איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

Summary

מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאים סרטניים, המייצגים את סמן ביולוגי לסרטן רלוונטי פוטנציאלי. ניצול טכנולוגיה ללא תווית חיישן וקולט T-cell מחקה נוגדנים חד-שבטיים, זיהוי של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו בסרום אנושי, ופלזמה חולה הפגינה, המאפשרת פיתוח של סרטן רומן פלטפורמת אבחון.

Abstract

על פי האגודה האמריקנית לסרטן, יותר מ -200,000 נשים יאובחנו עם סרטן שד פולשני בכל שנה וכ -40,000 ימותו מהמחלה. כיתת אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA) אני דגימות פפטידים הנגזרים משפלת proteasomal של חלבונים תאיים ומציג קטעים אלה על פני התא לחקירה על ידי לימפוציטים במחזור T ציטוטוקסי (CTL). דור של לחקות קולט T-cell (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) שיכיר בסרטן השד פפטיד / HLA-ספציפי * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מגורם הגירת מקרופאג מעכב (MIF _19-27) וNY-ESO- 1 _157-165 מאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר תגובת CTL אנטי גידול יעיל. מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאי סרטן שד ומייצגים סמנים לסרטן שעשוי להיות רלוונטיים. בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לטיפול בסרטן אבחוןs שילוב קולטן תא T נוגדנים חד-שבטיים לחקות בשילוב עם רומן, biosensor ללא תווית ניצול טכנולוגיית חיישן תהודה מודרכת במצב (GMR) מוצג. איתור של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו בסרום אנושי, והפלזמה חולה הפגינה. ההשפעה על עבודה זו יכולה לחולל מהפכה ברפואה מותאמת אישית באמצעות פיתוח של אבחון מחלה נלווה עבור חיסוניים ממוקד.

Introduction

דגימות הכיתה אנטיגן אני יקוציט האדם (HLA) פפטידים של 8-11 חומצות אמינו באורך נובעות משפלת proteasomal של רפרטואר החלבון תאיים ומציג פפטידים אלה על פני השטח של כל תא גרעיני ^1,2. המורכב HLA הוא "הסמן הביולוגי של הטבע", המציין את בריאותו של כל תא (איור 1) לימפוציטים מסוג T במחזור ציטוטוקסיות (CTL). הכרה בתוצאות פפטידים מחלה קשורה בחיסול של התא הפוגע בCTL. לפיכך, התגובה החיסונית אדפטיבית היא יעילה מאוד במניעת זיהום וגידול ויראלי. עם זאת, המערכת החיסונית מפעילה לחץ אשר לעתים קרובות מקדם בחירה לאיתור וירוסים או גידול מסוגל להתחמק תגובת CTL יעילה. קולט T-cell מחקה (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) אשר מזהה פפטיד / HLA-ספציפיים * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מחלבונים הקשורים לסרטן השד, גורם מעכב הגירת מקרופאג (MIF_19-27) ³ וNY-ESO _157-165-1, לאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר אנטי גידול יעיל CTL תגובת ^4,5. עבודת נציג זה מתמקדת בHLA-A * 0201 המולקולה, אשר באה לידי ביטוי בשיעור של עד 30% מהאוכלוסייה. עם זאת, זיהוי של קומפלקסי HLA / פפטיד רלוונטיים אחרים, ואחריו את הייצור של TCRm מאפשר הפיתוח חיסוני ממוקדים ואבחון מחלה נלווית, הרחבת השירות של עבודה זו לאוכלוסייה רחבה בהרבה.

חלק ממתחמי פפטיד / HLA מחויבים לתא השטח משתחרר לפלזמה. בשל האופי המורכב ביותר של פפטיד / בריכות HLA, שיטות קיימים לכרייה immunopeptidome לסמנים ביולוגיים HLA נלווים נמצאים זמן רב. תהליך זה דורש טיהור הזיקה של HLA המסיס מפלזמה, הפרדה של פפטידים הקשורים HLA על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה שלב הפוך(RP-HPLC) ורצף הפפטיד על ידי ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) ^6,7. למרות שתהליך זה הוא אפשרות מעשית לגילוי מטרות טיפוליות חדשניות, זה תהליך מסורבל ככלי אבחון לוויה למטרות הקשורות HLA כבר בחיסון הטיפולי או הצינור ביולוגי ^8-10. TCRm מכוון נגד מטרות אלה מספקות כלים לפיתוח אבחון לוויה מהיר שנועדו stratifying חולים לניסויים קליניים רלוונטיים ולספק אפשרויות טיפוליות מושכלות יותר.

בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לאבחון הסרטן מוצגת אשר מנצלת TCRm ומערכת המבדק ללא תווית העוקבת אחר אינטראקציות ביולוגיות בצעדי עיבוד מינימאליים. מערכת המבדק ללא תווית מבוססת על שיטה, אשר מנצלת את אפקט תהודה המודרך במצב (GMR) שמתרחש בתיל מוליך גל דיאלקטרי ^11-14. כאשר אנשי קשר בפס רחב אור דיפרקטיביתצורם בלוחות דרושים למערכת זו, שני אורכי גל מסוימים באים לידי הביטוי. האינטראקציה מחייבת בין קולט משותק ויגנד הוא פיקוח בזמן אמת על ידי מעקב משמרת גל התהודה עם מנתח ספקטרום ^12. פסגות תהודה נפרדות להתרחש אירוע TE (וקטור חשמלי רגיל למטוס של שכיחות) וTM (וקטור מגנטי רגיל למטוס של שכיחות) מצבי קיטוב מתן נקודות נתונים מרובים שעלול להגדיל את דיוק זיהוי ^11,14. שימוש בצלחות מראש רגישות-נוגדן במערכת assay ללא תווית זו, זמן ריצת assay עם ניתוח הנתונים הוא כ -45 דקות. בנוסף, ניתן נחקרו דגימות חולים מרובות בפורמט 96 או 384 גם, יתרון ברור על פני פורמט המבוסס HPLC-MS / MS.

Protocol

הצהרת אתיקה: דגימות רקמה ופלזמה אנושיות זיהו-דה התקבלו מהמרכז הרפואי הנדריק תחת מועצה לביקורת מוסדית אישרה פרוטוקול.

1. תוספת של Biotinylated נוגדן

הערה: הניטור של שלב זה הוא אופציונאלי. ראה פרוטוקול חלופי אם לא ניטור.

1. להשיג צלחות נגזרות מצופה avidin זמינות מסחרי (ראה חומרים וציוד טבלה).
2. להוסיף נאגר מלוח פוספט 50 μl pH (PBS) 7.2 לבארות.
   הערה: Preincubate PBS על 28 מעלות צלזיוס כדי למזער משמרות תהודה קשורות טמפרטורה.
3. תוכנת סורק המבדק פתוחה ובצעו את אשף ההתקנה כדי להגדיר את ההליך ניסיוני הכולל מבחר של כדורי סרק, סטנדרטים ודגימות בפריסת הצלחת, הגדרת טמפרטורה (28 ° C), מספר הסריקות לדקה (1), ואורכו של הניסוי ( 150 דק 'כדי להתאים לשלבי הכנה של).
4. הכנס את צלחת assay מוכנה לסורק המבדק ללא תווית ולהתחיל בסריקה הראשונה. כאשר הסריקה הראשונה היא שלמה, בחר "התייחסות עצמית כדי להתחיל". נקודת ההתחלה היא הקבוצה הראשונית של סריקות שנאספו בתחילת הניסוי. אם זה הקריאה הראשונה בוצעה על הצלחת הספציפית הזה, לאפשר הסורק לרוץ לאזן טמפרטורה ולמנוע סחף בתחילת מחקר. ראה איור 2 לצילום מסך של בסיס ואחריו תוספת מדגם.
5. לאחר תחילת המחקר התייצבה, או לפחות 5 סריקות, להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת.
6. הסר PBS על ידי הצפת השוק בכיור ולהוסיף נוגדן biotinylated 50 RL21A μl ב[ 10 מיקרוגרם / מיליליטר בpH PBS 7.2] לכל אבל בארות שליטה על הצלחת. הוסף 50 μl PBS לבארות שליטה.
7. הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה עד שהגיעה לרוויה, כ -1.5 שעות.
8. להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת.
9. שטוף צלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם מלוח Tween פוספט שנאגרו + 0.05% 20 (PBST) ואחריו 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS pH 7.2. חזור עם PBS. הקש PBS העודף מצלחת על מגבות נייר לפני המעבר לשלב הבא.
   הערה: ניתן לבצע צעד זה על מכונת כביסה צלחת אוטומטית או לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 PBST μl על ידי השלכת נוזל לתוך כיור והחלפת PBST עם טפטפת.
10. הוסף 50 μl pH 7.2 PBS לכל הבארות הפעילים.
11. הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה לפקח תהודת פוסט-לשטוף.
12. תפסיק לקרוא ולהוציא את הצלחת.

פרוטוקול חלופי לשלב 1:

13. הוסף נוגדן biotinylated 50 RL21A μl ב[ 10 מיקרוגרם / מיליליטר PBS] לכל הבארות.
14. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 1.5 שעות או הלילה ב 4 ° C.
15. לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם אחרי PBST על ידי 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS כמו בשלב 1.9.

jove_title "> 2. תוספת של חומר אנליטי

1. הסר את PBS ולהוסיף 50 μl לכל טוב של חיץ assay המתאים. עבור assay זה, סרום אנושי רגיל זמין מסחרי שימש 01:20 מדולל PBS.
2. תוכנת סורק המבדק פתוחה ובצע את אשף ההתקנה להגדיר הליך ניסיוני.
3. הכנס את הצלחת לתוך סורק המבדק ולהתחיל בנקודת ההתחלה לקרוא. אם זה הקריאה הראשונה בוצעה על הצלחת הספציפית הזה, לאפשר הפעלת הסורק לאזן טמפרטורה ולמנוע סחף בתחילת מחקר.
4. לאחר תחילת המחקר התייצבה, או לפחות 5 סריקות, להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת.
5. הסר את חיץ assay מהבארות.
6. בקרות ספייק עם HLA * 02: 01 מונומר נושאים רלוונטי (FLSL) או פפטידים לא רלוונטיים (SLLV, YLEV, או KVL) בריכוזים הנע בין [.625-10 מיקרוגרם / מיליליטר] במאגר assay. הוסף 50 μl של סטנדרטים לבארות שליטה בצלחת
7. הוסף 50 μl של אנליטי במאגר assay לדוגמאבארות של הצלחת. עבור assay זה, ממוסמר סרום אנושי זמין מסחרי היה בשימוש.
8. הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה עד שהגיעה לרוויה, כ 30-60 דקות.
9. להשהות את הקריאה ולהוציא את הצלחת.
10. לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 200 μl / גם אחרי PBST על ידי 3 שטיפות עם 200 μl / גם PBS כמו בשלב 1.9.
11. הוסף חוצץ assay 50 μl לכל הבארות הפעילים.
12. הכנס את הצלחת בחזרה לתוך סורק המבדק ולחדש את הקריאה לפקח תהודת פוסט-לשטוף.
13. תפסיק לקרוא ולהוציא את הצלחת.
    הערה: חיץ assay יכול להיות PBS, תקשורת ותרבות רקמות, או בסרום אנושי בדילול 01:20 בPBS בהתאם למטרה של assay.

ניתוח 3. נתונים

1. לנתח באמצעות תוכנת סורק המבדק או לייצא קבצי נתונים גולמיים לתוכנת ניתוח סטטיסטית מועדפת. תוכנת סורק המבדק באופן אוטומטי את העקומה מחייבת המבוססת עלפריסת צלחת סיפקה במהלך התקנה ניסיונית.
   הערה: אם אינך משתמש בתוכנת סורק המבדק לניתוח, בצע את השלבים 3.2-3.4.
2. לחסר תחילת המחקר וביקורת שלילית מכל נקודת נתונים שלאחר מכן.
3. לחשב את הממוצע וסטיית התקן לבארות לשכפל בכל נקודת זמן.
4. צור גרף של העקומה מחייבת או נתונים נקודת סיום בחרו לגרפים בר.

תוצאות

סט נציג של ניסויים בוצע באמצעות TCRm, RL21A המאופיין היטב, נוגדן חד שבטי IgG2a עכברי שדווקא מכיר בפפטיד (MIF _19-27 או FLSL) בהקשר של HLA-A * 02: 01 מולקולה ^3. מונומר מקור פפטיד / HLA, כמו גם מונומר HLA לא רלוונטי ^15, שימש כדי להדגים את ההליך המתואר. איור 3 ממחיש את פורמט assay.

RL21A הוא ספציפי למונומר FLSL / HLA עם תגובתיות צלב קטנה עם פפטיד האחר / HLA קומפלקסי ^3. ייחוד זה סכם שימוש במערכת ללא תווית המבדק (איור 4). הרגישות של מערכת המבדק ללא תווית לצורך הניסוי הזה היא בטווח של ננו-מולר הנמוך כפי שנקבע על ידי טיטרציה של נוגדני RL21A על FLSL המשותק / מונומר HLA (איור 5). למרות שאות הרקע היא גדלה באופן משמעותי בדגימות סרום, זהזיהוי pecific של מונומר FLSL / HLA בסרום אנושי ממוסמר מושגת באיור 6 ומפל ריכוזים הוא בקלות להבחין בדוגמאות אלה. לבסוף, supernatants משורת תאי מד"א MB-231, הראה בעבר להציג את FLSL / HLA-A * 02: 01 המולקולה, מוצגים להכיל מונומר FLSL המסיס משתמש בפלטפורמה זו תווית חופשית assay (איור 7). בנוסף הבא של מונומר FLSL / HLA מגביר את האות בRL21A (איור 7). בשל הרגישות של המערכת, גם לווריאציה גם כוללים משמרות תהודה שליליות יכול להתרחש כתוצאה מתנודות טמפרטורה כפי שניתן לראות כפונקציה של סטיות תקן באיורים 4 ו -5. ניתן להפחית באופן דרמטי על ידי וריאציות אלה מראש דגירה של כל הדגימות וקורא צלחת המבדק בטמפרטורה לחרוג מעט מטמפרטורת חדר (כלומר, 28 ° C).

באיור 8, בקצרה, 96"טוב צלחות קלקר היו מצופות [10 מיקרוגרם / מיליליטר] של RL21A לשעה 2 בטמפרטורת חדר, נשטפה עם PBST, חסמה עם 0.5% חלב דל שומן, לשטוף עם PBST, וטופחו במשך 2 שעות בטמפרטורת חדר עם דילולים סדרתי של מונומר FLSL HLA בסרום אנושי רגיל מדולל 1:10 ב PBS כדי ליצור עקומה סטנדרטית או פלזמה מטופל בדילול 1:10 ב PBS. הצלחת נשטפה עם PBST, מודגרות שעה 1 בטמפרטורת חדר עם ארנב אנטי אנושי microglobulin β2 [1: 5,000] כדי לזהות HLA שלם, ורחצתי בPBST. צלחות אז הודגרו למשך 30 דקות עם עז נגד הארנב IgG [1: 10,000] ורחצו עם PBST. זיהוי Colorimetric בוצע באמצעות ABTS (2,2'-Azinobis [חומצה 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic] מלח -diammonium) מצע עם זמן דגירה 15 דקות ונצפו ב 405 ננומטר על קורא microplate. FLSL / HLA זוהה בשלוש דגימות מטופל.

באיור 8B, RL.064 פלזמה החולה היה מדולל 01:20 בPBS ולאחר מכן להוסיףed לצלחת ופיקוח על הגלאי ללא תווית עבור 60 דקות. זיהוי ספציפי של מתחם FLSL / HLA בסרום המטופל הושג. מבחן t של הסטודנט בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p <0.05).

באיור 8C, קטעי רקמה הוכתמו ב1 מיקרוגרם / מיליליטר עם העכבר אנטי-HLA-A2 (BB7.2) כביקורת חיובית, RL21A, IgG2b וIgG2a בהתאמה בקרות שליליות. הצביעה זוהתה באמצעות ערכה אנטי עכבר זיהוי, DAB (diaminobenzadine), וQS hematoxylin מכתים גרעיני כפי שהורה על ידי היצרן. צביעה של רקמת גידול על ידי RL21A מאשרת מצגת של קומפלקסי FLSL / HLA.

איור 1:. מצגת אנטיגן סרטנית על ידי אנטיגן ויקוציטים האנושי אני כיתת שינוי סרטני הוא הפרעה תוך-תאית. intracellul מדגם HLAחלבוני ar ולגלות שינויים הקשורים לסרטן על פני התא. CTL וTCRm מסוגל לזהות תאים סרטניים באמצעות מתחמי HLA-פפטיד ברורים לתאים אלה.

איור 2:. צילום מסך של רכישת נתונים בתוכנת סורק המבדק דוגמא של רכישת נתונים המציגה את הבסיס הראשוני סריקה ואחריו תוספת נוגדני RL21A לצלחת מצופה 10 מיקרוגרם / מיליליטר של מורכב FLSL / HLA. ריכוזים של נוגדנים הם ציינו. כל שורה מייצגת בודד פיקוח טוב לאורך זמן.

איור 3:. פורמט Assay איור של נוגדנים משותק על פני השטח צורמים דיפרקטיבית של rel צלחת assay הלכידהפפטיד evant / מתחמי HLA בפתרון.

איור 4: ספציפי של RL21A לFLSL / HLA מורכב הפגנה של הספציפיות של TCRm RL21A biotinylated למונומר הרלוונטי HLA (FLSL) בהשוואה למונומר לא רלוונטי HLA (YLEV, SLLV, וKVL).. Biotinylated RL21A TCRm [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay avidin מצופים וזיהוי בוצע באמצעות מונומר ללא תווית רלוונטית או לא רלוונטי HLA [10 מיקרוגרם / מיליליטר] בPBS. RL21A היה ספציפי לקומפלקס FLSL / HLA. דו-כיווני ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p <0.001).

איור 5:. כריכת רגישות של RL21A לפפטיד / המורכב HLA המקור שלה איור של detectiעל גבול ומחייב רגישות של RL21A למתחם FLSL / HLA. Biotinylated HLA מונומר FLSL [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay וRL21A ללא תווית התווסף לצלחת בדילולים סידוריים בPBS כפי שצוין. זיהוי עבור מערכת זו היה בטווח של ננו-מולר הנמוך.

איור 6: איתור של מתחמי HLA בממוסמר אדם סרום הפגנה של זיהוי של HLA בסרום אדם.. Biotinylated RL21A TCRm [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על פני השטח צלחת assay avidin המצופים. סרום אדם נורמלי ונקווה ממוסמרים עם רלוונטי (FLSL) או מונומר HLA לא רלוונטי (SLLV) היה מדולל 01:20 בPBS ולאחר מכן הוסיף לצלחת ופיקוח על הגלאי ללא תווית עבור 60 דקות. זיהוי ספציפי של מתחם FLSL / HLA בסרום אנושי הושג. באופן כללי, אות רקע (מונומר SLLV לא רלוונטי) היא גבוהה אה לדגימות סרום מדוללים בהשוואה לanalytes מטוהר בPBS (ראה איור 4). דו-כיווני ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p <0.0001).

איור 7:. מתחמי HLA מסיסים אותרו בsupernatants תרבית תאי סרטן שד היכולת לזהות HLA בsupernatants שד התא סרטני הוא הוכיח. Biotinylated RL21A TCRm, RL9A TCRm (בקרה שלילית), ושליטת אלוטיפ היו משותקות על פני השטח צלחת assay. ממוסמר [5 מיקרוגרם / מיליליטר] וsupernatants תרבית תאי unspiked מד"א-231 נוספו וכריכה היה במעקב במשך 60 דקות על הגלאי ללא תווית. FLSL ומונומר SLLV HLA ממוסמר דגימות מייצגות בקרות חיוביות לRL9A וRL21A מחייב. כיוון אחד ANOVA בוצע באמצעות תוכנת גרפים ונתונים סטטיסטיים (p <0.0001).

ogether.within-page = "תמיד">
איור 8:. זיהוי ספציפי של מתחמי FLSL / HLA בדגימות מטופל () אנזים מסורתי המקושר immunosorbent Assay (ELISA) נוצל כדי לזהות מתחמים ספציפיים FLSL / HLA בפלזמת מטופל. (ב) Biotinylated RL21A TCRm או IgG2a [10 מיקרוגרם / מיליליטר] היה משותק על צלחת assay avidin. (ג) רקמת גידול שד מRL.064 החולה הייתה מוכתמת כפי שתוארה לעיל ³ לאמת מצגת גידול של מתחמי FLSL / HLA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השיטה המתוארת במסמך זה מציגה מערכת הקרנת סמן ביולוגי לאבחון הסרטן שיאפשר איתור מהיר של מתחמי פפטיד / HLA מסיסים בדגימות סרום, פלזמה, שתן או רוק מטופל בתפוקה גבוהה 96 או בפורמט 384 גם. מערכת assay זה ניצול קולט תא T מחקה נוגדנים חד-שבטיים ומערכת זיהוי ללא תווית חותכת את זמן ניתוח לשעה פחות מ 1 לעומת 3.5 שעות על ידי ELISA הקונבנציונלי. גישת תפוקה גבוהה זו מאפשרת ריבוד מהיר של חולים לניסויים קליניים לחיסוני סרטן טיפוליים או תרופות ביולוגיות. שיטות קיימים לגילוי מטרות מחלה אלה דורשים טיהור זיקה וHPLC-MS / MS של דגימות מטופל, תהליך שגוזל זמן ומסורבל. למרות ששיטה זו היא נוחה לטכניקות ELISA קונבנציונליות, קיים חשש כי ריאגנטים זיהוי משניים כגון נוגדני microglobulin אנטי-β2 יכולים לשנות את המבנה של HL המתהווהמולקולה ומעכבות מחייבת זיהוי הגבלת TCRm. זיהוי ללא תווית מקל חששות אלה. הליך זה יכול להיות שונה לשימוש במערכות ללא תווית אחרות כגון מערכת תהודת plasmon פני השטח. עם זאת, זה יפחית באופן משמעותי את יכולות התפוקה גבוהות יותר בהשוואה למערכת המבדק שימשה במחקר זה.

פרוטוקול זה יכול להיות שונה באופן יעיל לגילוי של סמנים ביולוגיים שאינו HLA בסרום ופלזמה חולה עם דבקות בכמה שלבים קריטיים. ניטור של תהליך ציפוי נוגדן הראשוני מומלץ לאופטימיזציה של פני השטח, כמו <משמרת 200 בערב צפוי לגרום לאות נמוכה לצעד זיהוי שלאחר מכן. קוראים תחילת המחקר ולאחר שטיפה-שימושיים לניתוח נקודת הסיום כשפע של חלבונים בסרום עלול להסוות מחייב של אנליטי ריכוז נמוך. לבסוף, שינויי הטמפרטורה של דגימות יכולות לגרום גם וריאציה גם ל. מומלץ כי כל הדגימות מראש מודגרותד בקר טמפרטורת יחידת biosassay ללא תווית להיות מוגדר ב2-3 מעלות צלזיוס מעל לטמפרטורת חדר. יש לאפשר דגימות בקירור מספיק זמן כדי להגיע לטמפרטורת ההפעלה.

שינויים עתידיים של פרוטוקול זה יכללו ריבוב של TCRm על פני השטח הצלחת. מערכת המבדק היא כיום מקובל תצפית של בארות בצפיפות של לפחות 8-Plex. על ידי החדרת 4-8 TCRm היטב כל אחד, בכל כרכי מדגם בדיקה מופחתים ומאפשר איסוף נתונים מורכבים יותר ויותר למטופל. יכולת זו יכולה עוד ליידע את החולים לגבי אפשרויות טיפוליות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description (optional)
ResoSens Label-free Bioassay Detection System	Resonant Sensors Incorporated
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates	Resonant Sensors Incorporated
ResoVu software	Resonant Sensors Incorporated
RL21A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
RL9A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: KVLEYVIKV
Pooled Normal Human Serum	ThermoFisher	BP2657100
MDA-MB-231 Cell Supernatant	ATCC	HTB-26	Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-053
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-63
Sodium Hydroxide	ThermoFisher	5318-1
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	BP665-1
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)	ThermoFisher	BP337-500
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)	ThermoFisher	37615
rabbit anti-human β2 microglobulin	Dako	A0072
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	111-035-144
Nunc  microplates	ThermoFisher	439454
Synergy 2 microplate reader	Biotek
Immpress Reagent Kit	Vector	MP-7402
Immpact DAB	Vector	SK-4105
Hematoxylin QS	Vector	H3403
IgG2a	MP BioMedicals	50328
IgG2b	MP BioMedicals	50330
anti-HLA-A2 (BB7.2)	Experimmune
Prism 5	Graphpad