Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии и превращение в определенных условиях Клинико-класса

Резюме

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Аннотация

Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) могут быть получены лентивирусными на основе перепрограммирования методологий. Тем не менее, следы потенциально онкогенных генов, оставшихся в активно транскрибируются областей генома, ограничить их потенциал для использования в терапевтических применений человека ^1. Кроме того, нечеловеческие антигены, полученные из стволовых клеток перепрограммирования или дифференциации в терапевтически соответствующих производных исключает эти hiPSCs от использования в человеческом клиническом контексте ^2. В этом видео мы представляем процедуру перепрограммирования и анализа факторов без hiPSCs бесплатно экзогенных трансгенов. Эти hiPSCs затем могут быть проанализированы на экспрессии генов отклонений в конкретной интрона, содержащего лентивирусов. Этот анализ может быть проведен с использованием чувствительной количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет преимущество по сравнению с менее чувствительными методами, ранее использованный для определения различий экспрессии генов ^3. Полная конверсия вклинико-класс надлежащей производственной практики (GMP) условия, позволяет клиническое значение человека. Наш протокол предлагает другой методологии, при условии, что текущие критерии безопасной гавани будет расширяться и включать в себя охарактеризованные hiPSC на основе производных Фактор-бесплатно терапевтических применений-для получения GMP-класса hiPSCs, которые должны устранить любую иммуногенности риск из-за нечеловеческих антигенов человека. Этот протокол широко применима к лентивирусов перепрограммировать клетки любого типа и обеспечивает воспроизводимый метод для преобразования перепрограммировать клетки в условиях GMP-класса.

Введение

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors^4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression⁶. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process⁷. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived⁸. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions.

Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction^3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics⁹. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions¹⁰. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance.

These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics¹¹.

We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions¹⁰. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

протокол

Примечание: Этот метод был использован в исследованиях сообщается в страхе и др ^10..

1. Перепрограммирование взрослого человека фибробласты кожи с STEMCCA

1. Оттепель взрослых кожные фибробласты человека (HUFs), прохождение 4 или ниже, в C водяной бане 37 ° в течение 2 мин, следя за тем, чтобы не погрузиться в верхней части флакона с водой.
2. Поместите 1 мл суспензии фибробластов человека в 15-мл коническую пробирку и медленно поместить 4 мл стандартного HUF информации, предварительно нагретой до 37 ° С, в каплям, чтобы разбавить из диметилсульфоксид (ДМСО) и повторно приостанавливать клеток.
3. Центрифуга пробирку при 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клеток в достаточный объем информации для создания суспензии 100000 клеток / мл, а затем добавить 2 мл в одну лунку в шесть-луночного планшета, предварительно покрытых в течение 20 мин с 0,2% желатина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: сестра также с равным количеством клеток в строке и состояния должна быть заполнена FOR клеток учета / множественность заражения (МВД) расчета.
4. Рок плиты из стороны в сторону и назад и вперед, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С, 5% СО ₂ в увлажненном инкубаторе.
5. В день трансдукции, получить количество клеток (ов) из сестры хорошо (ов) примерно через 24 часа после начального форинтов покрытия.
6. Оттаять 2 х 10 ⁸ Вт, или эквивалент, Lentiviral концентрат (STEMCCA) и доводят до 1 х 10 ⁸ TU / мл в HUF СМИ.
7. Трансдукции клеток в соотношении 10 MOI в HUF среде с добавлением 8 мкг / мл трансфекции агента. Смешайте трансдуцированных скважин равномерно и инкубировать в течение ночи при 37 ° С, 5% СО ₂ в увлажненном инкубаторе.
8. Примерно 24 часа после лентивирусным трансдукции, включите СМИ HUF к стандартному человек плюрипотентных стволовых клеток (PSC) среды.
9. В те дни, со 2 по 6, изменить СМИ ежедневно с человека PSC среды.
10. На 6-й день, два пластине 0,2% желатина покрытием 10 см пластиныОт 1,5 до 1,75 х 10 ⁶ MEFs, полученные из CF1 мышей форинтов СМИ ^12.
11. На 7-й день, стараясь не центрифугировать более чем 100 XG, используйте при комнатной температуре трипсин поднять выходной день 7 перепрограммировать фибробласты из одной скважины из шести-луночного планшета и прохождения в соотношении 1:16, при посеве все клетки равномерно между два 10 см пластинах, с свежей человеческой PSC СМИ, что высевали с MEFs день раньше. Распределить клеточных агрегатов по часовой спиральной движения и места в 37 ° C, 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе в течение ночи.
12. Примерно через 48 часов после посева перепрограммировать клетки на MEFs и каждый день после этого, измените из потратили PSC СМИ человека со свежими СМИ.
13. После 3-х до 4 недель, выбрать отдельные колонии с типичной морфологии ESC как с 21-калибровочной иглой и субклонирования вне в 24-луночный планшет, поместив примерно от 8 до 10 отдельных частей конкретных колоний на отдельные лунки в 0,2% желатина покрытием 24-луночный планшет предварительно семянред с MEFs, полученных от мышей CF1 в человеческой PSC среды.
    Примечание: После расширения выбраны колонии, колонии должны быть охарактеризованы как плюрипотентные по эмбриоидного формирования тела и анализа экспрессии маркеров плюрипотентности на уровне белка.

2. вектор интеграции Анализ сайта и STEMCCA Удаление

1. Анализ сайта интеграции STEMCCA государств, не являющихся ограничительными линейного усиления ПЦР, как описано ^10.
2. После опробования, чтобы обеспечить один интеграцию в нужной области генома, акцизов STEMCCA путем аспирации от старого человека ESC среду. Затем объединить 45 мкл концентрированной аденовирус-Cre-Puror с 8 мкг / мл трансфекции агента в 3 мл стандартных средах PSC в течение 24 ч.
3. После 24-часового инкубационного периода, аспирация от смешанного вирусной супернатант и промыть клетки в два раза с PSC СМИ человека. Поместите свежей человеческой PSC носитель вместе с 2 мкг / мл пуромицин в течение 5 дней, изменения медиа-дневной умч свежей среды и антибиотик.
4. После 5 дней, субклон остальные колонии с 21-калибровочной иглой на 0,2% желатином лунок, в 12-луночный планшет, предварительно покрытые MEFs, полученных из CF1mice и расширить, как описано выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После достаточное расширение для получения замороженного состава, преобразование в фидерных без условий требуется. Ожидать по крайней мере 95% колоний стволовых клеток смерть как большинство клеток не будет успешно трансдуцированных и поддаваться антибиотика в течение 5-дневного периода инкубации. Хотя Adeno-Cre-Puror объединяет в 0,001-1 эффективности в хромосомы хозяина инфицированных клеток%, reexposing образец фактора без колоний Пуромицин, чтобы обеспечить смерть 100% клеток подтвердит никакой интеграции не произошло ^13.
5. Оттепель одну ампулу предварительно аликвоты базальной мембраны матрицы на льду, в течение приблизительно 2 ч (рекомендациями производителя) до тех пор, пока матрица представляет собой жидкость и разбавленной к конечной концентрации 1:30 в холодной базальной средах. Компанияна желаемое количество лунок в шесть-луночного планшета с 1 мл на лунку. Пусть сидят при комнатной температуре в течение 1 часа.
6. Кросс-люк (с помощью 18-иглы, или стекла или пластика "наконечник") по крайней мере от 20 до 30 колоний от хорошо предварительно покрыты MEFs. Будьте осторожны, чтобы уменьшить MEF поднимает настроение и передать от пластины.
   1. Генерирование штриховкой устройство с помощью ряда различных подходов, с более сложной нагрева, потянув, и заканчивая стеклянной пипетки Пастера на открытом пламени, в простом использованием стерильной пластиковой пипетки наконечник, или, как в нашем случае, 21- и / или 18 калибра иглы.
7. Аспирируйте матрицу из лунку, покрытую после инкубации.
8. Удалить части колоний, осторожно выскабливание от старого пластины с 200 мкл, пипетки и осторожно поместите в 3 мл свежего комбинированных СМИ 1 в пластине матрицы покрытием. Выдержите в течение ночи в 37 ° C, 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе. Изменить массовой информации 48 часа после пересева,
9. Извлечение геномной ДНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs, более чем на 80% слияния, используя комплекты коммерческой добычи ДНК.
10. Анализ для правильного удаления с праймерами, специфичными для внешних интеграции лентивирусов STEMCCA: гДНК-Hendo-MycS вперед, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; гДНК-hWPRE-наоборот, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ». Восстановить лиофилизированные праймеры с ПЦР-класса водой до 10-мкМ исходного раствора.
11. Запуск ПЦР со следующими пятиступенчатой ​​протокола: начальная денатурация при 95 ° С в течение 3 мин; 35 циклов каждого из следующего: денатурации при 98 ° С в течение 20 сек, отжиг праймеров при 62 ° С в течение 15 сек и удлинение при 72 ° С в течение 15 сек; с последующим одного цикла конечного удлинения при 72 ° С в течение 3 мин.
12. Сделать 3% агарозном геле путем взвешивания 1,5 г агарозы и размещение его в 50 мл 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфера. Микроволновая печь до агарозы растворяются и место в ДНК в геле пятно на рРазбавление Ропер, смешать, а обойтись надлежащего объема в геле кассеты для отверждения в течение 1 ч при комнатной температуре.
13. Нагрузка 12 мкл ПЦР-продукта смешивали с 3 мкл загрузочного красител в 3% агарозном геле. Запустите гель в течение 30 мин при 80 В.
14. Визуализация ультрафиолетовым светом для отсутствие полосы индикации надлежащего иссечение.

3. Количественный анализ различий экспрессии генов с помощью количественной ПЦР с пре- и пост-подакцизных hiPSCs

1. Извлечение общую РНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs с помощью наборов коммерческих экстракции РНК.
2. Обратное записать до 1 мкг суммарной РНК с помощью коммерческих наборов в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Используйте якорь-олиго (дТ) ₁₈ и случайных праймеров гексамерных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протокол ПЦР специально для генных транскриптов более или менее 4 кб. Специфические праймеры должны быть сделаны для какой ген STEMCCA первоначально Встроенные входыNto.
3. Развести лиофилизированный праймера с ПЦР-класса водой до 20 мкМ исходного раствора.
4. Использование 5 нг образца в 20 мкл реакции, который состоит из 10 мкм UPL зонда, 2x LightCycler 480 Probes Master и 20 мкМ прямого и обратного праймеров.

4. Преобразование в GMP-класса условий

1. На первый день перехода пост-вырезали hiPSCs к условиям GMP-класса, сделать смесь массовой информации, состоящей из человеческого PSC в сочетании СМИ 1 (1 в сочетании СМИ) и клиническая оценка надлежащей производственной практики (GMP), совместимые средства массовой информации (в сочетании СМИ 2 ) при соотношении 80:20.
2. Аспирируйте от старых комбинированных средах 1 и 3 место мл нового комбинированного СМИ 1 и 2, предварительно нагретой при отношении 80:20. Изменение формата носителя в день в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
3. На 4-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 50:50. Аспирируйте от старого среды и замее с предварительно нагретой СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 в соотношении 50:50. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
4. На 7-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 20:80. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированным сред 1 и 2 в соотношении 20:80. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
5. На 10 день, чтобы суммарный сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Изменение формата носителя каждый день в этом определенном соотношении. Клетки сейчас в совершенно определенной Xeno без средств массовой информации. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всего этого процесса преобразования, процедура пассажи с 18-иглы необходимо для поддержания нужного размера колонии и плотность. План по рassaging клетки каждые 4 до 5 дней на основе размера колонии, слияния и дифференциации.
6. Шерсть один и в шесть-луночного планшета с определенной Xeno свободной подложки в соответствии с рекомендациями производителя.
7. Механически проход сливной хорошо, уже превращается в Xeno без условия медиа, от шести-луночного планшета с 18-иглы. Важно отметить, что размещать новые средства массовой информации (в сочетании с медиа-2) на клетках с рок-ингибитора 1x в течение 1 часа, прежде чем пассажей в предварительное условие СМИ.
8. Аспирируйте синтетический раствор субстрата с нового пластины, что клетки перечисляется на. Удалите все носители, содержащие стволовые клетки сгустки из старой плиты и передать новой пластинкой.
9. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение 2 дней с минимальной физической нарушения (в идеале пластины, как только внутри инкубатора, непосредственно не затронуты в любом случае), чтобы обеспечить максимальную вложение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки потребует ежедневные изменения средств массовой информации. Постоянное passaginг каждые 4 дня будут иметь важное значение. Использование 21-иглы, прохождение только части колоний с оптимальным ESC морфологию (высокая цитоплазматический отношение). Это позволит обеспечить выделение для собственных колоний hiPSC, которые будут расти хорошо и в конечном итоге дают однородные колонии. Общее время на выводе ESC как колоний между 15-20 дней после первого комбинированного смены носителя.
10. Промерзать пост-вырезали hiPSCs GMP-класса по первой штриховки всех из этих колоний, используя 18-иглы. Лифт все куски у с помощью 200 мкл пипетки и передавать все носители, содержащие клетки в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
11. В то время как клетки центрифугированием, чтобы морозильную носитель, состоящий из равных объемов холодной комбинированных средах 2 и замораживания среды с конечной концентрацией ДМСО 7,5%.
12. После Клетки осаждают, аспирация от старого среды и по каплям вновь приостановить гранул с морозильной СМИ. Сразу TRansfer во флаконы замораживания и поставить в -80 ° C морозильнике.

