Etiket-ücretsiz Biyosensör Teknolojisi kullanılması Meme Kanserinde İnsan Lökosit Antijen BİYOMARKÖRLERİN Algılama

Özet

Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri potansiyel ilgili kanser biyobelirteç temsil, kanser hücreleri tarafından dökülür. Monoklonal antikorlar, atkı aralığı MIF / HLA-A saptanmasını taklit etiketi içermeyen sensör teknolojisi ve T-hücresi reseptörü kullanmak * 02: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gelişmesine olanak gösterilmektedir Bir roman kanseri teşhis platformu.

Özet

Amerikan Kanser Derneği'ne göre, 200.000'den fazla kadın invaziv meme kanseri, her yıl teşhis edilecek ve yaklaşık 40.000 hastalıktan ölecektir. İnsan lökosit antijeni (HLA) klas I örnekleri hücresel proteinlerin proteozomal bozulması türeyen peptidleri ve sirkülasyon sitotoksik T lenfositleri (CTL) tarafından yapılan sorgulama için, hücre yüzeyi üzerinde, bu fragmanları sunulur. T-hücre reseptör Mimic nesil (TCRm) monoklonal antikorlar, meme kanseri kabul (mAb 'ler), spesifik peptit / HLA-A * 02: makrofaj göçü inhibe edici faktör (MIF _19-27) ve NY-esofago türetilenler gibi 01 kompleksler 1 _157-165 etkili bir anti-tümör CTL yanıtının yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri meme kanseri hücreleri tarafından döken ve potansiyel olarak ilgili kanser biyobelirteçleri temsil edilir. Bu çalışmada, tanı kanser için bir atılım biyobelirteci eleme sistemindeT-hücresi reseptörünü güdümlü modu rezonans (GMR) sensör teknolojisini kullanan yeni, etiket-ücretsiz biyosensör ile kombine taklit monoklonal antikorlar içeren s sunulmuştur. Atkı aralığı MIF / HLA-A * 02 Algılama: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gösterilmiştir. Bu çalışmanın etkisi hedeflenen imünoterapiler için arkadaşı hastalığı teşhis geliştirilmesi yoluyla kişiselleştirilmiş tıp devrim olabilir.

Giriş

sınıf I insan lökosit antijeni (HLA) örnekleri hücre içi protein repertuarının proteozomal bozulması türetilen uzunluğu 8-11 amino asit arasında peptidler ve her çekirdekli hücre ^1,2 yüzeyi üzerinde bu peptidleri sunulur. HLA kompleksi dolaşan sitotoksik T lenfositler (CTL), (Şekil 1), her bir hücrenin sağlık gösteren "doğanın biyomarker" dir. CTL ile kusurlu hücre ortadan kaldırılmasında hastalıkla ilişkili peptidler sonuçların tanınması. Bu nedenle, adaptif bağışıklık tepkisi, viral enfeksiyon ve tümör ortadan kaldırılması oldukça etkilidir. Ancak, bağışıklık sistemi genellikle etkili bir CTL yanıtı kaçma yeteneğine virüs veya tümör için seçimi teşvik basınç uygular. Taklit T-hücresi reseptörü (TCRm) monoklonal antikorlar, spesifik peptit / HLA-A * 02 tanır (mAb 'ler), meme kanseri ilişkili proteinler, makrofaj göçü inhibe edici faktör türetilenler gibi 01 kompleksleri (MIF_19-27) ³ ve NY-ESO-1 _157-165 CTL ^4,5 tepki etkili bir anti-tümör yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bu temsili çalışma nüfusunun% 30'a varan ile ifade edilir HLA-A * 0201 molekülü, odaklanmıştır. Ancak, TCRm üretimi takiben diğer ilgili HLA / peptit kompleksleri tanımlanması, çok daha geniş bir nüfusa bu işin programı genişleterek, hedeflenen imünoterapiler ve arkadaşı hastalığı teşhis gelişimini sağlar.

Hücre yüzeyi bağlı peptit / HLA komplekslerinin bir kısmı plazma salınır. Nedeniyle HLA ilişkili biyomarkerların için immunopeptidome madencilik için peptid / HLA havuzları, mevcut yöntemlerin son derece karmaşık doğası zaman alıcıdır. Bu işlem plazma çözünür HLA afinite saflaştırılmasını gerektirir, ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile, HLA ilişkili peptitler ayrılmasıTandem kütle spektrometrisi (MS / ^{MS), 6,7} ile (RP-HPLC) ve peptit sıralaması. Bu süreç yeni terapötik hedeflerin keşfi için uygun bir seçenek olmasına rağmen, zaten terapötik aşı veya biofarmasötik boru hattı ^8-10 HLA ilgili hedefler için bir arkadaşı tanı aracı olarak hantal bir süreçtir. Bu hedefler, ilgili klinik çalışmalarda içine hastaları stratifying ve daha bilinçli tedavi seçenekleri sunmak amacıyla hızlı arkadaşı teşhis gelişimi için araçlar temin karşı TCRm yönetti.

Bu çalışmada, kanser teşhis için bir atılım biyobelirteci tarama sistemi TCRm ve minimal işlem adımları ile biyolojik etkileşimleri izleyen bir etiket ücretsiz biyoanaliz sistemini kullanan hangi sunulmuştur. etiketsiz biyo-analizi sistemi dielektrik dalga kılavuzu ızgarası ^11-14 oluşur güdümlü modda rezonans (GMR) etkisini kullanan yöntem dayanmaktadır. Ne zaman genişbant ışığı temas difraktifBu sistem için gerekli olan levhalarda ızgara, iki özel dalga boyu yansıtılır. hareketsizleştirilmiş reseptör ve ligand arasındaki bağlanma etkileşimi bir spektrum analiz cihazı ^12, rezonans dalgaboyu kaymasını izleme gerçek zamanlı olarak izlenir. Ayrı rezonans tepeleri olay TE (geliş düzlemine dik elektrik vektörü) ve TM (insidans düzlemine normal manyetik vektör) potansiyel tespit doğruluğunu ^11,14 artırabilir çoklu veri noktalarını sağlayan polarizasyon durumları için oluşur. Bu etiket özgür deney sisteminde antikor önceden duyarlı plakaları kullanarak, veri analizi ile tahlil çalışma süresi yaklaşık 45 dakikadır. Buna ek olarak, çok sayıda hasta numuneleri HPLC-MS / MS tabanlı format üzerinden, 96 veya 384 oyuklu formatta açık bir avantaj sorgulanabilir.

Protokol

Etik deyimi: De tanımlanan insan doku ve plazma numuneleri Kurumsal Değerlendirme Kurulu altında Hendrick Tıp Merkezi'nden elde edildi protokolü onayladı.

Biyotinile Antikor 1. İlave

NOT: Bu adımda izlenmesi isteğe bağlıdır. Izleme takdirde alternatif protokolü bakınız.

1. Piyasada mevcut avidin türevi kaplı plakaları (Materyalleri ve Ekipmanları Tabloya bakınız) edinin.
2. Oyuklara 50 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7.2 ekleyin.
   NOT: 28 ° C Kuluçkalama Öncesi, PBS ısıya bağlı rezonans değişimleri en aza indirmek için.
3. Açık biyodeney tarayıcı yazılımı ve boşlukları, standartların seçimi ve örnekleri plaka düzeni, sıcaklık ayarını (28 ° C), min başına taramalarının sayısını içeren deneysel prosedür tanımlamak için Kur Sihirbazı izleyin (1), ve deney uzunluğu ( 150 dakika hazırlayıcı adımlar için karşılamak için).
4. Etiket serbest biyodeney tarayıcı içine hazırlanan tahlil plaka takın ve ilk taramayı başlatın. İlk tarama tamamlandığında, "başlatmak için kendini referansı" seçeneğini seçin. temel deneyin başlangıcında toplanan tarama başlangıç ​​kümesidir. Bu özel plaka üzerinde yapılan ilk okuma ise, tarayıcı sıcaklığını dengelenmesi ve bazal içinde sürüklenme ortadan kaldırmak için çalışmasına izin. Örnek ilave tarafından izlenen bir başlangıç ​​bir ekran görüntüsü için Şekil 2 bakınız.
5. Temel stabilize, ya da en azından 5 tarama sonra, okuma duraklatmak ve plaka çıkarma.
6. Lavabo boşaltma ile PBS çıkarın ve plaka üzerinde kontrol kuyuları, ancak tüm [PBS pH 7.2 içinde 10 ug / ml], 50 ul RL21A biyotinile antikor ekleyin. Kontrol oyuklarına 50 ul PBS ilave edin.
7. Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve doygunluk, yaklaşık 1.5 saat ulaşılana kadar okumaya devam.
8. Okuma Pause ve plaka çıkarma.
9. Yıkama plaka 200 ul 200 ul / göz PBS pH 7.2 ile 3 kez durulanır, ardından / oyuk fosfat tamponlu tuz +% 0.05 Tween 20 (PBST) ile 3 kere yıkanır. PBS ile tekrarlayın. Bir sonraki adıma hareket önce kağıt havlu üzerinde plaka aşırı PBS dokunun.
   Not: Bu adım, otomatik plaka yıkayıcı üzerinde gerçekleştirilen veya lavabonun içine sıvı damping ve bir pipet ile PBST değiştirerek plaka 200 ul PBST ile 3 kez yıkayın olabilir.
10. Tüm aktif oyuklara 50 ul PBS pH 7.2 ekleyin.
11. Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve yıkama sonrası rezonans izlemek için okumaya devam edin.
12. Okuma durdurun ve plaka çıkarma.

Aşama 1 için alternatif protokolü:

13. Tüm oyuklara [10 ug / ml PBS] 50 ul RL21A biyotinile antikor ekleyin.
14. 1.5 saat ya da gece boyunca 4 ° C, oda sıcaklığında inkübe edilir.
15. 200 ul plaka 3 kez yıkayın / PBST adım 1.9 200 ul / göz PBS ile 3 kez durulanır.

Analitin jove_title "> 2. Eklenen

1. PBS çıkarın ve uygun deney tamponu oyuk başına 50 ul ekle. Bu tahlil için, ticari olarak temin edilebilen normal insan serumu, PBS içinde seyreltilmiş 1:20 kullanılmıştır.
2. Açık biyodeney tarayıcı yazılımı deneysel prosedür tanımlamak için Kur Sihirbazı izleyin.
3. Biyodeney tarayıcıya plaka takın ve temel okuma başlar. Bu özel plaka üzerinde yapılan ilk okuma ise, sıcaklığı dengelenmesi ve bazal içinde sürüklenme ortadan kaldırmak için tarayıcı çalıştırın.
4. Temel stabilize, ya da en azından 5 tarama sonra, okuma duraklatmak ve plaka çıkarma.
5. Kuyulardan deney tamponu çıkarın.
6. Ile başak kontrol HLA A * 02: [0,625-10 mg / ml] 'den deney tamponu arasında değişen ilgili (FLSL) ya da konsantrasyonlarda ilgisiz (SLLV, YLEV veya KVL) peptidleri taşıyan 01 bir monomer. Levhanın kontrol oyuklarına standartların 50 ul ekle
7. Örnek deney tamponu içinde bir analit 'in 50 ul ekleplaka kuyuları. Bu tahlil için, ticari olarak temin edilebilen insan serum kullanılmıştır çivili.
8. Yaklaşık 30-60 dk geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve doygunluk ulaşılana kadar okumaya devam.
9. Okuma Pause ve plaka çıkarma.
10. 200 ul plaka 3 kez yıkayın / PBST adım 1.9 200 ul / göz PBS ile 3 kez durulanır.
11. Tüm aktif oyuklara 50 ul deney tamponu ekleyin.
12. Geri biyodeney tarayıcıya plaka takın ve yıkama sonrası rezonans izlemek için okumaya devam edin.
13. Okuma durdurun ve plaka çıkarma.
    Not: Deney tamponu: PBS, doku kültür ortamı veya deneyinin amacına bağlı olarak, PBS içinde 1:20 seyreltilmiş insan serum olabilir.

3. Veri Analizi

1. Biyodeney tarayıcı yazılımı veya ihracat tercih istatistiksel analiz yazılımı ham veri dosyaları kullanarak analiz edin. biyodeney tarayıcı yazılımı otomatik dayalı bağlanma eğrisi oluştururDeneysel kurulum sırasında verilen plaka düzeni.
   NOT: Analiz için biyodeney tarayıcı yazılımını kullanarak değilse, adımları 3.2-3.4 izleyin.
2. Sonraki her veri noktasından bazal ve negatif kontrol çıkartın.
3. Her zaman noktasında tekrarlanan kuyular için ortalama ve standart sapma hesaplayın.
4. Çubuk grafikler için bağlayıcı eğri seçin veya uç nokta veri grafiğini oluşturun.

Sonuçlar

01 molekülü, ^3: deney temsili bir grubu, HLA-A * 02 kapsamında iyi karakterize edilmiş TCRm, RL21A, özellikle bir peptidi tanıyan bir mürin IgG2a monoklonal antikorunu (MIF _19-27 veya FLSL) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. aynı kökenli peptid / HLA monomer olarak ilişkisiz HLA monomeri ^15, açıklanan prosedür göstermek için kullanılmıştır. 3 deney formatını gösteren Şekil.

RL21A diğer peptid / HLA ³ kompleksleri çok az çapraz reaktiviteye sahip FLSL / HLA monomer için özeldir. Bu özgüllük etiket ücretsiz biyoanaliz sistemi (Şekil 4) kullanılarak değinmeyecek. hareketsizleştirilmiş FLSL / HLA monomer (Şekil 5) üzerindeki RL21A antikor titrasyonu ile belirlendiği gibi, bu deney için etiket serbest biyo-analizi sistemi 'nin duyarlılığı düşük nanomolar aralığındadır. Arka sinyal, serum örneklerinde artmasına rağmen, sçivili insan serumunda FLSL / HLA monomer içindeki spesifik tespiti Şekil 6'da elde edilir ve bir konsantrasyon gradyanı kolayca anlaşılacaktır, bu örneklerde yer almaktadır. Son olarak, MDA-MB-231 hücre hattı elde edilen süpernatanlar önce FLSL / HLA-A * 02 sunmak için gösterilmiştir: 01 molekülü, bu etiketin serbest deney platformu (Şekil 7) ile çözülebilir FLSL monomer ihtiva ettikleri gösterildi. FLSL / HLA monomerin sonraki ekleme RL21A üzerindeki sinyali (Şekil 7) artırır. Nedeniyle sistemin hassasiyeti, iyi Şekiller 4 ve 5 standart sapma bir fonksiyonu olarak görülen sıcaklık dalgalanmaları sonucunda oluşabilir negatif rezonans vardiya olmak üzere kuyu varyasyona. Bu varyasyonlar, oda sıcaklığının biraz fazla (örneğin, 28 ° C) bir sıcaklıkta, bütün numuneler ve biyolojik tayin, plaka okuyucusu ön kuluçkaya yatırılması ile önemli ölçüde azaltılabilir.

Kısaca Şekil 8'de, 96,eh polistiren plakalar ile kaplanmıştır [10 ug / ml] RL21A ve PBST ile yıkandı,% 0.5 düşük yağlı süt, ile bloke edildi ve seri seyreltileri ile oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe edildi, PBST ile yıkandı, oda sıcaklığında 2 saat, için normal insan serumunda FLSL HLA monomerin bir standart eğri hazırlamak için PBS içinde 1:10 seyreltilmiş veya Hasta, plazma PBS içinde 1:10 seyreltilmiştir. sağlam HLA tespit etmek ve PBST içinde yıkandı: levha PBST ile yıkanmış, tavşan anti-insan β2 mikroglobulin [5000 1] ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır. Plakalar daha sonra, keçi anti-tavşan IgG [1: 10,000] ile 30 dakika inkübe edildi ve PBST ile yıkanmıştır. Kolorimetrik tespit ABTS (2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit] -diammonium tuzu), 15 dakikalık bir inkübasyon süresi boyunca yapılan alt-tabakanın ve bir mikro-plaka okuyucusu üzerinde 405 nm'de gözlenmiştir kullanılarak gerçekleştirilmiştir. FLSL / HLA üç hasta numunelerinde saptanmıştır.

Şekil 8B'de, hastanın plazma RL.064 PBS içinde 1:20 oranında seyreltildi ve daha sonra ilave edildiplaka ed ve 60 dakika boyunca etiket içermeyen dedektör izlenir. Hasta serumunda FLSL / HLA kompleksinin spesifik tespiti gerçekleştirildi. Student t testi grafik ve istatistik yazılımı (p <0.05) kullanılarak gerçekleştirildi.

Şekil 8C, doku kesitleri fare, bir pozitif kontrol olarak, anti-HLA-A2 (BB7.2) RL21A, IgG2b ve IgG2a sırasıyla negatif kontroller ile 1 ug / ml'de boyandı. Boyama, üreticinin talimatlanna göre nükleer boyama için bir anti-fare saptama kiti, DAB (diaminobenzadine) ve hematoksilin QS kullanılarak tespit edildi. RL21A de tümör lekelenmesi FLSL / HLA komplekslerinin tanıtımı teyit etmektedir.

Şekil 1:. Sınıf I insan lökosit antijeni ile Tümör antijen Kanserli dönüşüm bir hücre içi bir hastalıktır. HLA örnek intracellular proteinler ve hücre yüzeyinde kansere bağlı değişiklikler ortaya. CTL ve TCRm hücrelerle farklı HLA peptid kompleksleri ile kanserli hücreleri tanımak mümkündür.

Şekil 2:. İlk taban çizgisini gösteren veri toplama biyoanaliz tarayıcı yazılımı veri toplama Ekran Örnek FLSL / HLA kompleksinin 10 ug / ml ile kaplanmış bir plakaya RL21A antikor ilave edildi tarama. Antikorun konsantrasyonu olarak gösterilir. Her çizgi bir tek zaman içinde takip eder.

Şekil 3:. Tahlil plakası yakalama rel difraktif ızgara yüzeyinde hareketsiz antikorların Deneyi biçimi İllüstrasyontarafından, geçerli peptid / çözelti HLA komplekslerinin.

Şekil 4:. Ilişkisiz HLA monomer (YLEV, SLLV ve KVL) 'na göre, ilgili (FLSL) HLA monomer için biyotinile RL21A TCRm özgüllüğünün FLSL / HLA kompleksi gösterilmesi için RL21A spesifikliği. Biyotinile RL21A TCRm [10 ug / ml], avidin kaplı bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır ve bulma PBS içinde etiketlenmemiş alakalı veya alakasız HLA monomer [10 ug / ml] kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RL21A FLSL / HLA Kompleksi için özel oldu. İki yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p <0.001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Şekil 5:. Duyurma onun aynı kökten peptid / HLA kompleksine RL21A hassasiyetini Cilt İllüstrasyonlimit ve FLSL / HLA kompleksi RL21A hassasiyetini bağlayıcı. Biyotinile edilmiş, HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır ve belirtildiği gibi etiketlenmemiş RL21A PBS içinde seri seyreltmeler plakaya ilave edildi. Bu sistem için algılama düşük nanomolar aralıkta idi.

Şekil 6:. İnsan serumunda HLA tespiti Çivili İnsan Serum Gösteri HLA Komplekslerinin tespiti. Biyotinile RL21A TCRm [10 ug / ml], avidin kaplı bir deney plakası yüzeyi üzerinde hareketsiz bırakılmıştır. Ilgili (FLSL) ya da ilgisiz (SLLV) HLA monomer ile tutturuldu Bir araya toplanan normal insan serumu, PBS içinde 1:20 seyreltilmiş ve daha sonra plakasına ilave edildi ve 60 dakika süre ile etiket içermeyen detektör üzerinde izlenmiştir. İnsan serumundaki FLSL / HLA kompleksinin spesifik tespiti gerçekleştirildi. Genel olarak, arka plan sinyali (ilgisiz SLLV monomer) yüksektirer, seyreltilmiş serum örnekleri PBS içinde saflandırıldı analitler (bakınız Şekil 4) ile karşılaştırıldığında. İki yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p <0.0001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Şekil 7:. Çözünür HLA komplekslerinin göğüs kanseri hücre kültürü süpernatanlarında saptanan göğüs kanseri hücre süpernatantlan içinde HLA tespit kabiliyeti gösterilmektedir. Biyotinile RL21A TCRm, RL9A TCRm (negatif kontrol) ve bir izotip kontrol deney plakası yüzeyi üzerinde immobilize edildi. Spiked [5 ug / ml] ve Bölünmemiş MDA-231 hücre kültürü süpernatantları ilave edilmiştir ve etiket içermeyen detektör üzerine 60 dakika süre ile bağlanma. FLSL ve SLLV HLA monomer örnekleri RL9A ve RL21A bağlanması için pozitif kontrol temsil çivili. Tek yönlü ANOVA grafik ve istatistik yazılımı (p <0.0001) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Şekil 8:. Hasta numunelerinde FLSL / HLA komplekslerinin spesifik saptanması, (A) Immunosorbent Assay (ELISA), geleneksel bir enzim hasta plazmasında bir FLSL / HLA spesifik kompleksleri tespit etmek için kullanılmıştır. (B), Biyotinile RL21A TCRm veya IgG2a [10 ug / ml], avidin deney plakası üzerinde hareketsiz bırakılmıştır. Hasta RL.064 (C) Göğüs tümör dokusu önceden FLSL / HLA komplekslerinin tümör sunumunu doğrulamak için ³ anlatıldığı gibi lekeli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada tarif edilen yöntem, yüksek bir verim içinde hasta serum, plazma, idrar, tükürük örnekleri çözünür peptid / HLA komplekslerinin hızlı algılama sağlar 96- ya da 384-kuyucuklu format olur kanser teşhis için bir biyolojik işaretleyici tarama sistemi sunar. Monoklonal antikorlar ve etiket içermeyen algılama sistemi taklit T hücre reseptörü kullanan bu tahlil sistemi, geleneksel ELISA ile 3.5 saat kıyasla daha az 1 saat analiz süresini keser. Bu yüksek verimlilik yaklaşımı terapötik kanser aşıları veya biyofarmasötikler için klinik çalışmalarda hastaların hızlı tabakalaşma sağlar. Bu hastalık hedeflerin saptanması için güncel yöntemler tek tek hasta numuneleri, bir zahmet verici ve zaman alıcı bir afinite saflaştırmasını ve HPLC-MS / MS gerektirir. Bu yöntem, geleneksel ELISA teknikleri için uygun olmasına rağmen, endişe anti-β2 mikroglobulin antikor gibi ikincil algılama reaktifler doğmakta olan HL yapısını değiştirebilir ki oradaBir molekül ve TCRm sınırlayıcı algılama bağlanmayı inhibe eder. Etiket-ücretsiz algılama bu endişeleri azaltır. Bu yöntem, bir yüzey plazmon rezonans sistemi gibi diğer etiketi içermeyen sistemlerde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçüde bu çalışmada kullanılan biyo-deney sistemi ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir çıktı kapasitesini azaltacaktır.

Bu protokol etkin bir şekilde birkaç kritik adımlar bağlılık ile hasta serumu ve plazma olmayan HLA biyomarkerların tespiti için modifiye edilebilir. Bir <200 um kayması olası daha sonraki belirleme adımında düşük sinyal neden olacağı için, başlangıç ​​antikoru kaplama sürecinin gözlemlenmesi, yüzey optimizasyonu için tavsiye edilir. serum proteinleri zenginliği düşük konsantrasyon analitin bağlayıcı maske edilebilir baz ve yıkama sonrası okur bitiş noktası analizi için de yararlıdır. Son olarak, örneklerin sıcaklık değişimi iyi de varyasyona neden olabilir. Tüm numuneler, bir ön-inkübe edilmesi önerilmektedird etiketi serbest biosassay birim sıcaklık kontrol oda sıcaklığının üzerinde 2-3 ° C 'de ayarlanabilir. Soğutmalı örnekler çalışma sıcaklığına ulaşması için yeterli zaman tanınmalıdır.

Bu protokolün gelecek değişiklikler plaka yüzeyinde TCRm katlandınîmasını içerecektir. biyo-deney sistemi, en az 8-kompleks bir yoğunlukta kuyu tespit etmek uyarlanabilir. Test numunesi hacimleri başına, her kuyuya 4-8 TCRm tanıtarak azalır ve hasta başına giderek karmaşık verilerin toplanmasını sağlamak vardır. Bu özellik ayrıca tedavi seçenekleri ile ilgili hastaları bilgilendirmek.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description (optional)
ResoSens Label-free Bioassay Detection System	Resonant Sensors Incorporated
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates	Resonant Sensors Incorporated
ResoVu software	Resonant Sensors Incorporated
RL21A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
RL9A Biotinylated TCRm mAb	PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 Monomer	Experimmune		full peptide sequence: KVLEYVIKV
Pooled Normal Human Serum	ThermoFisher	BP2657100
MDA-MB-231 Cell Supernatant	ATCC	HTB-26	Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-053
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-63
Sodium Hydroxide	ThermoFisher	5318-1
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	BP665-1
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)	ThermoFisher	BP337-500
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)	ThermoFisher	37615
rabbit anti-human β2 microglobulin	Dako	A0072
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	111-035-144
Nunc  microplates	ThermoFisher	439454
Synergy 2 microplate reader	Biotek
Immpress Reagent Kit	Vector	MP-7402
Immpact DAB	Vector	SK-4105
Hematoxylin QS	Vector	H3403
IgG2a	MP BioMedicals	50328
IgG2b	MP BioMedicals	50330
anti-HLA-A2 (BB7.2)	Experimmune
Prism 5	Graphpad