C'de; 15 saniye için 72 ° C 'de 15 saniye ve uzatılması için 62 ° C'de 20 saniye, primer tavlama için 98 ° C' de denatürasyon, aşağıdaki her bir 35 döngü 3 dakika boyunca 72 ° C 'de, tek bir döngü son uzatma eklenmiştir.
12. Agaroz 1.5 gram tartılması ve 50 mi 1 x Tris-asetat-EDTA tampon içine yerleştirerek bir% 3 agaroz jel olun. Agaroz kadar Mikrodalga çözülmüş ve DNA jel leke olarak yer p de olduğuroper seyreltme, karıştırma, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya jel kasetine doğru hacminin dağıtımı.
13. PCR ürününün yüklenebilir 12 ul% 3 agaroz jel içine yükleme boyası 3 ul ile karıştırılır. 80 V de 30 dakika boyunca jel başlat
14. Uygun eksizyon gösteren bir grubun olmaması için ultraviyole ışık ile gözünüzde canlandırın.

Öncesi ve Sonrası-kesilmiş hiPSCs gelen Kantitatif PCR kullanarak Gen İfadesi Farklar 3. kantitasyonu

1. Ticari RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kesilmiştir-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs toplam RNA ayıklayın.
2. -Ters uyarlamak üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari kitler kullanılarak toplam RNA 1 ug kadar. Demirli-oligo (dT) ₁₈ ve rasgele heksamer primer kullanın.
   NOT: PCR protokolü 4 kb daha fazla veya daha az gen transkriptleri için özel olduğundan emin olun. Spesifik primerler hangisi gen STEMCCA başlangıçta entegre i için yapılan gerekecektirnGoogle'a.
3. 20 mcM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile liyofilize astar sulandırın.
4. 10 mcM UPL prob oluşan reaksiyon 20 ul, 2x LightCycler 480 Problar Lisans başına numune 5 ng kullanın ve ileri 20 uM ve geri primerler.

GMP dereceli Koşullar içine 4. Dönüşüm

1. GMP dereceli koşullarına üzerinde post-eksize hiPSCs geçiş ilk gününde, kombine insan PSC oluşan medya karışımı yapmak ortam 1 (kombine medya 1) ve klinik notu iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu medya (kombine medya 2 ) 80:20 oranında.
2. Aspire eski kombine medya 1 ve 80:20 oranında yeni kombine medya 1 ve 2, önceden ısıtılmış 3 ml, koyun kapalı. Bu özel oran ile 3 gün boyunca günde ortamı değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
3. 4. günde, 50:50 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Eski orta ve Replac kapalı aspire50:50 oranında bir araya ortam 1 ve 2 ile önceden ısıtılmış ortam, e. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
4. 7. günde, bir 20:80 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Aspire eski orta kapalı ve 20:80 oranında kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
5. 100 oranında: günde 10, bir 0 kombine Ortam 1 ve 2 yapmak. Aspire eski orta kapalı ve 0 kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin: 100 oranında. Bu özel bir oranda her gün medya değiştirin. Hücreler, tam olarak tanımlanmış kseno-içermeyen ortam artık. Lütfen 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
   Not: Bu, tüm dönüştürme işlemi sırasında bir 18 gauge iğne ile rutin pasajı uygun koloni büyüklüğü ve yoğunluğu sağlamak için gereklidir. S Planıkoloni boyutu akma ve farklılaşma olarak her 4-5 gün hücreler assaging.
6. Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi tanımlanmış bir kseno-serbest alt-tabaka ile, altı gözlü bir plakanın üzerindeki çukurların kaplayın on.
7. Mekanik geçit konfluent iyi, zaten 18-gauge iğne ile altı-kuyu plaka, kseno ücretsiz medya koşullarını dönüştürülür. Önemlisi, medya pre-condition için pasaj önce, 1 saat 1x ROCK inhibitörü olan hücreler üzerinde yeni medya (kombine medya 2) yerleştirin.
8. Hücreler transfer ediliyor, yeni plaka kapalı sentetik substrat solüsyonu aspire. Eski plaka kök hücre kümeleri içeren tüm ortamları çıkarın ve yeni plaka transfer.
9. (Kez inkübatör içinde, doğrudan herhangi bir şekilde dokunulmaz olan ideal plakaları) geri az fiziksel rahatsızlık ile 2 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO ₂ kuvöz içine yerleştirin hücreleri maksimum eki izin vermek.
   NOT: Hücreler günlük medya değişiklikleri gerektirir. Sürekli passaging her 4 günde önemli olacaktır. 21-gauge iğne, optimum ESC-benzeri morfolojisi (yüksek Nükleositoplazmik oranı) ile kolonilerin geçişi yalnızca parçalarını kullanarak. Bu iyi büyür ve sonunda homojen koloniler verecek uygun hiPSC koloniler için seçimi sağlayacaktır. Kolonilerin gibi ESC derivasyon genel zaman ilk kombine medya değişiminden sonra 15-20 gün arasındadır.
10. 18-gauge iğne ile ilk çapraz-hatch ile kolonilerin tüm GMP dereceli sonrası eksize hiPSCs aşağı dondurun. 200 ul pipet kullanılarak atık tüm parçaları kaldırın ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml konik bir şişe ve santrifüj hücreleri ihtiva eden tüm medya aktarın.
11. Hücreler santrifüje tabi olsa da, soğuk kombine ortam 2 eşit hacimlerde oluşan ve% 7.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu ile orta donması dondurma ortamı olun.
12. Hücreler pelet sonra, eski orta aspire ve dondurma medya ile pelet yeniden askıya-damla damla. Hemen trdonma şişelere ansfer ve ° C derin dondurucuda bir -80 koydu.

5. karakterizasyon GMP dereceli Post-eksize hiPSCs

1. 3. adımda qPCR yöntemleri de belirtildiği gibi takip anahtar Pluripotency belirteçlerinin (Sox2 Oct4 ve Nanog) aynı adımları Tablo 1'de listelenen primerler kullanılarak ifadesinin miktarını belirlemek için, QPCR kullanarak Pluripotency belirteçlerinin sonrası dönüşüm uygun bir ifade sağlamak için Aşama 3 'de gösterildiği gibi, aynı adım.
2. Kullanımlar, daha önce ¹⁰ yayınlanan kitte yer alan standart koşullara uygun olarak, insan olmayan bir sialik asit Neu5Gc (N -glycolylneuraminic asit) tespit etmek için akış sitometrisi.
3. Yavaşça 1x Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanarak, hücrelerin bulunduğu hücre kültürü plakaları yıkayın.
4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x ayrışma ajanı kullanılarak koloni ayrıştırmaları.
5. Aşama 5.4, 5-dakikalık inkübasyon süresi esnasında verilen engelleme çözeltisi (hazırlamakbuz soğukluğunda PBS içinde bloke edici madde, bir% 0.5 yaparak Kit) birleştirildi.
6. Flow sitometri analizi için tüplerin aşağıdaki kümesi Etiket: lekesiz; 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; Kontrol antikoru 1: 200; Birincil antikor, 1: 200; İkincil antikor, 1: 200 Eşek anti-tavşan IgG'si (H + L); Örnek MEF'ler; Matris üzerinde örnek sonrası eksize hücreler; ve Numune sentetik alt tabaka üzerine hücreleri sonrası çıkarıldı.
7. Yavaşça, 15 ml konik bir tüp çözeltisi ve aktarma içeriği bloke 2 ml ilave adım 5.4 hücre agregatları neden olacaktır. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 80 x g'de santrifüjleyin.
8. Adım 5.7 belirtildiği gibi çözüm ve santrifüj engelleme ile iki kez hücreleri yıkayın.
9. Yavaşça her bir antikorun uygun seyrelme hacmi ile bloke etme çözeltisi 100 ul, yaklaşık 1 x 10 ⁶ hücre yeniden askıya. Yumuşak, 1 saat boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin.
10. Adım 5.8 gibi yıkar üç kez tekrarlayın.
11. Seyreltici Bu yüklenmiştir 400 ul hücre pelletini yeniden askıyaffer 1 ile (kit): tüpler 2, 6, 7 için DAPI 100 ve 8 adımda 5.6 altında listelenen.
12. 40 mcM süzgecinden Gerinim hücreleri ve akış sitometresinin koşuyoruz.

Sonuçlar

Bu STEMCCA Lentiviral bazlı yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, klinik sınıf faktörü içermeyen hiPSCs türetmek için bir protokol mevcut. Şekil 1A MEF'ler bir tabakası üzerinde STEMCCA yaklaşımı ile yeniden programlama sonra, üç farklı önceden kesilmiş hiPSC hatları temsili görüntüsünü gösterir. STEMCCA yeniden programlama yaklaşımının temel avantajı, farklı araştırma grupları ve yerlerde, birden fazla bilim adamları tarafından elde tutarlı yeniden progr...

Tartışmalar

Biz faktör ücretsiz hiPSCs kaynaklanan ve gelecekteki insan tedavide mansap hücre farklılaşması için GMP dereceli koşulları içine bu hücrelerin dönüştürerek onları klinik açıdan yapma bir metodoloji açıklar. Bu protokol, hücre tiplerinde çeşitli geniş çapta uygulanabilir olsa da, bağlı hastadan çıkarma kolaylığı ve kişiye özel insan terapötiklere uygulanabilirlikleri, insan dermal fibroblastları yeniden programlamak seçtik. Sınırlamalar klinik açıdan anlamlı hücre türevleri i?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5%	Invitrogen	15400-054	Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Basel, Switzerland)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium	Lonza (Basel, Switzerland)	12-769E
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatin, from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/transfection agent	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-well plates	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-well plates	VWR	29442-042
10-cm plates	Sigma-Aldrich	Z688819
18-gauge needle	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-gauge needle	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Combined media 1	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media			Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.