5. Характеризуя GMP-класса Post-подакцизных hiPSCs

1. Для обеспечения надлежащего выражения маркеров плюрипотентности после преобразования используйте QPCR для количественной оценки экспрессии ключевых маркеров плюрипотентности (SOX2, OCT4 и NANOG) с помощью праймеров, перечисленных в таблице 1 те же действия, как указано в пункте 3. QPCR методологий следовать те же самые шаги, перечисленные в пункте 3.
2. Использование проточной цитометрии для обнаружения не-человеческого сиаловой кислоты Neu5Gc (N -glycolylneuraminic кислоты) в соответствии со стандартными условиями, перечисленными в комплекте, как описано ранее ^10.
3. Осторожно промыть клеточной культуры пластины с клетками с помощью 1x фосфатно-солевом буфере (PBS).
4. Диссоциируют колонии с помощью 1x диссоциации реагента в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Во время 5-минутного периода инкубации на стадии 5.4, подготовить блокирующий раствор (представленную вКомплект), сделав 0,5% блокирующий агент в ледяной PBS.
6. Этикетка следующий набор труб для проточной цитометрии: неокрашенные; 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) DAPI; Антитело управления 1: 200; Первичное антитело 1: 200; Вторичный антитела 1: 200 осел Анти-курицы IgG (H + L); Примеры MEFs; Примеры пост-вырезали клетки на матрице; и образец после вырезали клетки на синтетической подложке.
7. Осторожно сместить клеточных агрегатов с шага 5,4 путем добавления 2 мл блокирующего раствора и передачи содержимого в 15-мл коническую трубку. Центрифуга на 80 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
8. Вымойте клетки в два раза с блокирующим раствором и центрифуги, как указано в пункте 5.7.
9. Осторожно повторно приостанавливать приблизительно 1 × 10 ⁶ клеток в 100 мкл блокирующего раствора с соответствующим объемом разбавления каждого антитела. Инкубируют при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 1 часа.
10. Повторите моет три раза, как в шаге 5.8.
11. Повторное приостановить осадок клеток в 400 мкл разбавителя Buffer (с комплектом) с 1: 100 в DAPI для труб 2, 6, 7, и 8, перечисленных в соответствии с шагом 5,6.
12. Штамм клеток через 40 мкм сито и проходят через проточной цитометрии.

Результаты

Мы представляем протокол для получения фактора без hiPSCs клинико-класса с помощью подход перепрограммирования STEMCCA лентивирусный основе. 1А показывает репрезентативную картину трех различных предварительно вырезали линий hiPSC, после перепрограммирования с подходом STEMCCA на сло?...

Обсуждение

Мы описываем методологию получения фактора без hiPSCs и сделать их клиническое значение путем преобразования этих клеток в условиях GMP-класса для последующего дифференцировки клеток в будущих терапии человека. Хотя этот протокол является широко применимы к различным типам клеток, мы вы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5%	Invitrogen	15400-054	Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Basel, Switzerland)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium	Lonza (Basel, Switzerland)	12-769E
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatin, from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/transfection agent	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-well plates	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-well plates	VWR	29442-042
10-cm plates	Sigma-Aldrich	Z688819
18-gauge needle	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-gauge needle	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Combined media 1	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media			Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.