Обнаружение человека антиген лейкоцитов биомаркеров при раке молочной железы Используя без наклеек технологии биосенсоров

Резюме

Интактные HLA класса I / пептидные комплексы пролить раковыми клетками, представляя собой потенциальную соответствующую биомаркеров рака. Использование без наклеек технологии датчика и T-клеточный рецептор, имитирующего моноклональных антител, определение пролитой MIF / HLA-A * 02: 01 комплексов в клеточных супернатантах MDA-MB-231, с шипами человеческую сыворотку, и плазма пациента показал,, что позволяет развитие Рак роман диагностическая платформа.

Аннотация

По данным Американского общества рака, более чем 200 000 женщин будет диагностирован инвазивный рак молочной железы каждый год, и примерно 40 000 умрут от болезни. Образцы класса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) I пептидов, полученных из протеасомной деградации клеточных белков и представляет эти фрагменты на клеточной поверхности для допроса циркулирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Генерация T-клеточного рецептора мимике (TCRM) моноклональные антитела (моноклональные антитела), которые распознают рак молочной железы особый пептид, / HLA-A * 02: 01 комплексы, такие как те, которые получены от миграции макрофагов фактор, ингибирующий (MIF _19-27) и Нью-Йорк-ESO- 1 _157-165 включить обнаружение и уничтожение раковых клеток молочной железы при отсутствии эффективных мер в ответ CTL анти-опухоли. Интактные HLA класса I / пептидные комплексы пролить раковыми клетками молочной железы и представляют потенциально подходящих биомаркеров рака. В этой работе, в системы скрининга прорыв биомаркеров для диагностики ракаы включения T-рецептором клеточной мимические моноклональных антител в сочетании с новым, без наклеек биосенсора с использованием руководствоваться режиме резонанса (ГМР) сенсорная технология представлена. Обнаружение пролитой MIF / HLA-A * 02: 01 комплексов в клеточных супернатантах MDA-MB-231, с шипами человеческую сыворотку, а в плазме пациент продемонстрировал. Влияние этой работы может революционизировать персонализированной медицины через развитие диагностики заболеваний компаньон для целевых иммунотерапии.

Введение

На образцах класса I человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) пептиды 8-11 аминокислот в длину, полученных от деградации протеосомной внутриклеточного белка репертуара и представляет эти пептиды на поверхности каждой клетки зародышевого ^1,2. HLA комплекс "биомаркер природы", что указывает на состояние здоровья каждой ячейки (фиг.1) с циркулирующим цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Признание болезней, связанных пептидов приводит к ликвидации нарушителя клетку CTL. Таким образом, адаптивный иммунный ответ является высокоэффективным на устранение вирусной инфекции и опухоли. Тем не менее, иммунная система оказывает давление, которое часто способствует выбор на наличие вирусов или опухоли, способных в уклонении от эффективного реагирования CTL. Т-клеточный рецептор (имитируя TCRM) моноклональные антитела (моноклональные антитела), которые распознают специфические пептид / HLA-A * 02: 01 комплексы, такие как соли, полученные из рака молочной железы, связанных белков, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF_19-27) ³ и NY-ESO-1 _157-165, включите обнаружения и уничтожения раковых клеток молочной железы при отсутствии эффективного противоопухолевого CTL ответ ^4,5. Этот представитель работа направлена ​​на HLA-A * 0201 молекулой, которая выражается до 30% населения. Тем не менее, определение других соответствующих HLA / пептид, с последующим производством TCRM позволяет разрабатывать целевые иммунотерапии и диагностики спутником заболевания, расширяя полезность этой работы в гораздо более широкие слои населения.

Часть пептида / HLA комплексов, связанных на поверхности клетки высвобождается в плазму. Из-за высокой степени сложности пептид / HLA бассейнов, современных методов для минирования immunopeptidome для HLA, связанных биомаркеров времени. Этот процесс требует аффинной очистки растворимого HLA из плазмы, разделение HLA связанных пептидов с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления(ОФ-ВЭЖХ) и пептид, последовательность с тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) ^6,7. Хотя этот процесс является жизнеспособным вариантом для открытия новых терапевтических мишеней, это трудоемкий процесс в качестве инструмента компаньона диагностики для HLA соответствующими задачами уже в терапевтической вакцины или биофармацевтической трубопровода ^8-10. TCRM направлены против этих целей предоставить средства для быстрого диагностического развития компаньона, направленные на стратификации пациентов в соответствующие клинические испытания и обеспечить более обоснованные терапевтические возможности.

В этой работе, Система скрининга прорыв биомаркеров для диагностики рака представляется, которая использует TCRM и системы биопроб без наклеек, которая контролирует биологические взаимодействия с минимальными этапов обработки. Система биоанализ без наклеек основан на методе, который использует руководствоваться режиме резонанса (ГМР) эффект, который возникает в диэлектрических волноводов решеток ^11-14. Когда широкополосного излучения контакты дифракционныхрешетка в пластинах, необходимых для этой системы, два конкретных длин волн отражается. Связывание взаимодействие между иммобилизованным рецептором и его лигандом контролируется в режиме реального времени отслеживать сдвиг длины волны резонансной с анализатором спектра ^12. Отдельные резонансные пики возникают на падающей TE (электрического вектора нормали к плоскости падения) и ТМ (магнитный вектор нормали к плоскости падения) поляризационных состояний, обеспечивающих несколько точек данных, которые могут потенциально увеличить точность обнаружения ^11,14. Использование антител предварительно сенсибилизированных плиты в этом этикетки без тест-системы, время анализа выполнения с анализом данных составляет примерно 45 мин. Кроме того, несколько образцов пациентов могут быть допрошены в формате 96- или 384-луночного, явное преимущество над основанной формате ВЭЖХ-МС / МС.

протокол

Этика заявление: обезличенной ткани и образцы плазмы человека были получены от Хендрика медицинский центр под наблюдательного совета институциональной утвержден протокол.

1. Добавление биотинилированным антителом

ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг этого шага является обязательным. См альтернативный протокол, если не мониторинг.

1. Получить коммерчески доступные авидин производные покрытием пластин (см Материалы и оборудование таблицу).
2. Добавить 50 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) рН 7,2 в лунки.
   Примечание: Preincubate PBS при 28 ° С, чтобы свести к минимуму температурные сдвиги, связанные с резонансными.
3. Открытое программное обеспечение биоанализ сканера и следуйте инструкциям мастера, чтобы определить экспериментальную процедуру, которая включает в себя выбор заготовок, стандартов и образцов в макете пластины, установка температуры (28 ° C), количество сканирований в мин (1), и длина эксперимента ( 150 мин для размещения препаративных шагов).
4. Введите подготовленный планшет для анализа в этикетку бесплатно биотестирования сканера и начать первое сканирование. Когда первое сканирование завершено, выберите "само ссылку, чтобы начать". Исходные является первоначальный набор сканирования, собранных в начале эксперимента. Если это первый чтения выполняются на этой конкретной пластины, позволяет запускать сканер, чтобы уравновесить температуру и устранить дрейф в базовой линии. На рисунке 2 скриншота исходных условий с последующим добавления образца.
5. После базовый уровень стабилизируется, или, по крайней мере, 5 сканы, приостановить чтение и извлечение пластины.
6. Удалить PBS путем сброса в раковине и добавить 50 мкл биотинилированных антител RL21A в [10 мкг / мл в PBS, рН 7,2] на всех, кроме контрольных лунок в планшете. Добавить 50 мкл PBS, чтобы контрольных лунках.
7. Вставьте пластину обратно в биопроб сканера и возобновить чтение до насыщения достигается, примерно 1,5 ч.
8. Пауза чтения и извлечения пластинки.
9. Вымойте Пластина 3 раза 200 мкл / лунку фосфатно-солевой буфер + 0,05% Tween 20 (PBST) с последующим 3 полоскания с 200 мкл / лунку PBS, рН 7,2. Повторите с PBS. Нажмите избыток PBS с плиты на бумажных полотенцах до переезда к следующему шагу.
   Примечание: Этот шаг может быть выполнена на автоматической пластины шайбой или мыть пластины 3 раза 200 мкл PBST путем сброса жидкости в раковину и замены PBST с помощью пипетки.
10. Добавить 50 мкл PBS рН 7,2 для всех действующих скважин.
11. Вставьте пластину обратно в биопроб сканера и возобновить чтение для мониторинга пост-стирки резонанс.
12. Остановить чтения и извлечения пластинки.

Альтернативная протокол Шаг 1:

13. Добавить 50 мкл биотинилированных антител RL21A в [10 мкг / мл PBS] во все лунки.
14. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1,5 ч или в течение ночи при 4 ° С.
15. Промыть пластины 3 раза 200 мкл / лунку с последующим PBST 3 полоскания с 200 мкл / лунку PBS, как на стадии 1.9.

jove_title "> 2. Добавление аналита

1. Снимите PBS и добавить 50 мкл на лунку соответствующего буфера для анализа. Для этого анализа был использован коммерчески доступный нормальный человеческий сывороточный разбавленный 1:20 в PBS.
2. Открытое программное обеспечение биоанализ сканера и следуйте инструкциям мастера, чтобы определить экспериментальную процедуру.
3. Вставьте пластину в биопроб сканера и начать базовый читать. Если это первый чтения выполняются на этой конкретной пластины, сканером проход, чтобы уравновесить температуру и устранить дрейф в базовой линии.
4. После базовый уровень стабилизируется, или, по крайней мере, 5 сканы, приостановить чтение и извлечение пластины.
5. Удалить буфере для анализа из лунок.
6. Контроль иглы с HLA * 02: 01 мономера, содержащего соответствующую (FLSL) или независимо (SLLV, YLEV или КВЛ) пептиды в концентрациях от [0.625-10 мкг / мл] в буфере для анализа. Добавить 50 мкл стандартов, контрольных лунках планшета
7. Добавить 50 мкл анализируемого вещества в буфере для анализа к образцулунки планшета. Для этого анализа, с шипами был использован коммерчески доступный человеческий сывороточный.
8. Вставьте пластину обратно в биопроб сканера и возобновить чтение до насыщения достигается, примерно 30-60 мин.
9. Пауза чтения и извлечения пластинки.
10. Промыть пластины 3 раза 200 мкл / лунку с последующим PBST 3 полоскания с 200 мкл / лунку PBS, как на стадии 1.9.
11. Добавить 50 мкл буфера для анализа всех действующих скважин.
12. Вставьте пластину обратно в биопроб сканера и возобновить чтение для мониторинга пост-стирки резонанс.
13. Остановить чтения и извлечения пластинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для анализа может быть PBS, культуры тканей СМИ, или человеческий сывороточный разбавляют 1:20 в PBS в зависимости от цели анализа.

3. Анализ данных

1. Анализ с помощью программного обеспечения биоанализ сканера или экспорта файлов исходных данных по привилегированным программного обеспечения статистического анализа. Программное обеспечение биоанализа сканер автоматически генерирует кривую связывания, основанный нарасположение пластина при условии, во время экспериментальной установки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не используете программное обеспечение биопроб сканера для анализа, выполните шаги 3.2-3.4.
2. Вычтите базовый и отрицательный контроль от каждой последующей точки данных.
3. Рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение для повторных скважин в каждый момент времени.
4. Создать график кривую связывания или выбрать данные конечных точек для гистограммы.

Результаты

Представитель серия экспериментов была выполнена с использованием хорошо известных TCRM, RL21A, мышиного IgG2a моноклональное антитело, которое специфически распознает пептид (MIF _19-27 или FLSL) в контексте HLA-A * 02: 01 молекула ^3. Родственный пептид / HLA мономера, а также значения HLA мономера ^15, был использован, чтобы продемонстрировать описанную процедуру. Рисунок 3 иллюстрирует формат анализа.

RL21A является специфическим для FLSL / HLA мономера с небольшим перекрестной реактивности с другими пептид / HLA комплексов ^3. Эта специфика воспроизводятся с помощью метки-свободная система биопроб (рисунок 4). Чувствительность метки, свободное биотестирования системы для этого эксперимента в низком диапазоне наномолярном как определено путем титрования RL21A антитела иммобилизованных FLSL / HLA мономера (рисунок 5). Несмотря на то, фоновый сигнал значительно увеличивается в образцах сыворотки, SОбнаружение pecific из FLSL / HLA мономера в игольчатым сыворотке крови человека достигается на рисунке 6 и градиент концентрации легко различимы в этих образцах. Наконец, супернатанты из клеточной линии MDA-MB-231, ранее было показано, чтобы представить FLSL / HLA-A * 02: 01 молекулу, показаны содержать растворимый FLSL мономера с помощью этого ярлыка свободной пробе платформу (фиг.7). Последующее добавление FLSL / HLA мономера увеличивает сигнал на RL21A (рисунок 7). Из-за чувствительности системы, а также к изменению в том числе отрицательных резонансных сдвигов может произойти в результате колебаний температуры, как показано в виде функции стандартных отклонений на фиг.4 и 5. Эти изменения могут быть значительно сокращены путем предварительной инкубации всех образцов и биопроб планшет-ридере при температуре в небольшом избытке комнатной температуре (то есть, 28 ° C).

На рисунке 8, кратко, 96Ну полистирола планшеты покрывали [10 мкг / мл] в RL21A в течение 2 ч при комнатной температуре, промывают PBST, блокировали 0,5% обезжиренным молоком, промывают PBST и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с серийными разведениями FLSL HLA мономера в нормальной человеческой сыворотки разводили 1:10 в PBS, чтобы генерировать стандартную кривую или плазмы пациента разводили 1:10 в PBS. Планшет промывали PBST, инкубировали 1 ч при комнатной температуре с кроличьим анти-человеческого β2 микроглобулина [1: 5000] для обнаружения интактный антиген HLA, и промывали в PBST. Планшеты затем инкубировали в течение 30 мин с козьим анти-кроличьего IgG [1: 10000] и промывали PBST. Колориметрические обнаружения проводили с использованием ABTS (2,2'-Azinobis [3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты] -diammonium соль) субстрат с 15 мин времени инкубации и наблюдали при 405 нм на микропланшет-ридера. FLSL / HLA была обнаружена в трех образцах пациентов.

На рисунке 8B, пациент плазмы RL.064 разбавляют 1:20 в PBS, а затем добавитьред к пластине и мониторинг на детекторе этикетки свободной в течение 60 мин. Удельный обнаружение FLSL / HLA комплекса в сыворотке пациента была выполнена. Критерий Стьюдента проводили с использованием графиков и статистики программное обеспечение (р <0,05).

На фиг 8С, тканевые срезы окрашивали в 1 мкг / мл с мышью анти-HLA-A2 (BB7.2) в качестве положительного контроля, RL21A, IgG2b и IgG2a соответственно в качестве отрицательных контролей. Окрашивание было обнаружено при помощи набора антимышиного обнаружения, DAB (diaminobenzadine), и гематоксилином QS ядерного окрашивания в соответствии с указаниями производителя. Окрашивание ткани опухоли по RL21A подтверждает представление FLSL / HLA комплексов.

Рисунок 1:. Опухолевый антиген презентация класса I человека антиген лейкоцитов раковой трансформации является внутриклеточным расстройство. HLA образец intracellulAR белки и выявить, связанных с раком изменения на поверхности клетки. CTL и TCRM способны распознавать раковые клетки с помощью HLA-пептид, комплексов различных тем клеток.

Рисунок 2:. Пример экрана сбора данных в программном обеспечении сканера биоанализа Пример получения данных показывает начальное базовое сканирование с последующим RL21A антитела дополнение к чашке, покрытой 10 мкг / мл FLSL / HLA комплекса. Концентрации антител являются, как указано. Каждая строка представляет индивидуальный хорошо контролируется с течением времени.

Рисунок 3:. Анализ формат Иллюстрация антител, иммобилизованных на дифракционной решетки поверхности планшету захвата отнЭвант пептид / HLA комплексов в растворе.

Рисунок 4: Специфика RL21A для FLSL / HLA комплекс Демонстрация специфики биотинилированного RL21A TCRM для его соответствующей (FLSL) HLA мономера по сравнению с неактуальной HLA мономера (YLEV, SLLV и КВЛ).. Биотинилированных RL21A TCRM [10 мкг / мл] был иммобилизован на покрытых авидином анализа поверхности пластины и обнаружение проводили с использованием немеченного соответствующую или ненужную HLA мономера [10 мкг / мл] в PBS. RL21A конкретно для FLSL / HLA комплекса. Двусторонняя ANOVA проводили с использованием графиков и статистики программное обеспечение (р <0,001).

Рисунок 5:. Связывание чувствительность RL21A к родственным пептид / HLA комплекса Иллюстрация Детективна пределе и связывания чувствительность RL21A к FLSL / HLA комплекса. Биотинилированных HLA Мономер FLSL [10 мкг / мл] был иммобилизован на поверхности аналитического планшета, и немеченого RL21A был добавлен к пластине в серийных разведений в PBS, как указано. Обнаружение этой системы было в диапазоне низких наномолярной.

Рисунок 6: Определение HLA Комплексы в Spiked человеческой сыворотки Демонстрация обнаружения HLA в сыворотке крови человека.. Биотинилированных RL21A TCRM [10 мкг / мл] был иммобилизован на покрытых авидином анализа поверхности пластины. Объединенные нормальной человеческой сыворотки, обогащенный соответствующего (FLSL) или не относящихся к делу (SLLV) HLA мономера разводили 1:20 в PBS, а затем добавляли в планшет и мониторинг на детекторе этикетки свободной в течение 60 мин. Удельный обнаружение FLSL / HLA комплекса в сыворотке крови человека была выполнена. В общем, фоновый сигнал (значения SLLV мономера) является высокимэ для разбавленных образцов сыворотки по сравнению с очищенными аналитов в PBS (рисунок 4). Двусторонняя ANOVA проводили с использованием графиков и статистики программное обеспечение (р <0,0001).

Рис. 7: Растворимые HLA комплексы были обнаружены при раке молочной железы супернатанте культуры клеток Способность обнаруживать HLA в молочной супернатантах клеток рака показано. Биотинилированных RL21A TCRM, RL9A TCRM (отрицательный контроль) и контроль изотипа иммобилизовали на поверхности аналитического планшета. Добавляли шипами [5 мкг / мл] и unspiked MDA-231 супернатанте культуры клеток и связывание контролировали в течение 60 мин на детектор этикеток свободной. FLSL и SLLV HLA мономер шипами образцы представляют положительные элементы управления для RL9A и RL21A обязательными. Односторонний ANOVA проводили с использованием графиков и статистики программное обеспечение (р <0,0001).

Рисунок 8:. Специфической детекции FLSL / HLA комплексов в образцах пациентов (А) Традиционный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), был использован для обнаружения FLSL / HLA специфические комплексы в плазме пациента. (В) биотинилированных RL21A TCRM или IgG2a [10 мкг / мл] иммобилизовали на авидин аналитического планшета. (C) опухоль молочной железы из тканей RL.064 пациента окрашивали, как описано ранее ³ проверить презентацию опухоли FLSL / HLA комплексов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Способ, описанный здесь, представляет собой систему отбора биомаркеров для диагностики рака, которые позволили бы быстрое обнаружение растворимых пептид / HLA комплексов у пациента сыворотка, плазма, моча или слюна образцов в высокой пропускной 96- или 384-формата также. Эта система анализа с использованием Т-клеточный рецептор, имитирующего моноклональные антитела и систему обнаружения метки, свободной сокращает время анализа менее 1 ч по сравнению с 3,5 ч по обычной ELISA. Эта высокая пропускная подход позволяет быстро стратификации пациентов в клинических испытаниях в терапевтических противоопухолевых вакцин или биофармацевтических препаратов. Современные методы обнаружения этих целей заболевания требуют аффинной очистки и ВЭЖХ-МС / МС отдельных образцов пациентов, громоздкой и длительный процесс. Хотя этот метод поддается обычным методам ИФА, есть опасения, что вторичные реагенты для детекции, таких как микроглобулина антитела анти-β2 может изменить структуру зарождающейся HLМолекула и ингибируют связывание с предельной обнаружения TCRM. Этикетка без обнаружения позволяет устранить эти проблемы. Эта процедура может быть модифицирована для использования в других системах, свободных меток, таких как поверхностного плазмонного резонанса системы. Тем не менее, это было бы значительно уменьшить высшие возможности пропускной сравнению с системой биопроб, используемого в этом исследовании.

Этот протокол может быть эффективно изменена для обнаружения не-HLA биомаркеров в сыворотке пациента и плазмы с соблюдением нескольких критических этапов. Мониторинг процесса первоначального покрытия антитела рекомендуется для оптимизации поверхности, как <200 мкм сдвиг, скорее всего, приведет к низким уровнем сигнала на последующей стадии обнаружения. Исходные и после промывки считывает полезны для анализа конечных точек, как обилие сывороточных белков может маскировать связывание низкой концентрации анализируемого вещества. И, наконец, изменение температуры образцов может привести к так, чтобы также вариации. Рекомендуется, чтобы все образцы предварительно инкубировалид метка свободный biosassay блок управления температурой быть установлен на 2-3 ° С выше комнатной температуры. Холодильные образцы должны быть разрешены достаточно времени, чтобы добраться до рабочей температуры.

Будущие модификации этого протокола будет включать в себя мультиплексирование TCRM на поверхности пластины. Система биоанализ в настоящее время поддаются кровянистые выделения из скважин на плотность, по меньшей мере, 8-Plex. Вводя 4-8 TCRM в каждую лунку, за объемов образцов тестирования сокращается, и позволяют собрать более сложных данных на пациента. Эта возможность может еще информировать пациентов в связи с терапевтических возможностей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description (optional)
ResoSens Label-free Bioassay Detection System	Resonant Sensors Incorporated
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates	Resonant Sensors Incorporated
ResoVu software	Resonant Sensors Incorporated
RL21A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
RL9A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: KVLEYVIKV
Pooled Normal Human Serum	ThermoFisher	BP2657100
MDA-MB-231 Cell Supernatant	ATCC	HTB-26	Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-053
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-63
Sodium Hydroxide	ThermoFisher	5318-1
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	BP665-1
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)	ThermoFisher	BP337-500
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)	ThermoFisher	37615
rabbit anti-human β2 microglobulin	Dako	A0072
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	111-035-144
Nunc  microplates	ThermoFisher	439454
Synergy 2 microplate reader	Biotek
Immpress Reagent Kit	Vector	MP-7402
Immpact DAB	Vector	SK-4105
Hematoxylin QS	Vector	H3403
IgG2a	MP BioMedicals	50328
IgG2b	MP BioMedicals	50330
anti-HLA-A2 (BB7.2)	Experimmune
Prism 5	Graphpad