Orthotopic הינד לימב השתלה בבית העכבר

Summary

מודל הרומן הזה להשתלה הגפיים האחוריות orthotopic בתוך העכבר, החלת טכניקה השרוול הלא תפר עבור השקה סופר-כלי הדם, מספק כלי רב עוצמה עבור מחקר אימונולוגי מכניסטית in vivo הקשורים אלוגרפט מרוכבים vascularized (VCA).

Abstract

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

Introduction

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ושימוש (JHUACUC). הנהלים הספציפיים בוצעו תחת MO13M108 פרוטוקול ACUC אושר.

מבצע התורם 1.

1. נהל שיכוך כאבים בנקודת הזמן המתאים לכל ניסוח תרופתי לפני ניתוח. על פי השימוש בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש אישרה 0.1 מ"ג / ק"ג BW של עצירות תת עורי 1 hr לפני החתך בעור.
2. התורם שלווה עם isoflurane מיושם באמצעות תא המצורף מאדה isoflurane ב 4%; לשמור הרגעה והרדמה ב -2% באמצעות חרטומו. בצע השתקפות נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על עומק ההרדמה לפני תחילתו של ההליך.
3. לובשים מסכות, שמלות בידוד הפנויה וכפפות.
4. לגלח את ar כירורגיתea, בפרט הגפה ובמפשעה האחוריות, ו prep עם 10% Povidone - יוד.
5. השתמש וילון שדה סטרילי, מכשירים autoclaved ו מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה (40X).
6. בצעו חתך עור במפשעה באמצעות מספרי proximally לאזור אמצע הירכיים ואת circumferentially לחבר את החתך כדי לתחום את הגפיים אחוריים משאר גוף העכבר.
7. זהה לנתח את עורק, וריד עצב הירך. הפרד כל שלושת המבנים באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו.
8. לאחר pedicle וסקולרית הוא גזור לחלק את הכלי ברמה של הרצועה מפשעתי באמצעות מספרי מייקרו.
9. לאחר מכן, ממשיכים לחלק את גחון הפרט (שרירי ירך gracilis המדיאלי) וקבוצות שרירים הגבו ²⁰ proximally ברמה של ירך האמצע להפריד השתל מן החיה התורמת באמצעות מספריים.
10. Transect הירך וגוזר באמצע פיר הירך באמצעות מספריים.
11. להרדים בעלי חיים על ידי fol מנת יתר isofluraneשאחריו נקע בצוואר הרחם. אשר הפסיק פעימה ונשימת לב.
12. שטוף את האיבר עם 2 מיליליטר heparinized (30 IE) קר (4 ° C) מלוח באמצעות מחט שטיפת G 33 רכובה על מזרק (ראה לוח חומרים).
13. מניח שרוול polyimide אחד על וריד, ועצם ירך, בהתאמה.
14. עוטפים השתל לתוך גזה צמר גפן רטוב, מקום בצלחת פטרי ולאחסן ב 4 ° C עד הבלעה.

2. נמען מבצע

1. הסרת הגפיים האחוריות
   1. נהל שיכוך כאבים בנקודת הזמן המתאים לכל ניסוח תרופתי לפני ניתוח. על פי השימוש בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים ושימוש אישרה 0.1 מ"ג / ק"ג BW של עצירות SC 1 hr לפני החתך בעור.
   2. התורם שלווה עם isoflurane מיושם באמצעות תא המצורף מאדה isoflurane ב 4%; לשמור הרגעה והרדמה ב -2% באמצעות חרטומו. בצע השתקפות נסיגת קמצוץ בוהן כדי לפקח על המחלקהשעות של הרדמה לפני תחילתו של ההליך.
   3. השתמש במשחה וטרינריים המשפיעים על העיניים של העכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
   4. לגלח את אזור הניתוח, ובמיוחד הגפיים האחוריות ובמפשעה מכין עם 10% Povidone - יוד.
   5. בצעו חתך עור במפשעה באמצעות מספרי proximally לאזור אמצע הירכיים ואת circumferentially לחבר את החתך כדי לתחום את הגפיים אחוריים משאר גוף העכבר.
   6. זהה לנתח את עורק הירך, וריד ועצב ולהפריד כל שלושת המבנים באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו.
   7. לאחר pedicle וסקולרית הוא גזור, מהדק את כלי הירך ברמה של הרצועה מפשעתי.
   8. חותכים את כלי דיסטלי ברמה של העורק ברום הבטן שטחית.
   9. לאחר מכן, ממשיכים לחלק את גחון הפרט (שרירי ירך gracilis המדיאלי) וקבוצות שרירים הגבו ²⁰ proximally ברמה של ירך האמצע להפריד את האחוריות li הילידיםMB מבעלי החיים לנמען באמצעות מספריים.
   10. Transect הירך באמצע פיר הירך באמצעות מספריים.
   11. לצרוב שרירי ירך transected בעבר כדי למנוע דימום של אתר לנתיחה ובכך איבוד דם נמען.
2. הַשׁרָשָׁה
   1. להקטין את איבוד הנוזלים על ידי להשקיית שדה הניתוח עם מלח חמים (37 מעלות צלזיוס) והזרקת 0.3 מ"ל תמיסת מלח חמים לפני ואחרי הניתוח.
   2. מניחים את השתל באופן המשקף את עמדת אנטומי מדויק של הגפיים האחוריות יליד ידי יישור עצם הירך של הנמען ואת השתל ולחבר אותם באמצעות מחט השדרה 20 G כמו מסמר תוך לשדי.
   3. Coapt קבוצות שרירים הגחון ועל הגב באמצעות חומר תפר נספג (6-0 Polysorb).
   4. חבר את כלי הירך באמצעות טכניקת השרוול-תפר הכללי; בפירוט, למשוך את הצד המקבל של כלי שיט על האזיקים רכובים בעבר על הכלי המסתיים של גרףt. השתמש תפר 10-0 ניילון ולבצע עניבה היקפית כדי לתקן את ספינת הנמען על השרוול.
   5. הבא לשחרר את המלחציים. בשלב זה לוודא ויזואלית סיבוב שרוול ומיצוב אופטימלי כדי למנוע אי-סיבוב מסתלסל של הכלים.
   6. בצע המוסטאסיס מוקפד באמצעות כוויית אלקטרו עם דגש מיוחד על הממשק התורם למקבל השריר ואת קצות העצם.
   7. סגור את העור באמצעות תפרים ניילון שאינם נספגים (6-0 Ethilon).
   8. לקבוע תנאי normothermic בכך שהוא מאפשר את החיה להתאושש בכלוב שלה תחת מנורת חימום. המשך מעקב שוטף לפחות 4 שעות לפני חזרת אותו למוקד הדיור.
   9. לספק שיכוך כאבים שלאחר הניתוח עם עצירות במינון של 0.1mg / kg SC כל 6-8 שעות במשך 3 ימים.

תוצאות

Performing אלוגרפט מרוכבים vascularized במודל של עכברים באמצעות טכניקה השרוול הלא תפר מאפשר להשיג הישרדות השתל ובעלי חיים טווח מצוין וארוך כפי שמוצג באיור 1. יתר על כן, הוא מייצג שיטה אמינה לקבל תוצאות לשחזור של דחייה של השתל הדרגתית מרוכבים ...

Discussion

Vascularized Composite אלוגרפט, כגון גפיים עליונים והשתלות פן לשיקום פגמי רקמות הרסניות, התפתח כאפשרות טיפול תקפה בחולים לא amendable להליכים שיקומיים קונבנציונליים. התקדמות טכנית בתחום המיקרו-כירורגיה לשחזור וכן ניסיון רב עם אימונוסופרסיבי החזק וטיפולי modulatory חיסוניים בהשתלות א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy