Fare Ortotopik Hind Ekstremite nakli

Özet

Süper mikrovasküler anastomoz olmayan bir dikiş manşet tekniği uygulayarak fare ortotopik arka uzuv nakli için bu yeni model, vaskülarize kompozit doku yamasında (VCA) ile ilgili in vivo mekanik immünolojik araştırmalar için güçlü bir araç sağlar.

Özet

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

Giriş

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

Protokol

Bütün deneyler Bakım ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca yapılmıştır ve Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (JHUACUC) tarafından onaylanmıştır. Belirli prosedürler onaylı ACUC protokol MO13M108 altında gerçekleştirildi.

1. Donör Operasyonu

1. her cerrahi işlem öncesinde farmakolojik formülasyon için uygun zaman noktasında analjezi yönetmek. 0.1 mg buprenorfin subkutan / kg BW 1 saat önce cilt kesisi ile onaylanan hayvan bakımı ve kullanımı protokol kullanımı başı olarak.
2. izofluran ile sakin donör% 4 bir izofluran buharlaştıncıya bağlı bir bölme yoluyla uygulanan; Bir burun konisi ile% 2 sedasyon ve anestezi korumak. prosedürün başlatılması öncesinde anestezi derinliği izlemek için ayak tutam çekilme yansıma gerçekleştirin.
3. maskeler, tek kullanımlık izolasyon önlük ve eldiven giyin.
4. Cerrahi ar Tıraşea,% 10 Povidon özellikle arka bacak ve kasık ve hazırlık içinde - İyot.
5. steril bir alan drape, otoklava aletleri ve yüksek büyütme mikroskobu (40X) kullanın.
6. orta uyluk bölgesine proksimale makas kullanılarak kasık deri kesi yapmak ve çevresel fare vücudun geri kalanından arka ekstremite ayırmak için kesi bağlayın.
7. Belirlemek ve femoral arter, ven ve sinir teşrih. forseps ve mikro-makas kullanılarak her üç yapıları ayırın.
8. Vasküler pedikül disseke edildikten sonra mikro makas kullanarak inguinal ligament seviyesinde gemileri bölün.
9. Sonraki, makas kullanılarak donör hayvandan grefti ayırmak için orta uyluk düzeyinde proksimale bireysel ventral (gracilis ve medial uyluk kasları) ve dorsal kas gruplarını ²⁰ bölünmeye devam.
10. femur transect ve makas kullanılarak femur şaftının orta kesilir.
11. izofluran doz aşımı fol tarafından hayvan Euthanizeservikal dislokasyon ile izin verilmelidir. kalp atışı ve solunum durması onaylayın.
12. bir şırınga üzerine monte edilmiş bir 33 G iğne kullanılarak temizleme ile heparinize 2 ml (30 IE) soğuk (4 ° C) tuzlu su ile uzvu yıkayın (Malzeme Tablo).
13. sırasıyla, femoral ven ve arter üzerinde bir poliimid manşet yerleştirin.
14. içerlek kadar 4 ° C'de petri ve mağaza ıslak pamuk gazlı bez, yerine greft sarın.

2. Alıcı Operasyonu

1. Arka bacak çıkarılması
   1. her cerrahi işlem öncesinde farmakolojik formülasyon için uygun zaman noktasında analjezi yönetmek. onaylanmış hayvan bakım ve kullanım protokolü kullanımı Buprenorfin SC 1 saat önce cilt kesisi 0.1 mg / kg BW başı olarak.
   2. izofluran ile sakin donör% 4 bir izofluran buharlaştıncıya bağlı bir bölme yoluyla uygulanan; Bir burun konisi ile% 2 sedasyon ve anestezi korumak. borç izlemek için ayak tutam çekilme yansıma gerçekleştirinprosedürünün başlamasından önce anestezi H.
   3. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için fare gözleri veteriner merhem kullanın.
   4. Özellikle,% 10 Povidon ile arka uzuv ve kasık ve hazırlık cerrahi alan tıraş - İyot.
   5. orta uyluk bölgesine proksimale makas kullanılarak kasık deri kesi yapmak ve çevresel fare vücudun geri kalanından arka ekstremite ayırmak için kesi bağlayın.
   6. forseps ve mikro-makas kullanılarak her üç yapıların belirlenmesi ve femoral arter, ven ve sinir incelemek ve ayırın.
   7. Vasküler pedikül disseke sonra, inguinal ligament seviyesinde femoral damarlar kelepçe.
   8. yüzeyel epigastrik arter düzeyinde uzak gemileri kesin.
   9. Sonraki, yerli arka li ayırmak için proksimal orta uyluk düzeyinde bireysel ventral (gracilis ve medial uyluk kasları) ve dorsal kas gruplarını ²⁰ bölünmeye devammakas kullanılarak alıcı hayvanlardan mb.
   10. makas kullanarak femur şaft ortasında femur transect.
   11. Diseksiyon sitenin kanama ve böylece alıcı kan kaybını önlemek için önceden kesilen uyluk kasları dağlamak.
2. aşılama
   1. ılık serum fizyolojik (37 ° C) ile ameliyat alanını sulama ve daha önce 0.3 ml ılık tuzlu enjekte edilerek ve ameliyat sonrası sıvı kaybını en aza indirmek.
   2. Alıcının ve greft femur kemiği hizalayarak ve bir intramedüller rod olarak 20 G spinal iğne kullanarak bağlayın tarafından yerli arka bacak doğru anatomik pozisyonunu yansıtacak şekilde greft yerleştirin.
   3. Coapt emilebilir sütür materyali (6-0 polisorb) kullanılarak ventral ve dorsal kas gruplarını.
   4. olmayan dikiş manşet tekniği kullanılarak femoral damarlar bağlayın; manşetler önce geminin üzerine monte üzerinde ayrıntılı olarak, graf uçları geminin alıcı tarafını çekint. Bir 10-0 Naylon sütür kullanın ve manşet üzerine alıcı gemi düzeltmek için bir çevresel kravat gerçekleştirin.
   5. Sonraki mandalları. Bu aşamada görsel manşet rotasyon ve gemilerin yanlış dönme ve bükülmesini önlemek için en uygun konumlandırma doğrulayın.
   6. kas alıcı verici arayüzü ve kemik uçlarında özel bir odaklanma ile elektro koter kullanılarak titiz hemostaz gerçekleştirin.
   7. emilmeyen Naylon dikişler (6-0 etilon) kullanarak cilt kapatın.
   8. hayvan bir ısıtma lambası altında kafes içinde kurtarmak için izin vererek normotermik koşulları kurmak. konut tesisine dönmeden önce en az 4 saat süreyle düzenli izleme devam edin.
   9. 3 gün boyunca 0.1 mg / kg SC 6-8 saat arasında bir dozda buprenorfin ile ameliyat sonrası analjezi sağlar.

Sonuçlar

Olmayan bir ameliyat dikiş ipliği manşon tekniğiyle bir fare modelinde vaskülarize kompozit allotransplantasyon ve ototransplantasyon gerçekleştirme Şekil 1 'de gösterildiği gibi, çok iyi ve uzun süreli greft ve hayvan yaşam elde sağlar. Ayrıca, vaskülarize kompozit kademeli allogreft reddinin tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için güvenilir bir yöntem temsil allotransplantasyon Şekil 2'de gösterilen görüntü ile belirti...

Tartışmalar

Vaskülarize Kompozit allotransplantasyon, bu tür yıkıcı doku defektlerinin rekonstrüksiyonu için üst ekstremite ve yüz naklinin olarak, geleneksel rekonstrüktif prosedürlere amendable değil hastalar için geçerli bir tedavi seçeneği olarak ortaya çıkmıştır. Rekonstrüktif mikrocerrahi alanında teknik gelişmeler yanı sıra güçlü bağışıklık baskılayıcı ve solid organ transplantasyonu, bağışıklık düzenleyici tedaviler ile geniş bir deneyim, şimdi bu eşsiz hasta popülasyonunda

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy