Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

Résumé

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Résumé

Chez les vertébrés, l'hématopoïèse est régulée par micro-environnements inductifs (niches). De même, dans le modèle d'invertébrés organisme Drosophila melanogaster, des micro-environnements inductifs connus que des poches hématopoïétiques larvaires (HPS) ont été identifiés comme sites anatomiques pour le développement et la régulation des cellules sanguines (hémocytes), en particulier de la lignée macrophages auto-renouvellement. SPLI segmentaire répétée poches entre l'épiderme et les couches musculaires de la larve, qui comprennent également les neurones sensoriels du système nerveux périphérique. Dans la larve, résidents (hémocytes) sessiles sont exposés à des anti-apoptotique, un adhésif et des indices de prolifération de ces neurones sensoriels et potentiellement d'autres composants des HPs, tels que le muscle de revêtement et des couches epitheliales. Au cours du développement normal, libération progressive des hémocytes résidents de la SPLI carburants la population de hémocytes circulants, qui culmine dans la libération de most des hémocytes résidents au début de la métamorphose. Agressions immunitaire, une blessure physique ou perturbation mécanique déclenchent la libération prématurée de hémocytes résidents en circulation. Le commutateur de hémocytes larvaires entre les lieux de résidence et de circulation soulève la nécessité d'une norme / procédure commune pour isoler sélectivement et de quantifier ces deux populations de cellules de sang de larves de drosophile unique. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode automatisée pour libérer et de quantifier le résident et hémocytes circulant à partir de larves unique. La méthode facilite les approches ex vivo, et peut être adaptée pour servir une variété de stades de développement de la drosophile et d'autres organismes invertébrés.

Introduction

Recherche dans le modèle d'invertébrés Drosophila melanogaster a entraîné la découverte de l'immunité innée ^1, et a facilité la compréhension des différents aspects du développement de globules ^2-4. Drosophila hématopoïèse peut être divisé dans la lignée des hémocytes embryonnaires / larves, qui sont originaires de la embryon et se développer dans la larve, et la lignée des glandes lymphatiques hémocytes ^4,5. Ici, nous présentons un protocole qui se concentre sur la lignée des hémocytes embryonnaires / larvaire, qui, dans la larve de drosophile comprend principalement plasmatocytes (macrophages) et quelques cellules à cristaux ^4. Dans la larve, hémocytes de l'embryon persistent et colonisent poches segmentaire répétées et terminaux hématopoïétiques (SPLI) situées entre l'épiderme et les couches musculaires de la paroi du corps larvaire ^5,6. Sur la base de leur nature que les macrophages d'auto-renouvellement, leur résidence ⁶ prédominant dans microenvironnements tissulaires locales ⁶, 7, et leur lignée, dès les premiers globules émergents ^6,8 au cours du développement, cette population de cellules sanguines est considéré comme similaire à des macrophages tissulaires d'auto-renouvellement des vertébrés, une lignée myéloïde indépendant récemment identifiés dans une variété d'espèces ^4,9,10. Cependant, chez la drosophile, tout ou partie de ces cellules résidentes montrent également plasticité pour donner lieu à d'autres types de cellules sanguines telles que des cellules de cristal ^11,12.

Hémocytes larvaires sont principalement résident (sessiles), mais sont dans un état d'équilibre dynamique entre divers SPLI. Ils sont progressivement mises en circulation, en particulier ^la 3 ème stade larvaire approche de la nymphose ^5-7. Défis immunitaires, de blessures ou mécanique perturbation plomb à un prématuré, dans le dernier cas réversibles, la mobilisation des hémocytes résidents dans l'hémolymphe ^4,6,13.

Des études antérieures ont suggéré que résident et circulationhémocytes sont des larves de la même lignée, mais diffèrent dans leurs propriétés adhésives ou homing ^6,7,13,14. Isolement sélectif de circulation par rapport hémocytes résidents a révélé des niveaux élevés de la prolifération dans la population hémocytaire résident, suggérant leur exposition à des indices inductives de la SPLI larvaires HPs ^6. Drosophile sont bordées par l'épiderme et les couches musculaires et du port davantage les groupes de neurones sensoriels du système nerveux périphérique (PNS) et la fonction hépatique ressemblant oenocytes ^6. Fonctionnellement, les expériences d'ablation de cellules mutantes et génétiques ont démontré que les neurones sensoriels présents dans la SPLI, supportent la survie trophique et la localisation des hémocytes larvaires ^6.

Nous décrivons ici un procédé pour l'isolement et la quantification spécifique de résidents et les hémocytes circulant unique de larves de drosophile, et un protocole pour la mobilisation des hémocytes mécanique. Les procédés peuvent être utilisés pour l'ex vivoétude des hémocytes et peut en outre être adaptée à d'autres stades de développement chez la drosophile comme la nymphe et adulte, et d'autres systèmes d'invertébrés. Depuis les études précédentes ne distinguent pas entre les résidents et les hémocytes circulant, ce protocole fournit une norme commune pour l'étude de globules résidents et aidera à renforcer la cohérence de la recherche sur les cellules du sang invertébrés.

Premièrement, le hémocytaire purge / Scrape Assay décrit l'isolement différentiel et la quantification automatique des fluorescente résident de protéine marqué et la circulation des populations hémocytaires de larves de drosophile unique; le protocole prévoit deux options pour microscopes réguliers et de tuiles scan-équipés (Figure 1). En conséquence, le pourcentage d'hémocytes de circulation et le nombre total de larves par les hémocytes sont obtenus. La méthode repose sur des larves de Drosophila transgéniques qui expriment la protéine fluorescente entre leur globulespopulation. Le choix du pilote d'hémocytes ou reporter détermine le résultat, à savoir, que la population de cellules sanguines est visualisée et quantifiée. Pour étiqueter principalement les macrophages (plasmatocytes), qui constituent la grande majorité de la population résidente et circulant hémocytaire de la larve de drosophile ^6, transgènes appropriés comprennent Hml Δ-DsRed ^6, HmlΔ -GAL4 ^15, PXn -GAL4 ^16, CRQ-GAL4 (par H. Agaisse ^16), ou mangeur-GAL4 ^17; pour l'étiquetage de la relativement petite population de cellules de cristal, lignes appropriés sont BcF6-PCP et GFP ^18, ou LZ-GAL4 (J. Pollock ^19); pour lamellocytes d'étiquetage, un type de cellule spécialisée principalement induite par les défis immunitaires et blessures ^13, par exemple, MSNF9mo-mCherry peut être utilisé ^17. Certains pilotes transgéniques sont exprimés dans une gamme différenciée de sanget les progéniteurs des cellules, comme il - ²⁰ GAL4, qui marque environ 80% de toutes les cellules sanguines ²⁰ larves. S'il vous plaît noter que dans tous les cas où les conducteurs sont utilisés GAL4, combinaison avec UAS-GFP ou une autre protéine fluorescente UAS-transgène est nécessaire. Dans la section des résultats, cette méthode est utilisée pour surveiller le nombre de cellules du sang et le comportement de la circulation au cours du développement larvaire.

Deuxièmement, le hémocytaire Perturbation Assay décrit une étape précédente conçu pour détacher hémocytes résidents par manipulation externe, ce qui permet par la suite de l'évaluation de la capacité des hémocytes de ré-adhérer et à la maison à la SPLI dans un laps de temps limité (30 - 60 min) ^6. Généralement, ce test est suivi par la purge / Scrape test pour déterminer le pourcentage de circulation hémocytes par larve. Nous présentons un protocole simplifié pour cet essai (figure 1D), qui utilise la perturbation par vortex espritperles h de verre, plutôt que la manipulation d'une larve unique avec un pinceau comme décrit précédemment ^6. Dans la section des résultats, ce test est utilisé pour démontrer que transitoirement détaché flotteur hémocytes dans l'hémolymphe et peut être récupéré dans la fraction des hémocytes circulant. Le dosage est également utile pour quantifier les différences dans leur hémocytes de homing / adhérence aux sites de résidents, en comparant, par exemple, divers fonds génétiques ou des conditions de stimulation. S'il vous plaît noter que cette manipulation mécanique reflète un processus réversible et est distincte de la mobilisation des hémocytes de résident Infection ou blessures induites, qui ne sont généralement pas réversibles dans un court laps de temps ^4,13.

Protocole

1. hémocytaire purge / Scrape Assay

1. Préparation des lames:
   1. Option 1 pour les microscopes à balayage sans fonction de tuiles: Pour chaque larve à analyser, préparer une lame de verre avec environ cinq puits Pap-stylo carrés de 2 mm chacune, correspondant à la zone d'affichage de champ du microscope; ajouter environ 5 - 10 pi de milieu S2 à chaque (figure 1A). Gardez les diapositives dans la chambre humide pour éviter puits de se dessécher.
   2. Option 2 pour microscopes avec fonction de balayage de tuile: Pour chaque larve à analyser, préparer une diapositive en verre avec 3 à 4 puits Pap-stylo de ~ 3 - 4 mm carrés chacun; ajouter environ 15 - 20 pi de S2 médias à chaque puits (figure 1B). Gardez les diapositives dans la chambre humide pour éviter puits de se dessécher.
      REMARQUE: Le nombre de puits recommandé ci-dessus est suffisante pour les totaux de jusqu'à 3.000 hémocytes par larve (stade larvaire ² ème tard, ~ 2,5 à 3 mm de longueur, transgène étiquetage de la majorité des larval Les cellules sanguines). Lors de l'évaluation du nombre de cellules de sang de plus grandes, plus les puits pourraient être nécessaires pour éviter la surpopulation.
2. Collection de larves:
   1. Gicler l'eau dans un flacon contenant des larves de mouche et les larves de chasse dans une boîte de Pétri, ou ramasser un peu de nourriture qui contient larves dans une boîte de Pétri et diluer avec de l'eau à l'aide d'un vaporisateur.
   2. Doucement ramasser les larves de la boîte de Pétri aide d'un pinceau et les placer dans l'eau dans un plat creux ou sur une lame sur un bloc froid.
      REMARQUE: Les larves peut être maintenue pour une durée limitée dans l'eau ou sur un bloc froid; utiliser des spécimens dans les 45 minutes ou moins pour éviter la mort des larves ou des effets indésirables sur les hémocytes.
3. Dissection:
   1. Sélectionner larves sous un microscope à fluorescence sur un bloc de métal froid. Mesurer la taille et des larves d'image, si désiré.
   2. Isolement des hémocytes circulant ("Purger"):
      1. Une fois que les larves sont sélectionnés, placer une larve dans la première Pap-plume bien (figure 1C,2A).
      2. Utilisez 2 aiguilles propres ou des ciseaux et des pinces à dissection de faire une incision à la fois aux extrémités antérieures et postérieures de la larve. Pour éviter de déranger hémocytes résidents, il est préférable de faire ces incisions sur la face ventrale de la larve. Pour des résultats cohérents, faire les incisions dans les mêmes endroits pour chaque larve. Pour ^le 1er stade larvaire, une incision (dans la partie antérieure ventrale) est suffisante.
      3. Laisser larve à saigner pendant quelques secondes, sans aucune pression ou agitation physique (figure 2A).
         NOTE: Si vous travaillez sur plusieurs larves, il est préférable de faire ces incisions pour chacun d'eux avant de passer à l'étape suivante pour éviter de garder les larves sur la glace trop longtemps ce qui pourrait affecter l'intégrité des échantillons.
      4. Soulevez doucement la larve avec les aiguilles ou des pinces et le tremper dans le deuxième puits de rincer toute hémocytes circulant restants. Après cela, suivez avec la sortie de hémocytes résidents.
   3. Isolement de hémocytes résidents ("Scrape"):
      1. Transférer doucement la larve à l'autre bien (figure 2C).
      2. Identifier le ganglion lymphatique de la chenille, qui est généralement situé à environ 1/3 de l'extrémité antérieure de la chenille, et qui peut émettre une fluorescence à travers la paroi dorsale du corps larvaire. Évitez la glande lymphatique tout en libérant hémocytes résidents par épingler la larve avec une aiguille aussi près que possible de la glande lymphatique pour éviter la perforation (figure 2C).
         REMARQUE: Pendant le développement normal de la maturation des lymphatiques hémocytes de la glande est retardée par rapport à hémocytes larvaires, et les journalistes fluorescentes de hémocytes différenciés ne peut pas montrer un signal dans le ganglion lymphatique de jeunes larves. Dans ces cas, moins d'attention doit être accordée à la glande lymphatique que l'absence de contamination des différenciées hémocytes larvaires marqués par fluorescence par hémocytes des ganglions lymphatiques est attendu.
      3. Relâchez globules résidents dans un dissectisur le processus de grattage et / ou piquant. Utilisez une aiguille à cerner efficacement contre la larve près du ganglion lymphatique (voir ci-dessus) ou d'autres zones du corps comme nécessaire. Utilisez une autre aiguille pour piquer les grappes de hémocytes qui sont visibles à travers la paroi du corps des larves (figure 2C, E), visant à séparer les hémocytes. Hémocytes peut également être libéré dans un mouvement de raclage. Cependant, la déchirure de l'épiderme précoce peut libérer de grandes grappes de cellules sanguines, ce qui pourrait rendre plus difficile le comptage automatique.
         NOTE: Selon l'âge et le génotype de la larve, le nombre de hémocytes total variera. Distribuer le processus de libération décrit ci-dessus sur plusieurs puits pour éviter la surpopulation de certains puits avec des cellules de sang, ce qui pourrait faire seule analyse d'image de cellule plus difficile.
      4. Si quelques hémocytes restent dans la carcasse finale, compter ces hémocytes par l'observation au microscope et l'utilisation d'un manuel Tally Counter (figure 2E). Pour faciliter le comptage, placer la carcasse sur une surface propre de la même lame et l'étaler aussi finement que possible pour réduire le nombre de plans optiques.
      5. Une fois la dissection est complète, attendre entre 5 - 10 min pour les cellules sédimenter (mais pas nécessairement adhérer) avant l'imagerie des puits. Incuber la lame dans une chambre humide pour éviter le séchage, et d'éviter une manipulation brutale des diapositives, qui pourraient perturber les hémocytes installés.
         REMARQUE: Lors de la détermination chiffres hémocytaires, cellules libérées sont pas fixes et les cellules doivent être imagés peu de temps après la dissection, de préférence dans les 30 minutes après la sortie de la larve. Selon le volume de biens de moyennes et de la cellule, la grande majorité des cellules aura réglé dans les 5 - 10 min, ce qui devrait être confirmé en mettant l'accent à travers les plans optiques du milieu dans le puits. Cependant, seule une fraction de globules aura adhéré à la surface de glissement de ce temps, ce qui doit être pris en compte si la modification de ce protocole de base de fixation approache cellulaires.
4. Quantification:
   1. Prendre des images des hémocytes installés sous un microscope à fluorescence (Figure 2B, D, F). Suivez avec quantification des hémocytes en utilisant le logiciel ImageJ.
   2. Préparez-vous à l'image ImageJ comptage cellulaire algorithme:
      1. Ouvrir l'image des puits en utilisant ImageJ: Fichier → Ouvrir → (localiser le fichier et sélectionnez).
      2. Assurez-vous que l'image (s) est 8-bit ou 16-bit. Réglez le seuil de l'image en sélectionnant l'image puis cliquez sur Ajuster et sélectionnez Seuil. Observez la fenêtre "Seuil" (figure 3A).
      3. Cochez l'option "Arrière-plan foncé". Sélectionnez "Rouge" et augmenter le niveau de seuil inférieur (voir flèche noire) jusqu'à ce que chaque cellule dans l'image est marquée d'un point rouge (des cellules qui ne sont pas couverts on le verra en niveaux de gris; figure 3B). Comme le seuil inférieurest augmenté certaines cellules vont devenir banalisée. Cela peut être l'indicateur de la façon dont la mesure de fixer le seuil inférieur.
         NOTE: Parfois amas de cellules ne peuvent pas être résolus et seraient comptés comme un seul par le compteur de particules. Dans de tels cas, le nombre de cellules dans un cluster peut être estimée en examinant l'image (zoom avant si nécessaire) et le comptage manuel en utilisant un compteur de pointage. Alternativement, le seuil inférieur peut être augmentée pour résoudre des amas de cellules; toutes les cellules non marquées résultant de cette manipulation peuvent être comptées en utilisant un compteur de pointage.
   3. Analyser le nombre de cellules en utilisant ImageJ:
      1. Lancez l'analyseur de particules de compter les cellules (figure 3C). Sélectionnez Analyser et cliquez sur Analyser particules. Vous pouvez éventuellement sélectionner "Overlay Outlines" pour voir les particules le compte de l'algorithme (Figure 3D). Vous pouvez également définir une limite à la taille ou pixel de la zone d'une unité (par exemple,., Cellulaire, amas de cellules, etc.) pour l'algorithme de compter.
      2. Cliquez sur OK. Observer une fenêtre de résumé avec le comte (figure 3E).

2. hémocytaire Perturbation Assay

1. Pour perturber hémocytes, sélectionnez les larves et les placer dans un tube à centrifuger de 2 ml avec environ 0,5 g de billes de verre (212 - 600 um) et ajouter 0,5 ml d'eau.
2. Vortex le tube, à la main, à la vitesse de 10 pendant 1 min.
3. Récupérer les larves des perles de verre en renversant le contenu du tube à centrifuger dans une boîte de Pétri et à choisir les larves avec un pinceau.
4. Pour la phase de récupération, placez larves dans des boîtes de Pétri préalablement préparés avec de petites quantités de nourriture à la mouche. Laisser les larves de rétablir leur modèle hémocytaire pour une période de 45 min ou comme vous le souhaitez.
   REMARQUE: Jeter les larves qui ont cessé de bouger, car ils ont trouvé la mort dans le processus. Cependant, nous observons habituellement ldommages ittle après 1 min de vortex (voir ci-dessous et complémentaires Figure 1).
5. Après la période de récupération, continuer avec la purge / Scrape dosage comme décrit ci-dessus dans la section 1.

Résultats

Pour illustrer les résultats typiques des méthodes décrites, nous avons utilisé la première hémocytaire purge / Scrape Assay pour décrire la progression de numéros hémocytaires larvaires et leur résidence au cours du développement larvaire (Figure 4). Résident et circulant populations hémocytaires larvaires ont été isolés à partir de larves unique (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; He-GAL4 d'étiqueter la grande majorité des hémocytes des larves) et quantifiée en utilisant ImageJ. Cohortes de larves dimensionnés 1,2 mm (~ 48 h AEL ou 1 ^er stade larvaire), 2,5 mm (~ 80 h AEL ou tard ² ème stade), et de 3,5 mm (~ 96 h AEL ou 3 ^ème stade) ont été examinés (figure 4) . Numéros de hémocytaires élargi au cours du développement larvaire, en corrélation avec et dépassant les estimations précédentes basées sur la microscopie lumière de colorant teinté larves ^{7 et} comptage direct de protéine marquée hémocytes fluorescentes à travers la cuticule des larves ^6. Dans 1 ^st inslarves de goudron presque tous les hémocytes résidaient, tandis que la fraction des hémocytes circulant augmente progressivement au cours du développement larvaire (figure 4B, C), compatible avec les publications précédentes ^6,7.

Suivant nous avons examiné si la méthode surveille fidèlement la transition des hémocytes entre le résident et les populations circulent. Profitant du phénomène qui hémocytes résidents peuvent être transitoirement détachées par les perturbations mécaniques et ils ré-adhérer à leurs sites de résidents spontanément ^6, nous nous sommes dispersés hémocytes résidents par vortex avec des billes de verre comme décrit dans le hémocytaire Perturbation Assay. En effet, la perturbation mécanique des larves a conduit à une augmentation spectaculaire de la population de circuler hémocytes au détriment des hémocytes résidents (Figure 5). Après une période de 45 min de récupération, les hémocytes se sont largement retournés à leur état adhérent, à la fois par inspection visuelle et par le quesessed pourcentage de cellules circulantes (figure 5D, E). Comme prévu, les numéros hémocytaires totales sont restées stables dans le temps, malgré le décalage des hémocytes circulant entre les populations et les résidents.

Plusieurs considérations supplémentaires ont été prises en compte. Pour confirmer que vortex n'a pas causer d'importants dommages de tissu, vortex avec des billes de verre a été effectuée en présence de bleu Trypan (Sigma) pour diverses périodes de temps (1, 5, 20 min). Les deux 1 et 5 min vortex n'a pas provoqué de rupture des tissus évidente, tandis que 20 min vortex a abouti à de petites zones de dommages, ressemblant dommages causés par les points de suture de l'aiguille utilisée comme contrôle positif (Figure 1 supplémentaire). Alors que des dommages internes de l'épiderme ou d'autres tissus sans dommage de la cuticule ne peut être exclu, ce scénario semble peu probable que les hémocytes de 1 min et 5 larves re-adhéré le rythme attendu et le calendrier min-traitée, ce qui suggère l'intégrité des larves n'a pas été compromisd (Figure 1 supplémentaire). En revanche, les larves vortex pendant 20 min souffert d'un manque de ré-adhérence, et n'a même pas montrer l'attachement de circulation hémocytes aux sites de l'épiderme de la plaie, comme cela a été décrit précédemment ^14.

Enfin, afin de démontrer la reproductibilité de la méthode, nous avons comparé réplicats biologiques des larves de 2,5 mm à partir des deux expériences ci-dessus, qui ont été menées par les expérimentateurs distincts. Comme illustré sur la Figure 2 supplémentaire, les deux cohortes ont montré nombres totaux comparables d'hémocytes par larve et le pourcentage d'hémocytes circulants. T le test de Student a montré aucune différence statistiquement significative, ce qui suggère que la méthode est reproductible et largement applicable.

Figure 1. hémocytaire purge / Scrape et Perturbation Assay s ise et schématique. (A) simple Diapositive d'image Configuration: cinq carrés de 2 mm pour l'imagerie avec un objectif 5X (B) Tile Slide Setup numérisation:. Quatre places 3 mm pour l'imagerie purge / éraflures de ≤2.5 mm larves avec un microscope de balayage de tuiles. Objectifs recommandés pour l'imagerie sont 5X ou 10X. (C) Purger / Scrape Assay quantifications schématiques et résultant en utilisant ImageJ. (D) Dans la perturbation Assay, le motif de hémocyte est mécaniquement perturbé par vortex larves avec des perles de verre. Les larves sont autorisés à récupérer sur une période de 45 minutes au cours de laquelle hémocytes ré-adhérer aux poches hématopoïétiques. Les propriétés adhésives de hémocytes peuvent être évalués par cette méthode, quantifier le pourcentage de hémocytes en circulation après la perturbation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. purge / Scrape Assay pour libérer de circulation et hémocytes résidents. (A) Pour purger une larve, incisions ventrales aux postérieurs et antérieurs extrémités de la larve sont faits (ciseaux symbole). (B) Hémocytes en circulation iront sur ​​les incisions et de régler sur la surface de la lame. (C) Le ganglion lymphatique (LG) est situé et clouée au sol, sans le percer. Hémocytes résidents sont libérés en donnant des coups et / ou gratter la larve avec une aiguille. Hémocytes (D) de résidents sur diapositive. (E, F) Le processus est répété jusqu'à ce Grattez tous les hémocytes résidents sont libérés. La carcasse larvaire contenant le ganglion lymphatique intact est laissé pour compte. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. automatisé quantification des hémocytes utilisant ImageJ. (A, B) Après l'ouverture d'un fichier image hémocytaire dans ImageJ, le niveau de seuil inférieure est ajustée pour tenir compte de toutes les cellules de l'image. (C, D) analyser des particules nécessite le réglage de la taille de pixel de la cellule, la circularité, et le résultat de lecture format (par exemple, Overlay Outlines). (E) fenêtre Résumé affiche le nombre de hémocytes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Les résultats représentatifs (1). Numéro hémocytaire et l'état résident sur cours de développement larvaire. (A) Vue d'ensemble des stades larvaires utilisés; 1 ^er stade (48 h AEL; ~ longueur de 1,2 mm); ² ème (AEL 80 h; 2,5 mm de longueur) stade; ³ e stade (96 h AEL; ~ 3,5 mm de longueur). Génotype est Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Il GAL4. Étapes ont été confirmées par l'évaluation mouthhooks larvaires. (B) du diagramme à barres de circulation et les numéros hémocytaires résident au stade larvaire respectifs. (C) Pourcentage de hémocytes circulant. Notez que la fraction des hémocytes circulant augmente de manière disproportionnée au cours du développement larvaire. (D) Total des hémocytes, résultant de la somme de circulation et hémocytes résidents par larve. Hémocytes ont été quantifiés en utilisant la méthode de purge / Scrape; n ≥ 6 larves / état, barres d'erreur montrent écart type, les résultats confirmés en 3 expériences répétées indépendants.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Les résultats représentatifs (2). Effets de la perturbation mécanique sur la résidence hémocytaire. (AC) Exemple de chenille avant et après vortex avec des billes de verre, suivi par 45 min recouvrement (A) n contrôle de perturbation. hémocytes sont localisées dans les poches hématopoïétiques (B) motif de hémocyte perturbé à 0 min après vortex larves dans une suspension de perles de verre et de l'eau (C) motif hémocytaire à 45 minutes de récupération post-perturbation..; de nombreux hémocytes ont déménagé dans les poches hématopoïétiques; noter élargie dorsale-navire grappes associées et les rayures dorsales qui sont des sites prédominants de début de l'après-perturbation accumulation (flèches). Génotype est Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Il GAL4-x YW. (D) Pourcentage de hémocytes quantifiés par la méthode de purge / Scrape circulation. (E) Total des hémocytes, résultant de la somme de circulation et hémocytes résidents par larve. n ≥ 4 larves / état, barres d'erreur montrent écart type, les résultats confirmés en 3 expériences répétées indépendants. Test de student pour confirmer l'importance, NS (non significatif), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous décrivons la première méthode pour récupérer quantitativement cellules sanguines circulantes et résidents du simple larves de drosophile, et de quantifier ces deux populations hémocytaires. Le protocole comprend la libération séquentielle de circulation et résidentes cellules sanguines, suivie par l'imagerie et le comptage de cellules automatique. Hémocytes résidents larvaires peuvent être transitoirement mobilisés en circulation par les perturbations mécaniques, un processus qui est connu pour être largement inversée dans un 30 - min période de récupération de 60 ^6. Par conséquent, ce protocole a été testé dans deux façons, (1) en évaluant le nombre total de hémocyte par larve et la fraction de circulation hémocytes au cours du développement larvaire, et (2) en délogeant expérimentalement hémocytes résidents utilisant une méthode automatisée, qui a confirmé la corrélation étroite des hémocyte localisation et numéro de hémocyte dans la populations résidentes et de circulation. En outre, la reproductibilité de la méthode a été démontrée par la comparing deux ensembles de données de répétitions biologiques.

Dans le passé, les laboratoires ont utilisé une gamme de techniques pour quantifier hémocytes larves ^6,13,21. Ce protocole établit une norme commune pour récupérer et de quantifier les populations de cellules sanguines circulantes résidents et de larves de drosophile, en fournissant une plate-forme facilement adaptable. La méthode décrite est critique pour les études qui mettent l'accent sur ​​le rôle des hémocytes résidents et leur microenvironnement, hématopoïétique poches ^4-6, et est adapté pour étudier la protéine fluorescente souches de drosophile transgéniques porteurs de type sauvage et de milieux génétiquement modifiés. Le protocole est également pertinente pour les études qui mettent l'accent sur ​​la mobilisation des hémocytes après la provocation immunitaire ou des blessures, et la signalisation génétiquement ou dues à l'environnement qui déclenche la mobilisation des hémocytes résidents ou des changements de numéro de hémocyte totale (revue dans ^4). Il est à noter que, dans le cas de di prématuréfferentiation et la libération des hémocytes de la glande lymphatique, en distinguant embryonnaire / larves par rapport lignées des ganglions lymphatiques peuvent être limitées par le profil d'expression de la journaliste hémocytaire fluorescente utilisée.

Le protocole présenté ici repose sur l'imagerie en direct, hémocytes marqués par fluorescence. Dans le futur, il peut être modifié pour permettre la détection de cellules libérées après la fixation, par exemple, en utilisant l'immunocytochimie. Dans ce cas, le protocole peut devoir être adapté pour assurer une adhérence complète des cellules sanguines, par exemple en augmentant les temps d'adhérence d'incubation, et l'ajout d'adhésif revêtement de glissement, par exemple la concanavaline A. Etant donné que le procédé permet la récupération des hémocytes et leur manipulation ex vivo, il bénéficiera d'un large éventail d'études biologiques et biochimiques de développement, cellulaires. Cellules de résidents et de sang circulant sont constatées lors de toutes les étapes de développement de la drosophile postembryonnaires et autres invertébrés, ²² suggesting que l'adaptation de cette méthode bénéficiera d'un large éventail d'études au-delà du système hématopoïétique des larves de drosophile.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6cm/9cm Petri dishes			One for each genotype to be evaluated
Water squirt bottle
Metal spoon/spatula
Thin paintbrush			e.g. a "liner"
Glass cavity dish
PAP pen: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Glass slides			Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.
Moist chamber			This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom
Schneider’s Drosophila cell culture media	Invitrogen
Cold block			This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color
Two 1ml syringes with needles (27G ½)	Becton Dickinson		For dissections.
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)	Fine Science Tools
Glass beads, 212-600 micron	Sigma
2 ml Eppendorf tubes	Eppendorf		One per genotype evaluating
Vortex Mixer	Fisher Scientific
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.
Fluorescence dissecting microscope	Leica		Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module
Inverted fluorescence microscope with camera attachment	Leica or Keyence		With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)