Method Article
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
בבעלי חוליות, hematopoiesis מוסדר על ידי מייקרו-סביבות אינדוקטיביים (נישות). כמו כן, בmelanogaster תסיסנית אורגניזם מודל חסר חוליות, מייקרו-סביבות אינדוקטיביים הידועים ככיסי Hematopoietic זחל (HPS) זוהו כאתרים אנטומיים לפיתוח וההסדרה של דם תאים (hemocytes), בפרט של שושלת מקרופאג העצמית חידוש. HPS הוא segmentally חזר כיסים בין האפידרמיס ושכבות שרירים של הזחל, המהווה גם כן תאי עצב תחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. בזחל, תושב hemocytes (הנייח) חשוף לאנטי-אפופטוטיים, דבק ורמזי שגשוג מתאי העצב התחושתי אלה ורכיבים שעלולים להיות אחרים של HPS, כגון השרירים הבטנה ושכבות אפיתל. במהלך התפתחות נורמלית, שחרור הדרגתי של hemocytes התושב מדלקי HPS האוכלוסייה של hemocytes במחזור, ששיאו בשחרורו של מורח 'של hemocytes התושב בתחילת מטמורפוזה. תקיפות חיסוניים, פגיעה פיזית או הפרעה מכאנית לעורר את שחרורו המוקדם של hemocytes התושב למחזור. המתג של hemocytes זחל בין מקומות תושב ומחזור הדם מעלה את הצורך בתקן / הליך נפוץ לבודד באופן סלקטיבי ולכמת שתי אוכלוסיות של תאי דם אלה מזחלים תסיסנית יחידים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית לשחרר ולכמת את התושב וhemocytes במחזור מזחלים בודדים. השיטה מאפשרת גישות vivo לשעבר, ועשויה להיות מותאמת לשרת מגוון של שלבי התפתחות של דרוזופילה ואורגניזמים חסרי חוליות אחרות.
מחקר במודל חסר חוליות דרוזופילה melanogaster יש מונע הגילוי של חסינות מולדת 1, ויש להקל את ההבנה של היבטים שונים של התפתחות תאי דם 2-4. Hematopoiesis תסיסנית ניתן לחלק את שושלת היוחסין של hemocytes זחל / העוברי שמקורם ב עובר ולהרחיב בזחל, והשושלת של בלוטת הלימפה hemocytes 4,5. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בשושלת של hemocytes העוברי / זחל, אשר בזחל תסיסנית כוללת בעיקר plasmatocytes (מקרופאגים) וכמה תאי גביש 4. כיסים בזחל, hemocytes של העובר להתמיד וליישב segmentally חזרו ומסוף Hematopoietic (HPS) ממוקמים בין האפידרמיס ושכבות שרירים של קיר גוף זחל 5,6. בהתבסס על אופיים כמקרופאגים עצמיים חידוש 6, המגורים העיקריים שלהם במייקרו-סביבות רקמות מקומיות 6, 7, והשושלת שלהם מתאי הדם המוקדמים מתעוררים במהלך הפיתוח 6,8, אוכלוסיית תאי הדם הזה נחשבת דומה למקרופאגים חוליות עצמי חידוש רקמות, שושלת מיאלואידית עצמאית זוהתה לאחרונה במגוון רחב של מינים 4,9,10. עם זאת, בדרוזופילה, חלק או את כל תאי התושב אלה מראים גם גמישות ללהצמיח סוגים אחרים של תאי דם כגון תאי גביש 11,12.
hemocytes הזחל הוא בעיקר תושב (נייחים), אבל נמצא במצב יציב דינמי בין HPS השונים. הם משתחררים בהדרגה למחזור, בפרט כזחל instar 3 rd גישות pupariation 5-7. אתגרים חיסוניים, פציעה או להוביל הפרעה מכאנית למוקדם, במקרה האחרון הפיכים, גיוס של hemocytes התושב אל hemolymph 4,6,13.
מחקרים קודמים הציעו כי תושב ומחזורhemocytes זחל הוא מאותו השושלת, אך נבדלים בתכונות הדבקה או ביותם 6,7,13,14. בידוד סלקטיבי של מחזור לעומת hemocytes התושב גילה רמות גבוהות של ריבוי באוכלוסיית hemocyte התושב, המצביע על החשיפה שלהם לרמזים אינדוקטיביים מHPS זחל HPS 6. תסיסנית מכוסים על ידי עור ושכבות שרירים ונמל נוסף אשכולות נוירון חושיים של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) ותפקוד כבד דומה oenocytes 6. מבחינה תפקודית, ניסויי אבלציה התא שעברו מוטציה הגנטיים והוכיחו כי תאי עצב תחושתיים נוכחי בHPS לתמוך בהישרדות ולוקליזציה הטרופיות של hemocytes זחל 6.
כאן אנו מתארים שיטה לבידוד הספציפי והכימות של התושב וhemocytes במחזור מזחלים תסיסנית אחת, ופרוטוקול לגיוס hemocyte מכאני. השיטות יכולות לשמש לvivo לשעברמחקר של hemocytes ועוד יכול להיות מותאם לשלבי התפתחות אחרים תסיסנית כגון גולם ובוגר, ומערכות חסרי חוליות אחרות. מאז מחקרים קודמים לא הבחינו בין התושב וhemocytes במחזור, פרוטוקול זה מספק סטנדרטי לחקר תאי דם תושב נפוץ ויעזור להגדיל את העקביות של מחקר בתאי דם חסר חוליות.
ראשית, Hemocyte בליד / לגרד Assay מתאר את בידוד ההפרש וכימות אוטומטי של תושב מסומן חלבון פלואורסצנטי ומחזור אוכלוסיות hemocyte מזחלים תסיסנית יחידים; הפרוטוקול מספק שתי אפשרויות למיקרוסקופים לסרוק מצוידים רגילים ואריח (איור 1). כתוצאה מכך, השיעור של hemocytes במחזור ואת המספר הכולל של hemocytes לזחל מתקבלים. השיטה מסתמכת על זחלים תסיסנית מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בין תאי הדם שלהםאוּכְלוֹסִיָה. הבחירה של נהג hemocyte או כתב קובעת את התוצאה, כלומר, שאוכלוסייה של תאי דם דמיין ולכמת. לתייג בעיקר מקרופאגים (plasmatocytes), המהווה את הרוב המכריע של התושב ואוכלוסיית hemocyte במחזור של זחל תסיסנית 6, transgenes המתאים כוללים Hml 6 Δ-DsRed, HmlΔ -GAL4 15, Pxn -GAL4 16, Crq-GAL4 (על ידי ח Agaisse 16), או אוכל-GAL4 17; לתיוג האוכלוסייה הקטנה יחסית של תאי גביש, קווים מתאימים הם BcF6-CFP ו-GFP 18, או LZ-GAL4 (על ידי ג 'פולוק 19); לlamellocytes תיוג, סוג תא מיוחד בעיקר נגרם על ידי אתגרים ופציעה 13 חיסוניים, למשל, MSNF9mo-mCherry ניתן להשתמש 17. כמה נהגים מהונדסים באים לידי ביטוי במגוון של דם מובחןתאים ואבות, כגון הוא - GAL4 20, אשר תוויות כ -80% מכלל תאי דם זחל 20. אנא שים לב כי בכל המקרים שבי GAL4 נהגים משמשים, שילוב עם כטב"מ-GFP או אחר כטב"מ-transgene חלבון פלואורסצנטי נדרש. בסעיף התוצאות, שיטה זו משמשת כדי לפקח מספר תאי דם וזרימת התנהגות במהלך התפתחות זחל.
שנית, Hemocyte ההפרעה Assay מתאר שלב מקדים שנועד לנתק hemocytes התושב על ידי מניפולציה חיצונית, אשר לאחר מכן מאפשרת ההערכה של היכולת של hemocytes מחדש לדבוק ובית לHPS בתוך מסגרת זמן מוגבלת (30 - 60 דקות) 6. בדרך כלל assay זה ואחריו בליד / לגרד Assay כדי לקבוע את אחוז מחזור hemocytes לזחל. אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור assay זה (איור 1D), המשתמש בהפרעה על ידי שנינות vortexingחרוזי זכוכית h, ולא מניפולציה של זחל יחיד עם מברשת צבע כפי שתואר לעיל 6. בסעיף התוצאות, assay זה משמש על מנת להוכיח כי לצוף hemocytes זמני מנותק בhemolymph וניתן לשחזר בכל החלק של מחזור hemocytes. Assay שימושי גם לכמת הבדלים של hemocytes בביות / ההדבקה שלהם לאתרי תושב, השוואה לדוגמא, רקע גנטי שונים או תנאי גירוי. אנא שים לב כי מניפולציה מכאנית זו משקפת תהליך הפיך ושונה מגיוס hemocyte התושב מדלקת או מושרה פציעה, שהם בדרך כלל לא הפיכים במסגרת זמן קצרה 4,13.
1. Hemocyte בליד / לגרד Assay
2. Hemocyte ההפרעה Assay
כדי להמחיש את תוצאות אופייניות לשיטות שתוארו, היינו ראשון Hemocyte בליד / לגרד Assay להתוות את ההתקדמות של מספרי hemocyte זחל ומקום מגוריהם במהלך התפתחות זחל (איור 4). תושב ומחזור אוכלוסיות hemocyte זחל היו מבודד מזחלים בודדים (Hml Δ-GAL4, כטב"מ-GFP; הוא-GAL4 לתייג הרוב המכריע של hemocytes זחל) ולכמת באמצעות ImageJ. קבוצות של זחלים בגודל 1.2 מ"מ (~ AEL 48 שעות או 1 instar st), 2.5 מ"מ (~ 80 שעות AEL או מאוחר 2 instar ND), ו -3.5 מ"מ (~ 96 שעות AEL או 3 rd instar) נבדק (איור 4) . מספרי Hemocyte התרחבו במהלך התפתחות זחל, correlating עם ועולה על הערכות קודמות מבוססת על מיקרוסקופ אור של זחלי צבע מוכתם 7 וספירה חיה של hemocytes חלבון הנקרא ניאון דרך ציפורן זחל 6. בתוספות 1 stזחלי זפת כמעט כל hemocytes היה תושב, תוך שבריר של hemocytes במחזור גדל בהדרגה במהלך התפתחות זחל (איור 4, C), עולה בקנה אחד עם פרסומים קודמים 6,7.
הבא בדקנו האם השיטה בנאמנות מנטרת את המעבר של hemocytes בין התושב והאוכלוסיות במחזור. מנצלים את התופעה שhemocytes התושב יכול להיות מנותק זמני על ידי הפרעה מכאנית והם מחדש לדבוק אתרי התושב שלהם באופן ספונטני 6, אנחנו מפוזרים hemocytes התושב על ידי vortexing עם חרוזי זכוכית, כמתואר בHemocyte ההפרעה Assay. ואכן, הפרעה מכאנית של זחלים הובילה לעלייה דרמטית באוכלוסייה של מחזורי hemocytes על חשבון hemocytes התושב (איור 5). לאחר תקופת החלמה של 45 דקות, hemocytes חזר במידה רבה למצב החסיד, הן על ידי בדיקה ויזואלית ועל ידי כאחוז העריך אז תאים במחזור (איור 5D, E). כצפוי, הכולל מספרי hemocyte נשארו יציבים לאורך זמן, למרות השינוי של hemocytes בין האוכלוסיות במחזור והתושב.
כמה שיקולים נוספים נלקחו בחשבון. כדי לאשר vortexing שלא לגרום נזק לרקמות גדול, vortexing עם חרוזי זכוכית בוצעו בנוכחות trypan הכחולה (Sigma) לתקופות זמן שונות (1, 5, 20 דקות). שני vortexing דקות 1 ו -5 לא לגרום לכל הפרעה רקמה ברורה, תוך 20 דקות vortexing הביא באזורים הקטנים של נזק, שמזכיר נזק שנגרם עקב תפרים מחט משמשים כביקורת חיובית (איור משלימה 1). בעוד הנזק הפנימי של עור או ברקמות אחרות ללא נזק לציפורן לא ניתן לשלול, תרחיש זה נראה די סביר כhemocytes של 1 דקות ו -5 שטופלו דקות זחלים בתבנית הצפויה ומסגרת זמן-דבקה מחדש, מה שמרמז על שלמות זחל לא הייתה פשרהד (איור משלימה 1). לעומת זאת, זחלי vortexed במשך 20 דקות סבלו מחוסר מחדש הידבקות, ואפילו לא הראו קשר של מחזורי hemocytes לאתרי אפידרמיס פצע, כפי שתוארו קודם לכן 14.
לבסוף, כדי להדגים שחזור של השיטה, השווינו משכפל ביולוגי של 2.5 מ"מ זחלים משני ניסויים לעיל, שנערכו על ידי הנסיינים שונים. כפי שמודגם באיור 2 נוסף, שתי הקבוצות הראו מספרי השוואה כולל של hemocytes לזחל, ואחוז hemocytes במחזור. הבדיקות לא של התלמיד לא הראו הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית, המצביע על כך השיטה היא שחזור והחלים רחב.
איור 1. Hemocyte בליד / לגרד והפרעה Assay של etup וסכמטי. הגדרות () יחידה תמונת שקופיות: חמישה ריבועים 2 מ"מ להדמיה עם מטרת 5X (ב) התקנת שקופיות סריקת טייל:. ארבעה ריבועים 3 מ"מ ללדמם הדמיה / שריטות של זחלי מ"מ ≤2.5 עם מיקרוסקופ סריקת אריח. יעדים מומלצים להדמיה הם 5X או 10X. (ג) Bleed / quantifications סכמטי וכתוצאה לגרד Assay באמצעות ImageJ. (ד) בAssay ההפרעה, דפוס hemocyte מופר באופן מכאני על ידי vortexing זחלים עם חרוזי זכוכית. זחלים מותר להתאושש על פני תקופה של 45 דקות שבמהלכו hemocytes מחדש לדבוק בכיסי Hematopoietic. מאפייני ההדבקה של hemocytes ניתן להעריך בשיטה זו, כימות אחוז hemocytes במחזור לאחר הפרעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
o: לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 3. אוטומטי כימות של hemocytes באמצעות ImageJ. (A, B) לאחר פתיחת קובץ תמונת hemocyte בImageJ, רמת הסף התחתונה מותאמת לדין וחשבון על כל התאים בתמונה. (C, D) לנתח חלקיקים דורש הגדרת גודל פיקסל תא, מעגלי, ואת הודעת התוצאה פורמט (למשל, שכבת קווי המתאר). (ה) חלון סיכומו מוצגות מספר hemocytes. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נציגי תוצאות (1). מספר Hemocyte ומדינת תושב על במהלך התפתחות זחל. סקירה של שלבי הזחל בשימוש (); 1 st instar (AEL 48 שעות; ~ 1.2 מ"מ אורך); (AEL שעה 80; אורך 2.5 מ"מ) 2 nd instar; 3 rd instar (96 שעות AEL; ~ אורך מ"מ 3.5). גנוטיפ הוא Hml Δ-GAL4, כטב"מ-GFP; הוא-GAL4. שלבים אושרו על ידי הערכת mouthhooks זחל. תרשים בר (B) של מחזור ומספרי hemocyte התושב בשלבי זחל בהתאמה. אחוז (ג) במחזור hemocytes. שים לב שהחלק של hemocytes במחזור מגביר פרופורציונלי במהלך התפתחות זחל. (ד) סך hemocytes, כתוצאה מהסכום של המחזור וhemocytes התושב לזחל. Hemocytes היו לכמת בשיטה בליד / לגרד; n ≥ 6 זחלים / מצב, ברים שגיאה להראות סטיית תקן, ממצאים אישרו ב 3 ניסויים לשכפל עצמאיים.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. נציגי תוצאות (2). השפעות של הפרעה מכאנית במגורי hemocyte. (AC) דוגמא של זחל לפני ואחרי vortexing עם חרוזי זכוכית, ואחריו התאוששות 45 דקות () אין שליטת הפרעה.; hemocytes הם מקומיים בכיסי Hematopoietic (ב) דפוס hemocyte שיבשו ב0 דקות לאחר vortexing זחלים בהשעיה של חרוזי זכוכית ומים דפוס Hemocyte (ג) ב 45 דקות של פוסט הפרעה-התאוששות..; hemocytes רבים עבר לכיסי Hematopoietic; שים לב אשכולות הקשורים גב-כלי מוגדל ופסי גב שהם אתרים עיקריים של הצטברות הודעה הפרעה-מוקדם (חיצים). גנוטיפ הוא Hml Δ-GAL4, כטב"מ-GFP; הוא-GAL4 YW x. אחוז (ד ') במחזור של hemocytes לכמת בשיטה בליד / לגרד. (E) סה"כ hemocytes, כתוצאה מהסכום של המחזור וhemocytes התושב לזחל. n ≥ 4 זחלים / מצב, ברים שגיאה להראות סטיית תקן, ממצאים אישרו ב 3 ניסויים לשכפל עצמאיים. מבחן t כדי לאשר משמעות, NS (לא משמעותי), ** (p ≤ 0.05), ** (p ≤ 0.01). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כאן, אנו מתארים את השיטה הראשונה להתאושש כמותית תאי דם תושב ומחזור מהזחלים תסיסנית אחת, ולכמת שתי אוכלוסיות hemocyte אלה. הפרוטוקול כולל את השחרור רציף של תאי דם במחזור והתושב, ואחריו הדמיה וספירה תאים אוטומטית. hemocytes תושב הזחל יכול להיות מגויס זמני למחזור על ידי הפרעה מכאנית, תהליך שידוע להיות הפוכים במידה רבה בתוך 30 - תקופת החלמה דקות 60 6. בהתאם לכך, פרוטוקול זה נבדק בשתי דרכים, (1) על ידי בחינה של מספר hemocyte כולל לזחל וחלק של מחזור hemocytes במהלך התפתחות זחל, ו- (2) על ידי ניסוי פירוק hemocytes התושב באמצעות שיטה אוטומטית, אשר אישר את מתאם הדוק של לוקליזציה hemocyte ומספר hemocyte בתושב ואוכלוסיות במחזור. בנוסף, שחזור של השיטה הודגם על ידי שיתוףmparing שני מערכי נתונים של משכפל ביולוגי.
בעבר, מעבדות השתמשו במגוון של טכניקות לכמת hemocytes זחל 6,13,21. פרוטוקול זה קובע סטנדרט לאחזור ולכמת אוכלוסיות תאי דם תושב ומחזור מזחלי דרוזופילה, מתן פלטפורמה להתאמה בקלות משותף. השיטה המתוארת היא קריטית עבור מחקרים המתמקדים בתפקיד של hemocytes התושב ומייקרו-הסביבה שלהם, Hematopoietic Pockets 4-6, והוא מתאים ללמוד זני חלבון פלואורסצנטי נשיאת transgene דרוזופילה בסוג בר ורקעים מהונדסים גנטי. הפרוטוקול רלוונטי גם למחקרים המתמקדים בגיוס hemocyte אחרי אתגר חיסוני או פציעה, ואיתות גנטית או סביבתי הנגרמת על שמפעיל גיוס של hemocytes או שינויים במספר כולל hemocyte (בדיקה ב 4) התושב. יש לציין כי, במקרים של די המוקדמתfferentiation ושחרורו של hemocytes מבלוטת הלימפה, הבחנה / זחל עוברי לעומת שושלות בלוטת הלימפה עשויים להיות מוגבל על ידי דפוס הביטוי של כתב hemocyte הניאון משמש.
הפרוטוקול המובא כאן מסתמך על חיים הדמיה, hemocytes fluorescently שכותרתו. בעתיד, זה ניתן לשינוי על מנת לאפשר זיהוי של תאים שוחררו לאחר קיבוע, למשל, באמצעות immunocytochemistry. במקרה זה, הפרוטוקול ייתכן שיהיה הצורך מותאם כדי להבטיח הדבקה מלאה של תאי הדם, לדוגמא על ידי הגדלת פעמים דגירה הידבקות, והוספת שקופיות ציפוי דבק, כגון א concanavalin מאז השיטה מאפשרת אחזור של hemocytes ולשעבר המניפולציה שלהם vivo, זה יועיל למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים התפתחותית, תא. תאי תושב ודם במחזור נמצאים בכל שלבי postembryonic ההתפתחותי של דרוזופילה וחסרת חוליות אחרות 22, suggesting הסתגלות של שיטה זו תיהנה מגוון רחב של מחקרים מעבר למערכת hematopoietic זחל תסיסנית.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Jesper Kronhamn ודן Hultmark, מיכאל Galko, והמרכז במלאי Bloomington עבור מניות הזבוב. תודה מיוחדת לקורטני Onodera לייעוץ עם ניתוח סטטיסטי. אנו מודים קתרינה זהב לקריאה ביקורתית של כתב היד, וקלף Makhijani, קתרינה זהב, חברי המעבדה Derynck, ואנשי המעבדה Nystul לדיון והערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית קליפורניה בסן פרנסיסקו ליו-הרפואי פריצת הדרך במחקר (PBBR), רוד מרכז, הלמן קרן, האגודה האמריקנית לסרטן RSG DDC-122,595, איגוד לב האמריקאי 13BGIA13730001, הקרן הלאומית למדע 1,326,268, המכונים הלאומי לבריאות 1R01GM112083-01 ו 1R56HL118726-01A1 (לKB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved