Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Özet

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Özet

Omurgalılarda, hematopoez endüktif mikroçevrelerde (nişler) tarafından düzenlenir. Benzer şekilde, omurgasız bir model organizma Drosophila melanogaster, larva Hematopoietik cepler (HPS) olarak bilinen indüktif mikroçevrelerde kendini yenileyen makrofaj özellikle gelişimi ve kan hücreleri (hemocytes) düzenlenmesi için anatomik bölgelerden olarak tespit edilmiştir. HPS olan segmental da periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva larva epidermis ve kas tabakaları arasındaki cepler tekrarladı. Larva olarak, ikamet (sesil) hemocytes, anti-apoptotik, yapıştırıcı ve bu duyusal nöronlar gelen çoğalma kuyruklar ve astar kas ve epitel katman olarak HPS potansiyel olarak diğer bileşenleri maruz kalmaktadır. HPs yakıtlardan normal gelişim, yerleşik hemocytes kademeli olarak gevşetmek sırasında mo sürümünde doruğa dolaşan hemocytes nüfusu,metamorfoz başında ikamet hemocytes st. Bağışıklık saldırılar, fiziksel yaralanma ya da mekanik rahatsızlık dolaşıma ikamet hemocytes prematüre salınımını tetikler. Ikamet yerleri ve dolaşım arasındaki larva hemocytes anahtarı seçici ayırmak ve tek Drosophila larva kan hücrelerinin bu iki popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart / prosedür gereksinimini artırmaktadır. Buna göre, bu protokol bırakın ve tek larva yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ölçmek için otomatik bir yöntem açıklanır. Yöntem, ex vivo yaklaşımlar kolaylaştırır ve Drosophila aşamalar ve diğer omurgasız organizma, çeşitli hizmet etmek için adapte edilmiş olabilir.

Giriş

Omurgasız modelinde Drosophila melanogaster Araştırma doğal bağışıklık ¹ keşif sürdü ve ^2-4. Drosophila hematopoiezis menşei embriyonik / larva hemocytes soyu, ayrılabilir kan hücresi gelişiminin çeşitli yönlerini anlaşılmasını kolaylaştırdı Embriyo ve larva genişletmek ve lenf bezinin soy ^4,5 Hemocytes. Burada, Drosophila larva çoğunlukla plazmatositler (makrofajlar) ve birkaç kristal hücreler ⁴ içermektedir larva / embriyonik hemocytes soyu, odaklanan bir protokol mevcut. Epidermis ve larva vücut duvarının ^5,6 kas tabakaları arasında yer alan larva olarak, embriyo hemocytes devam ve kolonize segmental tekrarlanan ve terminal Hematopoetik cepler (HPS). Kendini yenileyen makrofajlar ^6, lokal doku mikroçevrelerde ⁶ onların baskın ikametgah olarak doğaları dayanarakGelişme ^6,8 edilirken ortaya çıkan erken kan hücreleri 7 ve bunların soyu, bu kan hücre popülasyonu omurgalı kendini yenileyen doku makrofajları, son türlerin ^4,9,10 çeşitli tespit bağımsız myeloid benzer kabul edilir. Bununla birlikte, Drosophila, bir kısmı veya yerleşik hücrelerin tümü, aynı zamanda plastisite gibi kristal hücreleri ^11,12 gibi diğer kan hücre tiplerinin sebep göstermek.

Larva hemocytes ağırlıklı ikamet (sapsız) vardır, ancak çeşitli HPs arasında dinamik kararlı durumdadır. ^3. instar larva pupariation ^5-7 yaklaşırken Onlar kademeli özellikle dolaşıma salınır. Hemolimf ^4,6,13 içine Bağışıklık geri dönüşümlü ikinci durumda zorluklar, erken yaralanma veya mekanik bozukluk kurşun, yerleşik hemocytes seferberlik.

Önceki çalışmalar ikamet önerdi ve dolaşımdakiLarva hemocytes aynı soydan gelen, ancak bunların yapışkan veya hedef arama özellikleri ^6,7,13,14 farklıdır. Yerleşik hemocytes karşı dolaşan seçici izolasyonu Periferik Sinir Sistemi duyusal nöron kümeleri epidermis ve kas tabakaları ile kaplı ve ayrıca liman olan HP'nin ^6. Drosophila larva HPS gelen endüktif ipuçlarına maruz kaldıkları öne ikamet hemocyte nüfusun çoğalması düzeyi yüksek saptandı (PNS) ve karaciğer fonksiyon oenocytes ⁶ benzeyen. İşlevsel, mutant ve genetik hücre ablasyon deneyler HPS'de bulunan duyusal nöronlar larva hemocytes ⁶ trofik hayatta kalma ve lokalizasyonu destekleyen olduğunu göstermiştir.

Burada belirli bir izolasyon ve ikamet ölçümü ve tek Drosophila larva dolaşan hemocytes ve mekanik hemocyte seferberlik için bir protokol için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, ex vivo kullanılabilirhemocytes çalışması ve ayrıca, pupa ve erişkin ve diğer omurgasız sistemleri gibi diğer Drosophila gelişim aşamalarına uyarlanabilir. Önceki çalışmalar yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ayırt etmedi beri, bu protokol ikamet kan hücrelerinin çalışma için ortak bir standart sağlar ve omurgasız kan hücre araştırmalarının tutarlılığını artırmak için yardımcı olacak.

İlk olarak, Hemosit Taşma Payı / Pençe Deneyi diferansiyel izolasyonu ve floresan protein-işaretlenmiş ikamet ve tek Drosophila larva hemocyte popülasyonlarının dolaşan otomatik ölçümü açıklar; protokol, düzenli ve kiremit tarama donanımlı mikroskopları için iki seçenek (Şekil 1) sağlar. Bunun bir sonucu olarak, dolaşımdaki hemocytes yüzdesi ve larva için hemocytes sayısı elde edilir. Yöntem kan hücresinin içinde floresan protein ifade transgenik Drosophila larva dayanırNüfus. Hemocyte sürücüsü veya muhabir seçimi kan hücrelerinin nüfusu görüntülenmiştir ve sayısal olan, yani sonucunu belirler. Ağırlıklı olarak etiketlemek için makrofajlar ikamet ve Drosophila larva ⁶ dolaşımdaki hemocyte nüfusunun büyük çoğunluğunu oluşturan (plazmatositler), uygun transgenler ile (HML Δ-DsRed ^6, HmlΔ -GAL4 ^15, PXN -GAL4 ^16, CRQ-GAL4 dahil H. Agaisse ¹⁶⁾ ya da yiyici-GAL4 ^17; Kristal hücrelerinin nispeten küçük nüfusu etiketlemek için uygun hatlar BcF6-OBP ve GFP ¹⁸ veya (J. Pollock ¹⁹⁾ tarafından lz-GAL4 vardır; etiketleme lamellocytes için, özel bir hücre tipi ağırlıklı olarak bağışıklık zorluklar ve yaralanma ¹³ tarafından uyarılan, örneğin, MSNF9mo mCherry ¹⁷ kullanılabilir. Bazı transgenik sürücüler farklı kan bir dizi olarak ifade edilmiştirTüm larva kan hücreleri ²⁰ yaklaşık% 80 etiketler GAL4 ^20, - örneğin O gibi hücreler ve progenitorlar,. GAL4 sürücüler kullanıldığı yerlerde UAS-GFP veya başka bir floresan protein UAS-transgen ile kombinasyon gereklidir tüm durumlarda lütfen unutmayınız. Sonuçlar bölümünde, bu yöntem, larva gelişimi boyunca, kan hücre sayısı ve dolaşım davranışını izlemek için kullanılır.

(- 60 dak 30) ⁶ İkincisi, Hemosit Rahatsızlık Deneyi sonradan yeniden yapışması ve ev HPS sınırlı bir zaman çerçevesinde hemocytes yeteneği değerlendirilmesine olanak dış manipülasyon tarafından ikamet hemocytes ayırmak için tasarlanmış bir önceki adımı açıklanır. Tipik olarak, bu deney, her bir larva için hemocytes dolaşımdaki yüzdesini belirlemek için Boşaltma / Pençe Tahlili tarafından takip edilir. Biz vorteksleme wit göre rahatsızlık kullanan bu deneyi (Şekil 1D) için basitleştirilmiş bir protokol mevcuth cam boncuk, yerine boya fırçası ile tek larva manipülasyon önce ⁶ açıklandığı gibi. Sonuçlar bölümünde, bu deney hemolimf bu geçici müstakil hemocytes şamandıra göstermek için kullanılır ve hemocytes dolaşan fraksiyonunda elde edilebilir. Tahlil örn, çeşitli genetik geçmişleri veya stimülasyon koşullarının karşılaştırılması ikamet sitelere kendi hedef arama / yapışma hemocytes farklılıkları ölçmek için de yararlıdır. Bu mekanik manipülasyon geri çevrilebilir bir süreç yansıtır ve genellikle kısa bir süre ^4,13 geri dönüşümlü olmayan enfeksiyon-veya hasar kaynaklı ikamet hemocyte seferberlik farklı olduğunu unutmayın.

Protokol

1. Hemosit Sızdırma / Pençe Deneyi

1. Slaytların hazırlanması:
   1. Karo tarama fonksiyonu olmayan Mikroskop Seçenek 1: Her larva analiz edilebilmesi için, mikroskop alan görüş alanına karşılık gelen 2 mm'lik kareler her yaklaşık 5 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak; Her bir (Şekil 1A) S2 ortam 10 ul - yaklaşık 5 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun.
   2. Karo tarama fonksiyonu ile Mikroskop Seçenek 2: Her larva analiz edilebilmesi için, ~ 3 3 4 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak - 4 mm kareler her; Her bir oyuğa (Şekil 1B) S2 ortam 20 ul - yaklaşık 15 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun.
      NOT: kuyu yukarıda önerilen sayıda ~ 2.5, larva başına en fazla 3.000 hemocytes toplamları (geç ^2. evre larvaları için yeterli - larv çoğunluğu etiketleme 3 mm uzunluk, transgenal kan hücreleri). Büyük kan hücresi sayıları değerlendirirken, daha kuyular fazla kalabalığı önlemek için gerekli olabilir.
2. Larva Koleksiyonu:
   1. Bir Petri kabı içine larva ve floş larvaları içeren bir sinek şişenin içine su fışkırtma veya Petri kabı içine larvaları içeren bazı gıda kepçe ve bir bücür şişe kullanılarak su ile seyreltin.
   2. Yavaşça boya fırçası yardımıyla Petri kabı dışarı larvaları almak ve bir boşluk tabak veya soğuk blokta bir slayt suya koyun.
      NOT: Larvalar su veya soğuk bir blokta sınırlı bir süre için muhafaza edilebilir; Larva ölümü ya hemocytes istenmeyen etkileri önlemek için, 45 dakika ya da daha az olan örnekler kullanılır.
3. Diseksiyon:
   1. Soğuk metal blokta flöresanlı bir mikroskop altında larvaları seçin. İsterseniz boyutları ve görüntü larva ölçün.
   2. ("Bleed") hemocytes dolaşan İzolasyonu:
      1. Larvalar seçildikten sonra, ilk Pap-kalem de (Şekil 1C bir larva yerleştirin2A).
      2. Larva posterior ve anterior uçları hem bir kesi yapmak için 2 temiz iğneler veya kesme makas ve forseps kullanın. Yerleşik hemocytes rahatsız etmemek için, larva ventral tarafta bu kesiler yapmak en iyisidir. Tutarlı sonuçlar için, her larva için aynı konumlarda kesiler yapmak. ^1. evre larvaları için, (ventral anterior) 1 kesi yeterlidir.
      3. Larva herhangi bir baskı ya da fiziksel ajitasyon (Şekil 2A) olmadan birkaç saniye kanamaya izin verin.
         NOT: Birden fazla larva üzerinde çalışan Eğer numunelerin bütünlüğünü etkileyebilecek çok uzun buz üzerinde larva tutarak önlemek için bir sonraki aşamaya geçmeden önce her biri için bu kesiler yapmak daha iyidir.
      4. Yavaşça iğne veya forseps ile larva kaldırın ve kalan dolaşan hemocytes durulayın ikinci kuyunun içine daldırın. Bundan sonra, ikamet hemocytes sürümü ile izleyin.
   3. yerleşik hemocytes izolasyonu ("Pençe"):
      1. Yavaşça sonraki kuyu (Şekil 2C) ile larva transferi.
      2. Tipik larva ön ucundan yaklaşık 1/3 bulunduğu larva, lenf bezi tespit ve larva vücut duvarı ile dorsal hangi floresan olabilir. (Şekil 2C) delinmesiyle önlemek için lenf bezine mümkün olduğunca yakın bir iğne ile larva aşağı iğneleyerek ikamet hemocytes bırakırken lenf bezi kaçının.
         NOT: Lenf bezi hemocytes olgunlaşma larva hemocytes kıyasla gecikir ve farklılaştırılmış hemocytes floresan gazetecilere genç larvaların lenf bezinde bir sinyal göstermiyor olabilir normal gelişim sırasında. Bu durumlarda, daha az dikkat beklenen lenf bezi hemocytes tarafından ayırt floresan etiketli larva hemocytes hiçbir kirlenme olarak lenf bezi ödenmesi gerekmektedir.
      3. Bir Boru açma yerleşik kan hücrelerini serbest bırakınkazıma ve / veya batıcı sürecine. Gerektiği gibi etkili lenf bezi yakın larva (yukarıya bakınız) ya da diğer vücut bölgeleri aşağı pin tek oya kullanın. Hemocytes ayırmak amacıyla, larva vücut duvarı (Şekil 2C, E) aracılığıyla görülebilir hemocytes kümelere de yumruk başka iğne kullanın. Hemocytes da bir sıyırma hareket salınabilir. Ancak, erken epidermisi yırtarak otomatik sayım daha zorlu yapabilir kan hücrelerinin, büyük kümeleri salabilir.
         NOT: larva yaşına ve genotipe bağlı olarak toplam hemocytes sayısı değişecektir. Tek hücre görüntü analizi zorlaştıracak kan hücreleri ile bir kuyu, bir aşırı kalabalık önlemek için çeşitli kuyular üzerinde, yukarıda tarif edilen salma işlemi dağıtın.
      4. Birkaç hemocytes son karkas kalırsa, manuel taksitli sayacı (Şekil 2E) mikroskop ve kullanımı ile gözlem yoluyla bu hemocytes saymak. Sayma, s kolaylaştırmak içinAynı slayt temiz bir alanda karkas dantel ve optik uçaklarının sayısını azaltmak için ince sürede yayıldı.
      5. Hücreler kuyuları görüntüleme önce yerleşmek (ama mutlaka bağlı değil) için 10 dk - diseksiyon tamamlandığında, 5 ila bekleyin. Kurumayı önlemek için nemli bir odaya slayt inkübe ve yerleşmiş hemocytes rahatsız olabilir slaytlar, kaba işleme kaçının.
         NOT: belirleyici hemocyte sayıları, serbest hücreler sabit değildir ve hücreler tercihen larva yayımlandıktan sonra 30 dakika içinde, kısa bir süre diseksiyonu sonrası görüntülü gereken zaman. De ortamın optik düzlemleri boyunca odaklanarak teyit edilmelidir 10 dakika - Orta ve hücre özelliklerinin hacmine bağlı olarak, hücrelerin büyük çoğunluğunun 5 içinde yerleşmiş olacaktır. Ancak, kan hücrelerinin sadece bir kısmını, bu zamana kadar slayt yüzeyine dikkate alınması gereken bir gerçeği yapıştırılır eğer hücre tespit tabanlı yaklaşımda için bu protokol değiştirereks.
4. Niceleme:
   1. Bir floresan mikroskobu (Şekil 2B, D, F) altında yerleşmiş hemocytes görüntü al. ImageJ yazılımı kullanarak hemocytes ölçümü ile izleyin.
   2. ImageJ hücre sayım algoritması için görüntü hazırlayın:
      1. Iyi kullanan ImageJ Açık resim: → Açık → (dosyasını bulun ve seçin) Dosya.
      2. Görüntü (ler) 8-bit veya 16-bit olduğundan emin olun. Image seçerek görüntünün eşiğini ayarlayın sonra ayarlayın ve seçin Eşik tıklayın. "Eşik penceresi" (Şekil 3A) gözlemleyin.
      3. "Karanlık Arka Plan" seçeneğini işaretleyin. "Kırmızı" seçin ve görüntünün her hücre bir kırmızı nokta (gri tonlama görülecektir örtülü edilmemesi hücreler; Şekil 3B) ile işaretlenmiş kadar (siyah ok) Alt Eşik Seviye artırın. Alt Eşik gibibazı hücreler işaretlenmemiş olacak artar. Bu alt Eşik ayarlamak ne kadar için bir gösterge olabilir.
         NOT: Bazen hücre kümeleri çözülemeyen ve partikül sayacı biri olarak sayılacaktır. Bu gibi durumlarda, bir kümedeki hücre sayısı görüntüsünü inceleyerek (gerekirse yakınlaştırma) ve manuel sayım sayacı, bir taksitli kullanılarak tahmin edilebilir. Seçenek olarak ise, alt eşik hücre kümeleri çözmek için arttırılabilir; Bu manipülasyon kaynaklanan herhangi işaretsiz hücreler daha sonra bir taksitli sayacı kullanılarak sayılabilir.
   3. ImageJ kullanarak hücre sayısını analiz:
      1. Hücreler (Şekil 3C) saymak Parçacık Analyzer başlatın. Analiz seçip Parçacık Analiz tıklayınız. İsteğe bağlı parçacıkları algoritma sayısı (Şekil 3D) görmek için "Kaplama Anahatları" seçeneğini seçin. Alternatif olarak, bir birimin büyüklüğü ya da piksel alanı limitini ayarlamış (örn., Hücre, algoritma hücreler, vs.) bir yığın saymak.
      2. Tamam'a tıklayın. Sayımı (Şekil 3E) ile bir özet penceresi gözlemleyin.

2. Hemosit Rahatsızlık Deneyi

1. Hemocytes seçeneğini larvaları rahatsız ve cam boncuklar (212-600 mikron) yaklaşık 0.5 g 2 ml mikrosantrifüj tüp yerleştirmek ve 0.5 ml su ekleyin.
2. 1 dakika hızda 10 at, elle, tüp Vortex.
3. Petri kabı içine mikrosantrifüj tüp içindekilerin dökülmesini ve bir fırça ile larva çekme cam boncuk larvaları alın.
4. Kurtarma fazı için, uçucu gıda küçük miktarlarda önceden hazırlanmış Petri tabaklarında larvaları yerleştirin. Larvalar 45 dakika ya da istenilen bir süre için hemocyte desen yeniden kurmak için izin verin.
   NOT: Onlar süreçte öldü gibi, hareketli durmuş herhangi larvaları atın. Ancak, genellikle l bakınittle hasarı vorteks 1 dakika sonra (aşağıda ve Ek Şekil 1).
5. Bölüm 1 'de yukarıda tarif edildiği gibi bir iyileşme süresinden sonra, Boşaltma / Pençe Testi ile devam edin.

Sonuçlar

Tarif edilen yöntemlerin tipik sonuçlarını göstermek için, öncelikle larva hemocyte numaralarının ilerlemesini ve larva gelişim boyunca kendi ikamet (Şekil 4) anahat Hemosit Sızdırma / Pençe Testi kullanılmıştır. Yerleşik ve larva hemocyte popülasyonları dolaşan tek larva izole edilmiştir (HML Δ-GAL4, UAS-GFP, O-GAL4 etiket engin larva hemocytes çoğunluğu) ve ImageJ kullanılarak ölçülebilir. Larva tabur (~ 48 saat AEL ya da 1 ^instar), 2,5 mm (~ 80 saat AEL ya da geç ^2. evre) ve 3,5 mm (~ 96 saat AEL veya ^3. instar) incelendi (Şekil 4) 1.2 mm boyutlu . Hemocyte numaraları ilişkilendirilmesi ve boya lekeli larva ^{7 ve} larva manikür ⁶ ile floresan protein etiketli hemocytes canlı sayım, ışık mikroskobu dayalı önceki tahminler aşan, larva gelişimi boyunca genişletti. ^1. insDolaşımdaki hemocytes kesir giderek daha önceki yayınlarda ^6,7 ile tutarlı larva gelişim kursu (Şekil 4B, C), üzerinde artarken tar larvaları hemen hemen tüm hemocytes, ikamet idi.

Sonraki biz yöntemi sadakatle yerleşik ve dolaşımdaki nüfus arasındaki hemocytes geçişi izler olup olmadığını incelemiştir. Yerleşik hemocytes geçici mekanik bozukluk ile ayrılabilir ve onların yerleşik sitelerine kendiliğinden ^6-uymak yeniden bu olayın yararlanan biz Hemosit Rahatsızlık Testi anlatıldığı gibi cam boncuk ile karıştırın ikamet hemocytes dağıldılar. Nitekim, larvaların mekanik bozukluk ikamet hemocytes gideri (Şekil 5) hemocytes dolaşımdaki nüfus dramatik bir artışa yol açmıştır. 45 dakikalık bir geri kazanım süresinden sonra, hemocytes büyük ölçüde görsel inceleme ile ve aynı hem kendi yapışan durumuna dönendolaşan hücrelerin değerlendirmeden geçirilmiş yüzdesi (Şekil 5D, E). Beklendiği gibi, toplam hemocyte numaraları dolaşan ve yerleşik nüfus arasındaki hemocytes vardiya rağmen, zamanla sabit kalmıştır.

Birkaç ek hususlar dikkate alınmıştır. Cam boncuklar, çeşitli zaman aralıklarında (1, 5, 20 dk), tripan mavisi (Sigma) varlığında yapıldı ile vorteks, ana doku hasarına neden olmadığını doğrulamak için, vorteks. 20 dakika süre ile girdap pozitif kontrol (Ek Şekil 1) olarak kullanılan iğne ilmek kaynaklanan hasar benzeyen, hasar küçük alanlarda neden Her iki 1 ve 5 dakika süre ile girdap, belirgin bir doku bozulmasına neden olmamıştır. Epidermis ya da manikür zarar vermeden diğer dokuların iç hasar göz ardı edilemez, ancak bu senaryo larva bütünlük ödün değildi düşündüren, 1 dakika ve 5 dakika tedavi edilen larva yeniden yapıştırılmış beklenen desen ve zaman çerçevesi içinde hemocytes olarak değil zor görünüyord (Ek Şekil 1). Bunun aksine, larva yeniden yapışma eksikliği muzdarip 20 dakika süre ile girdaplandı, ve daha önce ¹⁴ tarif edildiği gibi daha da epidermal yara sitelere hemocytes dolaşımdaki eki göstermemiştir.

Son olarak, yöntemin tekrarlanabilirliği göstermek için, biz ayrı denemecileri tarafından yapılmıştır Yukarıdaki iki deneylerin, 2.5 mm larvalarının biyolojik çoğaltır karşılaştırıldı. Ek, Şekil 2 'de gösterildiği üzere, her iki kohort karşılaştırılabilir toplam larva için hemocytes sayıları ve dolaşımdaki hemocytes yüzdesi gösterdi. Student t test yöntemi tekrarlanabilir ve geniş çapta uygulanabilir olduğunu düşündüren, istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi.

Şekil 1. Hemosit Bleed / kazıyın ve Bozulma Testi s etup ve şema. (A) Tek Resim Slayt Ayarı: 5X amacı ile görüntüleme için beş 2mm kareler (B) Çini Tarama Slayt Kurulum:. Görüntüleme kanın dört 3mm kareler / çini tarama mikroskobu ile ≤2.5 mm larvalarının sıyrıklar. Görüntüleme için önerilen hedefler 5X veya 10X. (C) / ImageJ kullanarak kazıyın Deneyi şematik ve elde edilen sayımsal havasını alın. (D) Bozucu Tahlili olan hemocyte desen mekanik cam boncuklar ile larvaların vorteks bozulur. Larvalar hemocytes Hematopoietik cepler yeniden bağlı sırasında 45 dakikalık bir süre boyunca iyileşmesine izin verilir. Hemocytes yapışkan özellikleri rahatsızlık sonrası dolaşımdaki hemocytes yüzdesini miktarının, bu yöntemle tespit edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

yolları ">
Şekil 2. Sızdırma / Pençe Deneyi dolaşan ve yerleşik hemocytes serbest bırakmak için. (A) larva kanamaya için, larva posterior ve anterior ucunda ventral kesi (makas sembol) yapılır. (B) Hemocytes kesiler dışarı akacak ve slayt yüzeyinde çözecek dolaşımda. (C) Lenf bezi (LG) bulunan ve onu delinmesiyle olmadan sıkıştırdılar edilir. Resident hemocytes batıcı ve / veya bir iğne ile larva kazınarak serbest bırakılır. Slaytta (D) Yerleşik hemocytes. (E, F) ikamet eden bütün hemocytes bırakılıncaya kadar kazıyın işlem tekrarlanır. Sağlam lenf bezi içeren larva karkas geride. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. ImageJ kullanarak hemocytes miktarının otomatik. (A, B) ImageJ bir hemocyte görüntü dosyası açtıktan sonra, alt eşik seviyesi görüntüdeki tüm hücreler için hesap ayarlanır. (C, D) Parçacıklar hücre piksel boyutu, dairesellik ve sonuç okuma ayar gerektirir Analiz biçimi (örneğin, Yerleşimi Anahatlar). (E) hemocytes sayısını gösteren Özeti penceresi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Temsilcisi Sonuçlar (1). Hemocyte numarası ve üzerinde ikamet devlet Larva gelişme elbette. (A) kullanılan larva evrelerinin Bakış; ^1. evre (48 sa AEL; ~ 1,2 mm uzunluk); ^2. evre (80 saat AEL, 2.5 mm uzunluğunda); ^3. instar (96 saat AEL; ~ 3.5 mm uzunluğunda). Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğu; O-GAL4. Aşamaları larva mouthhooks değerlendirerek teyit edildi. İlgili larva aşamasında dolaşan ve yerleşik hemocyte numaraları (B) Bar diyagramı. Hemocytes dolaşımdaki (C) yüzdesi. Dolaşımdaki hemocytes kesir larva gelişimi boyunca orantısız artar unutmayın. (D) Toplam hemocytes, larva başına dolaşan ve yerleşik hemocytes toplamından kaynaklanan. Hemocytes Silme / Pençe yöntemi kullanılarak ölçüldü; n ≥ 6 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Temsilcisi Sonuçlar (2). Hemocyte ikamet mekanik rahatsızlık etkileri. (AC) öncesi ve 45 dakika geri izledi cam boncuklar ile vorteks sonra larva Örnek (A) Hayır rahatsızlık kontrolü.; hemocytes Hematopoietik Cepler lokalizedir (B) kesintiye hemocyte desen 0 dak cam boncuklar ve su ihtiva eden bir süspansiyona larvaları vorteks sonrası iyileşme sonrası rahatsızlık 45 dakika (C) Hemosit şablonu..; Birçok hemocytes Hematopoetik Cepler taşındı var; genişletilmiş dorsal-damar ilişkili kümeleri ve erken post-rahatsızlık birikimi (oklar) baskın siteler dorsal çizgili not edin. Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğunu; O-GAL4 x yw. Boşaltma / Pençe yöntem ile nicelleştirilmiştir hemocytes dolaşımdaki (D) oranı. (E) toplam hemocytes, larva için sirkülasyon ve yerleşik hemocytes toplamından elde edilir. n ≥ 4 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular. Student t-testi önemini teyit etmek için, NS (önemli değil), ** (p ≤ 0.05), ** (0.01 ≤ p). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada, kantitatif tek Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücrelerini kurtarmak ve bu iki hemocyte popülasyonlarının ölçmek için ilk yöntem açıklanmaktadır. Protokol görüntüleme ve otomatik hücre sayımı ile takip dolaşım yerleşik kan hücrelerinin ardışık salınmasını içerir. 60 dakika iyileşme süresi ⁶ - Larva ikamet hemocytes geçici, mekanik bozukluk dolaşıma büyük ölçüde 30 içinde ters olduğu bilinen bir süreç mobilize edilebilir. Bu duruma göre, bu protokol, iki şekilde test edildi: (1) larva ve larva gelişimi boyunca hemocytes dolaşan fraksiyonu için toplam hemocyte sayısı değerlendirerek, ve (2) deneysel olarak otomatik bir yöntem kullanılarak yerleşik hemocytes çıkartılmasından, doğruladı hemocyte lokalizasyonu ve resident hemocyte sayısı ve dolaşımdaki nüfusun sıkı ilişki. Buna ek olarak, yöntem tekrarlanabilirliği co ile gösterilmiştirbiyolojik çoğaltır iki veri setleri mparing.

Geçmişte, laboratuvarlar larva hemocytes ^6,13,21 ölçmek için teknikler bir dizi kullandık. Bu protokol almak ve kolayca adapte platform sağlayan, Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücre popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart kurar. Açıklanan yöntem ikamet hemocytes ve mikroçevresinin rolü odaklanmak çalışmalar için önemlidir, Hematopoetik ^4-6 Cepler ve floresan proteini vahşi tip transgen taşıyan Drosophila suşları ve genetiği değiştirilmiş arka incelemek için uygundur. Protokol aynı zamanda ikamet hemocytes ya da ⁽⁴ gözden) toplam hemocyte sayısındaki değişim seferberliğini tetikleyen immün meydan okuma veya yaralanma ve genetik veya çevresel kaynaklı sinyalizasyon sonra hemocyte seferberlik odaklanmak çalışmalar için geçerlidir. Bu prematüre di durumlarda, belirtmek gerekir kiLenf bezi soy karşı embriyonik / larva ayırt fferentiation ve lenf bezinden hemocytes bırakma, kullanılan floresan hemocyte muhabiri ifadesi deseni ile sınırlı olabilir.

Burada sunulan protokol görüntüleme canlı, floresan etiketli hemocytes dayanır. Gelecekte, bu immünsitokimya kullanarak, örneğin, tespit sonrasında serbest hücrelerin tespit edilmesini sağlamak için modifiye edilebilir. Yöntem, hemocytes alma ve işleme ex izin verdiğinden, bu durumda, iletişim kuralı yapışma inkübasyon sürelerini arttırarak ve bu konkanavalin A gibi, yapışkan kayıcı kaplaması ile, örneğin kan hücrelerinin bir yapışma sağlamak için adapte edilmesi gerekebilir in vivo, bu gelişim, hücre biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar geniş bir fayda sağlayacaktır. Yerleşik ve dolaşımdaki kan hücreleri tüm Drosophila postembriyonik gelişim evreleri ve diğer omurgasızlar ²² suggesti sırasında bulunanng, bu yöntemin Adaptasyonun Drosophila larva hematopoietik sistem dışına çalışmalarda geniş bir fayda sağlayacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6cm/9cm Petri dishes			One for each genotype to be evaluated
Water squirt bottle
Metal spoon/spatula
Thin paintbrush			e.g. a "liner"
Glass cavity dish
PAP pen: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Glass slides			Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.
Moist chamber			This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom
Schneider’s Drosophila cell culture media	Invitrogen
Cold block			This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color
Two 1ml syringes with needles (27G ½)	Becton Dickinson		For dissections.
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)	Fine Science Tools
Glass beads, 212-600 micron	Sigma
2 ml Eppendorf tubes	Eppendorf		One per genotype evaluating
Vortex Mixer	Fisher Scientific
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.
Fluorescence dissecting microscope	Leica		Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module
Inverted fluorescence microscope with camera attachment	Leica or Keyence		With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)