Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Riepilogo

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Abstract

Umane pluripotenti indotte (cellule staminali hiPSCs) possono essere generati con le metodologie di riprogrammazione basata lentivirali-. Tuttavia, tracce di geni potenzialmente oncogeni rimanenti nelle regioni attivamente trascritti del genoma, limitano il loro potenziale per l'uso in applicazioni terapeutiche umani ^1. Inoltre, antigeni non umani derivanti dalla riprogrammazione di cellule staminali o di differenziazione in derivati ​​terapeuticamente rilevanti escludono questi hiPSCs vengano utilizzati in un contesto clinico umano ^2. In questo video, vi presentiamo una procedura per la riprogrammazione e l'analisi hiPSCs senza fattore gratuitamente transgeni esogeni. Questi hiPSCs poi possono essere analizzati per alterazioni di espressione genica nel introne specifica l'lentivirus. Questa analisi può essere condotta utilizzando sensibile reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR), che ha un vantaggio rispetto meno sensibili tecniche precedentemente utilizzato per rilevare le differenze di espressione genica ^3. La conversione completa inbuone prassi di fabbricazione clinica-grade (GMP) condizioni, permette di rilevanza clinica umana. Il nostro protocollo offre un altro metodo, a condizione che i criteri esenti attuali espandere e comprendono caratterizzati derivati ​​basati hiPSC senza fattore di applicazioni, ad terapeutiche umane derivanti hiPSCs GMP-grade, che dovrebbero eliminare qualsiasi rischio di immunogenicità a causa di antigeni non-umani. Questo protocollo è ampiamente applicabile per lentivirali riprogrammato cellule di qualsiasi tipo e fornisce un metodo riproducibile per la conversione di cellule riprogrammate in condizioni di GMP-grade.

Introduzione

Adult human cells have been shown to be capable of undergoing epigenetic remodeling and reprogramming, as a result of lentiviral-based expression of four key transcription factors^4,5. An important advancement in the reprogramming field was the use of a single excisable lentiviral stem cell cassette (STEMCCA), which housed all four reprogramming transcription factors that allowed a precise stoichiometric ratio of protein expression⁶. Additionally, when transduced in specific multiplicity of infection ranges, STEMCCA can lead to predominantly single genomic integration events during the reprogramming process⁷. The introduction of an excisable version of STEMCCA, which utilizes Cre/loxP technology followed by excision of the reprogramming vector after derivation of the stem cell line, enabled factor-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines to be derived⁸. Additionally, in order to enhance therapeutic applications of hiPSCs, a novel, quick, and readily applicable methodology for good manufacturing practice (GMP)-grade cell line conversion, from xeno-containing to xeno-free conditions, needed to be implemented. Here, we discuss a relevant methodology that more precisely assesses integrated gene expression differences, specifically when integrated into an intron, and clinical-grade cell conversion into putative GMP conditions.

Previous research has used only relatively insensitive microarray transcriptional analysis to analyze gene expression differences in integrated genes after STEMCCA transduction^3,9. Here, we introduce the methodology of sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) analysis, to further examine integrated gene expression differences. Importantly, current safe-harbor criteria discard hiPSCs that have genes with viral integrations, thus limiting the applicability of these cells for downstream human cellular therapeutics⁹. We propose that the status quo may change with the use of fully characterized and transgene-free intronically reprogrammed hiPSCs. Additionally, we introduce a robust GMP-grade cell conversion protocol that can be readily applied to a variety of different cell types, which were originally derived under xeno-containing conditions¹⁰. This provides significant opportunities for the development of future cell reprogramming experiments, which require clinical-grade conditions to maintain human therapeutic relevance.

These methodologies provide a foundation upon which current safe-harbor criteria may be expanded to include characterized STEMCCA reprogrammed hiPSC lines that maintain a normal gene expression profile after STEMCCA excision from the integrated intron. Also, full conversion into clinical-grade conditions, free from non-human animal antigens, will help to incorporate many more cell types, which have previously been reprogrammed and characterized only in xeno-containing conditions. These methodologies combined, are persuasive grounds for the US Food and Drug Administration (FDA) to consider expanding their limited approval from human embryonic stem cell (ESC)-based therapeutics to hiPSC-based therapeutics¹¹.

We recently detailed the derivation of a factor-free hiPSC line that was fully characterized and converted into putative clinical-grade conditions¹⁰. Here, we detail the protocol for hiPSC derivation by utilizing the STEMCCA lentivirus. These stem cells then undergo an excision process followed by gene expression characterization. Finally, the hiPSCs are converted over into GMP-grade conditions by a slow conversion methodology.

Protocollo

NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata nel Awe et al ^10..

1. Riprogrammazione umano adulto Dermal fibroblasti con STEMCCA

1. Fibroblasti dermici Thaw adulti umani (HUFS), di passaggio a 4 o inferiore, in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti, avendo cura di non immergere la parte superiore del flaconcino con l'acqua.
2. Posizionare la poltiglia 1 ml di fibroblasti umani in una fiala conica 15 ml e posizionare lentamente 4 ml di supporti HUF standard preriscaldata a 37 ° C, in un modo goccia a goccia, per diluire le dimetil solfossido (DMSO) e risospendere le cellule.
3. Centrifugare la fiala a 200 xg per 10 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un volume adeguato di media per creare una sospensione di 100.000 cellule / ml e aggiungere 2 ml in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, pre-rivestito per 20 minuti con 0,2% di gelatina.
   NOTA: Una sorella bene con un numero uguale di cellule per linea e condizione deve essere seminato for il conteggio delle cellule / molteplicità di infezione (MOI) di calcolo.
4. Oscillare la piastra di lato all'altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
5. Il giorno di trasduzione, ottenere conta delle cellule (s) dalla sorella ben (s) circa 24 ore dopo la placcatura HUF iniziale.
6. Scongelare 2 x 10 ⁸ TU, o, concentrato lentiviral equivalente (STEMCCA) e portare a 1 x 10 ⁸ TU / ml in HUF media.
7. Trasdurre cellule con un rapporto di 10-MOI in HUF multimediale integrato con 8 mg / ml agente trasfezione. Mescolare pozzi trasdotte uniformemente e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
8. Circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale, passare i mezzi di HUF di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) medie standard.
9. Nei giorni 2 a 6, cambiare i media quotidiana di media PSC umana.
10. Il giorno 6, piatto due 0,2% di gelatina rivestite piatti da 10 cm di1,5-1,75 x 10 ⁶ MEF derivati ​​da CF1 topi in HUF supporti ^12.
11. Il giorno 7, facendo attenzione a non centrifugare più di 100 grammi, l'uso della temperatura ambiente tripsina per sollevare la giornata 7 fibroblasti riprogrammate da un pozzetto della piastra sei bene e il passaggio ad un rapporto di 01:16, placcando tutte le cellule in modo uniforme tra due piastre 10 cm, con i media PSC umano fresco, che sono stati placcati con MEF il giorno prima. Distribuire aggregati di cellule in un movimento a spirale in senso orario e posto a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore umidificato notte.
12. Circa 48 ore dopo la semina le cellule riprogrammate sul MEF e ogni giorno dopo, cambiare fuori trascorsi supporti PSC umani con mezzi freschi.
13. Dopo 3 o 4 settimane, prendere le singole colonie con tipico ESC come la morfologia con un ago 21-gauge e subclone fuori in un 24-pozzetti stipulando circa 8 a 10 pezzi singoli di colonie specifiche nei singoli pozzetti in un 0,2% di gelatina rivestita 24 pozzetti pre-seeded con MEF derivate da topi CF1 a medio PSC umana.
    NOTA: Dopo l'espansione delle colonie raccolte, le colonie devono essere caratterizzato come pluripotenti dalla formazione corpo embrioide e analisi di espressione di marcatori pluripotenza a livello proteico.

2. Vector Integrazione analisi in loco e STEMCCA Excision

1. Analizzare il sito di integrazione STEMCCA da amplificazione lineare non restrittiva PCR come descritto ^10.
2. Dopo saggiare per garantire una integrazione in una zona desiderata del genoma, STEMCCA accise aspirando il vecchio supporto ESC umana. Poi, unire 45 ml di virus adeno-Cre-PuroR concentrato con 8 mg / ml agente trasfezione in 3 ml di media PSC standard per la 24 ore.
3. Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, aspirare il surnatante virale mista e lavare le cellule due volte con i media PSC umani. Inserire supporti PSC umani freschi insieme con 2 ug / ml puromicina per un periodo di 5 giorni, cambiando i media ingegno giornalierah mezzi freschi e antibiotici.
4. Dopo 5 giorni, subclone rimanendo colonie con un ago 21-gauge su 0,2% pozzi gelatina rivestite, in un 12-pozzetti pre-rivestito con MEF derivati ​​da CF1mice ed espandere come sopra.
   NOTA: Dopo l'espansione sufficiente per ottenere un titolo congelato, è necessaria la conversione in condizioni di assenza di alimentazione. Aspettatevi almeno il 95% la morte colonia di cellule staminali, come la maggior parte delle cellule non saranno trasdotte con successo e si soccombere antibiotico nel periodo di 5 giorni di incubazione. Sebbene adeno-Cre-PuroR integra in un efficienza 0,001-1% in cromosomi di accoglienza delle cellule infette, reexposing un campione di colonie senza fattore di puromicina per assicurare la morte cellulare 100% confermerà nessuna integrazione è verificato ^13.
5. Scongelare una fiala di pre-aliquotati matrice membrana basale su ghiaccio, per un periodo di circa 2 ore (raccomandazioni del produttore) finché la matrice è un liquido e diluire ad una concentrazione finale di 1:30 fredda mezzi basale. Coal numero desiderato di pozzetti in una piastra a sei pozzetti di 1 ml per pozzetto. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Cross-botola (con un ago calibro 18, o un bicchiere di plastica o "punta"), almeno 20 o 30 colonie da un pozzo in precedenza rivestito con MEF. Fare attenzione a ridurre MEF edificante e trasferire dalla piastra.
   1. Generare il dispositivo tratteggio attraverso un certo numero di approcci differenti, dal riscaldamento più complicato, tirando, e la finitura di una pipetta Pasteur di vetro su una fiamma libera, per il semplice utilizzo di una punta di plastica pipetta sterile o, come nel nostro caso, 21- e / o calibro 18 aghi.
7. Aspirare la matrice dal rivestito ben dopo incubazione.
8. Togliere i pezzi delle colonie delicatamente raschiando dal vecchio piatto con una pipetta 200 microlitri e posizionare con cura in 3 ml di mezzi freschi combinate 1 nel piatto di matrice rivestita. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore umidificato. Cambia i media 48 ore dopo passaging.
9. Estratto DNA genomico da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore, a più del 80% di confluenza, con kit di estrazione del DNA commerciale.
10. Analizzare per una corretta asportazione con primer specifici per le integrazioni esogeni del lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Ricostituire primer liofilizzati con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 10 micron.
11. Eseguire una PCR con il seguente protocollo cinque fasi: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di ciascuno dei seguenti: denaturazione a 98 ° C per 20 sec, ricottura di primer a 62 ° C per 15 sec, ed estensione a 72 ° C per 15 sec; seguito da un singolo ciclo di estensione finale a 72 ° C per 3 min.
12. Effettuare un gel di agarosio al 3% in peso su 1,5 g di agarosio e l'immissione in 50 ml di tampone Tris-acetato 1x-EDTA. Forno a microonde fino agarosio è sciolto e posto in gel macchia DNA a pdiluizione Roper, mescolare e dispensare il volume corretto in cassette gel a solidificare per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Carico 12 ml di prodotto di PCR mescolato con 3 ml di colorante di caricamento in un gel di agarosio al 3%. Eseguire il gel per 30 minuti a 80 V.
14. Visualizza con luce ultravioletta per l'assenza di una banda che indica il corretto escissione.

3. La quantificazione di differenze di espressione genica utilizzando PCR quantitativa di pre e post-hiPSCs asportati

1. Estratto RNA totale da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore utilizzando kit di estrazione RNA commerciali.
2. Reverse-trascrivere fino a 1 mg di RNA totale utilizzando kit commerciali in conformità con le istruzioni del produttore. Utilizzare ancorato-oligo (dT) ₁₈ e primer esameriche casuali.
   NOTA: Assicurarsi che il protocollo PCR è su misura per le trascrizioni gene di più o di meno di 4 kb. Dovranno essere fatti per i qualsiasi gene STEMCCA originariamente integrato primer specificinto.
3. Ricostituire il primer liofilizzato con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 20 micron.
4. Utilizzare 5 ng di campione per 20 microlitri di reazione che consiste di sonda UPL 10 micron, 2x LightCycler 480 Sonde Maestro, e 20 micron avanti e indietro primer.

4. Conversione in condizioni GMP-grade

1. Il primo giorno di transizione i hiPSCs post- asportato verso condizioni di GMP-grade, fare una miscela di mezzi composto da PSC umana combinata multimediali 1 (i media combinata 1) e di grado clinico buone pratiche di fabbricazione (GMP) di media compatibile (supporti combinate 2 ) ad un rapporto di 80:20.
2. Aspirare off i vecchi media combinato 1 e collocare 3 ml di nuovi media combinati 1 e 2, pre-riscaldato, al rapporto di 80:20. Cambiare i media al giorno per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
3. Il giorno 4, rendere il supporto combinato 1 e 2 con un rapporto 50:50. Aspirare il vecchio media e soste con i media pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 al rapporto di 50:50. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
4. Il giorno 7, rendere i media combinata 1 e 2 con un rapporto 20:80. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinati 1 e 2 al rapporto di 20:80. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
5. Il giorno 10, effettuare i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Cambiare media ogni giorno a questo rapporto specifico. Le cellule sono ora in media liberi-xeno completamente definito. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   NOTA: Durante l'intero processo di conversione, è necessario passaging routine con un ago calibro 18 per mantenere la giusta dimensione delle colonie e la densità. Piano su passaging cellule ogni 4 o 5 giorni sulla base della dimensione delle colonie, confluenza, e differenziazione.
6. Coat un pozzetto in una piastra a sei pozzetti con un substrato senza xeno definito come raccomandato dal produttore.
7. Passaggio meccanicamente un confluente bene, già convertito in-Xeno gratuita condizioni di media, da una piastra di sei bene con un ago 18-gauge. È importante sottolineare che, posizionare nuovi media (supporti combinati 2) sulle cellule con un inibitore ROCK 1x per 1 ora, prima passaging pre-condizione di media.
8. Aspirare la soluzione substrato sintetico largo della nuova piastra che le cellule vengono trasferiti. Rimuovere tutti i supporti contenenti i grumi di cellule staminali dal vecchio piatto e trasferimento a nuova piastra.
9. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 2 giorni con il minimo disturbo fisico (idealmente piatti, una volta all'interno dell'incubatrice, non sono direttamente toccati in alcun modo) per una massima attaccamento.
   NOTA: Le cellule richiederanno cambiamenti di media al giorno. Passagin continuag ogni 4 giorni saranno importanti. Utilizzando un ago 21-gauge, passaggio solo le parti di colonie con ottima morfologia ESC-like (elevato rapporto nucleocytoplasmic). Ciò garantirà la selezione per le colonie hiPSC corretto che crescerà bene e alla fine produrranno colonie omogenee. Tempo complessivo di derivazione del CES come colonie è tra 15-20 giorni dopo il cambio di supporto iniziale combinato.
10. Congelare le hiPSCs post- asportato GMP-grade per primo tratteggio incrociato tutte le colonie utilizzando un ago calibro 18. Sollevare tutte le parti fuori utilizzando una pipetta 200 microlitri e trasferire tutti i supporti contenenti le cellule ad una fiala conica 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
11. Mentre le cellule sono centrifugazione, fare un supporto congelamento costituito da volumi uguali di supporto combinato freddo 2 e congelamento media con una concentrazione finale di DMSO del 7,5%.
12. Dopo le cellule sono pellettizzati, aspirare off vecchia medio e goccia a goccia risospendere il pellet con i media di congelamento. Immediatamente transfer di fiale congelamento e mettere in un -80 ° C freezer.

5. hiPSCs Characterizing GMP-grade Post-asportati

1. Per garantire una corretta espressione dei marcatori pluripotenza post-conversione, utilizzare QPCR per quantificare l'espressione di marcatori pluripotenza chiave (SOX2, OCT4, e Nanog) utilizzando i primer elencati nella tabella 1 con la stessa procedura di cui al punto 3. metodologie QPCR seguire la stessi passaggi elencati al punto 3.
2. Utilizzare citometria a flusso per rilevare l'acido non umano sialico Neu5Gc (N acido -glycolylneuraminic) in base a condizioni standard elencati nel kit come precedentemente pubblicato ^10.
3. Lavare delicatamente le piastre di coltura cellulare con cellule utilizzando PBS 1x (PBS).
4. Dissociate colonie utilizzando 1x reagente di dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.
5. Durante il tempo di incubazione di 5 minuti di passo 5.4, preparare la soluzione di blocco (disponibile inkit) facendo un 0,5% agente di blocco in ghiacciata PBS.
6. Etichettare la seguente serie di tubi per citometria a flusso di analisi: senza macchia; 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) DAPI; Controllo anticorpo 1: 200; Anticorpo primario 1: 200; Anticorpo secondario 1: 200 Donkey Anti-Pollo IgG (H + L); MEF campione; Cellule post-asportato esempio a matrice; e celle su supporto sintetico Campione post-asportato.
7. Scuotendo leggermente aggregati di cellule dal punto 5.4 con l'aggiunta di 2 ml di soluzione bloccante e trasferire il contenuto di un tubo da 15 ml. Centrifugare a 80 xg per 5 minuti a 4 ° C.
8. Lavare le cellule due volte con soluzione bloccante e centrifugare come indicato al punto 5.7.
9. Delicatamente risospendere circa 1 x 10 ⁶ cellule in 100 microlitri di soluzione bloccante con il corrispondente volume di diluizione di ciascun anticorpo. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C per 1 ora.
10. Ripetere lava tre volte al punto 5.8.
11. Risospendere il pellet cellulare in 400 ml di diluente Buffer (dal kit) con 1: 100 di DAPI per tubi 2, 6, 7, e 8 come elencato passo 5.6.
12. Cellule filtrare con un colino 40 micron e attraversano citofluorimetro.

Risultati

Vi presentiamo un protocollo per derivare clinico-grade hiPSCs senza fattore utilizzando l'approccio basato riprogrammazione-lentivirali STEMCCA. La figura 1A mostra un quadro rappresentativo di tre diverse linee di pre-asportato hiPSC, dopo la riprogrammazione con l'approccio STEMCCA su uno strato di MEF. Il vantaggio principale del metodo riprogrammazione STEMCCA risiede nel successo riprogrammazione coerente ottenuto da più scienziati, in diversi gruppi di ricerca e posizioni. Figura...

Discussione

Descriviamo una metodologia di derivazione hiPSCs senza fattore e renderli clinicamente rilevante convertendo queste cellule in condizioni GMP-grade per la differenziazione delle cellule a valle in future terapie umane. Sebbene questo protocollo è ampiamente applicabile ad una varietà di tipi cellulari, abbiamo scelto di riprogrammare fibroblasti dermici umani, a causa della facilità di estrazione dal paziente e la loro applicabilità alle terapie umane personalizzati. Una volta che le limitazioni sono state sanate, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media)	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11330057
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x	Invitrogen	11140050
Glutamax, 100x	Invitrogen	35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x	Invitrogen	15140-122	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5%	Invitrogen	15400-054	Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor	GlobalStem (Rockville, MD, USA)	GSR-2001	Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol	Millipore (Billerica, MA, USA)	ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix)	BD Biosciences (San Jose, CA, USA)	356231	Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)	Invitrogen	A1014201
Stemmolecule Y27632	Stemgent (Cambridge, MA, USA)	04-0012-02
Puromycin	Invitrogen	A1113802
LightCycler 480 Probes Master	Roche (Basel, Switzerland)	4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium	Lonza (Basel, Switzerland)	12-769E
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
PBS	Invitrogen	14190-250
100 BP DNA Ladder	Invitrogen	15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x	Invitrogen	S33102
Agarose	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)	161-3101
Gelatin, from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1	StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)	5850	Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin	InvivoGen (San Diego, CA, USA)	ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)	Invitrogen	A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488	Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)	703-546-155
Polybrene/transfection agent	Millipore	TR-1003-G
Plasticware
12-well plates	VWR (West Chester, PA, USA)	29442-038
6-well plates	VWR	29442-042
10-cm plates	Sigma-Aldrich	Z688819
18-gauge needle	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	148265D
21-gauge needle	Fisher Scientific	14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer	KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software	BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)	KK2601
High Pure RNA Isolation Kit	Roche	11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit	Sialix (Newton, MA, USA)	Basic Pack
Media
Combined media 1	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2	StemCell Technologies and Stemgent		Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media			Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media			DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.