마우스에서 소성을 뒷다리 이식

요약

슈퍼 미세 혈관 문합을위한 비 봉합 커프 기술을 적용 마우스에서 소성을 뒷다리 이식이 새로운 모델은, 혈관 복합 동종 이식 (VCA)에 관한 생체 역학적 면역 학적 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다.

초록

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

서문

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

프로토콜

모든 실험은 관리 및 국립 보건 연구소 (NIH)의 실험 동물의 사용을위한 설명서에 따라 실시하고, 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회 (JHUACUC)에 의해 승인되었다. 구체적인 절차는 승인 ACUC 프로토콜 MO13M108 하에서 수행 하였다.

1. 기부자 운영

1. 수술하기 전에 각각의 약리학 적 제제에 대한 적절한 시점에서 진통을 관리. 0.1 mg의 프레 노르 핀의 피하의 / kg BW 1 시간 전에 피부 절개에 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜 사용에 따라.
2. 이소 플루 란 침착 도너 4 %의 이소 플루 란 기화기에 부착 된 챔버를 통해인가; 코 콘을 통해 2 %에 진정 및 마취을 유지한다. 절차의 개시에 앞서 마취 깊이를 모니터링하도록 발가락 핀치 움츠림 반사를 수행한다.
3. 마스크, 일회용 절연 가운과 장갑을 착용 할 것.
4. 수술 아칸소 쉐이브개, 10 % 포비돈과 특히 뒷다리와 사타구니, 그리고 준비에 - 요오드.
5. 멸균 필드 드레이프, 멸균 장비 및 고배율 현미경 (40X)를 사용합니다.
6. 허벅지 중간 영역 근위 가위를 사용하여 고간 피부 절개를 원주 마우스 본체의 나머지 뒷다리를 구별하기 위해 절개를 연결한다.
7. 식별 및 대퇴 동맥, 정맥 신경을 해부하다. 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 세 가지 구조를 분리합니다.
8. 척추 경 혈관이 절개되면 마이크로 가위를 사용 사타구니 인대의 수준에서 혈관을 나눈다.
9. 다음에, 가위를 사용하여 공여체 동물의 그래프트 별도 허벅지 중간 레벨에서 근위 개별 복부 (박근 및 내측 대퇴부 근육) 및 척수 근육 그룹 ^(20)을 분할하는 것을 계속한다.
10. 대퇴골을 가로로 쪼개다 가위를 사용하여 대퇴골 간부의 중간에서 절단.
11. 이소 플루 란 과다 복용 FOL로 동물을 안락사자궁 전위에 의해 lowed. 심장 박동 및 호흡의 중단을 확인합니다.
12. 주사기에 장착 된 33 G 플러싱 바늘을 사용하여 헤파린 2 ㎖ (30 IE) 감기 (4 °에 C) 식염수 사지를 플러시 (재료 표 참조).
13. 각각 대퇴 정맥과 동맥에 한 폴리이 미드 커프를 배치합니다.
14. 삽입 할 때까지 4 ° C에서 배양 접시와 저장소에 젖은면 거즈, 장소에 이식 랩.

2.받는 사람 운영

1. 뒷다리의 제거
   1. 수술하기 전에 각각의 약리학 적 제제에 대한 적절한 시점에서 진통을 관리. 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜 사용 부 프레 놀핀 SC 1 시간 이전에 피부 절개 0.1 ㎎ / ㎏ BW에 따라.
   2. 이소 플루 란 침착 도너 4 %의 이소 플루 란 기화기에 부착 된 챔버를 통해인가; 코 콘을 통해 2 %에 진정 및 마취을 유지한다. 부서를 모니터링 발가락 핀치 철수 반사를 수행절차의 개시에 앞서 마취 H.
   3. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의학 연고를 사용합니다.
   4. 특히, 10 % 포비돈와 뒷다리와 사타구니 준비를 외과 영역을 면도 - 요오드.
   5. 허벅지 중간 영역 근위 가위를 사용하여 고간 피부 절개를 원주 마우스 본체의 나머지 뒷다리를 구별하기 위해 절개를 연결한다.
   6. 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 세 가지 구조를 확인하고 대퇴 동맥, 정맥 신경을 해부와 구분합니다.
   7. 척추 경 혈관이 절개되면 사타구니 인대 레벨 대퇴부 혈관 클램프.
   8. 표면 상복부 동맥의 수준에서 말초 혈관을 잘라.
   9. 다음으로, 고유 뒷 리튬을 분리 근위 대퇴부의 중간 레벨에서 개별 복부 (박근 및 내측 대퇴부 근육) 및 척수 근육 그룹 ^(20)을 분할 계속가위를 사용하여 동물로부터받는 MB.
   10. 가위를 이용하여 대퇴골 축의 중간 대퇴골 횡단면.
   11. 절개 부위의 출혈 때문에받는 혈액 손실을 방지하기 위해 이전에 횡단 허벅지의 근육을 소작.
2. 심기
   1. 따뜻한 식염수 (37 °에 C)와 수술 필드를 관개하고 이전에 0.3 ml의에게 따뜻한 식염수를 주입하고 수술 후 유체 손실을 최소화합니다.
   2. 받는 사람과 이식의 대퇴골 뼈를 정렬하고 골수로드로 20 G 척추 바늘을 사용하여 연결하여 기본 뒷다리의 정확한 해부학 적 위치를 반영하는 방법으로 이식을 놓습니다.
   3. Coapt 흡수성 봉합사 (6-0 Polysorb)을 이용하여 복부 및 척수 근육 그룹.
   4. 비 봉합 커프 기술을 사용하여 대퇴 혈관 연결; 커프 이전 용기에 장착 위에 상세히, 그라프 끝 용기의 수신자 측 당겨티. 10-0 나일론 봉합사를 사용하고 팔목에받는 용기를 해결하기 위해 원주 넥타이를 수행합니다.
   5. 다음 클램프를 놓습니다. 이 단계에서 시각적 커프 회전 용기의 오 회전 및 꼬임을 방지하는 최적의 위치를​​ 확인.
   6. 근육받는 도너 인터페이스 뼈 단부에 특히 초점을 전기 소작을 사용 세심한 지혈을 수행한다.
   7. 비 흡수성 나일론 봉합사 (6-0 에틸 론)를 사용하여 피부를 닫습니다.
   8. 동물이 가열 램프 아래의 새장에 복구 할 수 있도록하여 정상 체온 조건을 설정합니다. 주택 시설에 반환하기 전에 적어도 4 시간 동안 정기적 인 모니터링을 계속합니다.
   9. 3 일간를 0.1 mg / kg SC마다 6 ~ 8 시간의 용량 부 프레 놀핀와 수술 후 진통제를 제공합니다.

결과

비 봉합 커프 기술을 사용하여, 마우스 모델에서 혈관 복합 동종 이식을 수행하는도 1에 도시 된 바와 같이 우수한 장기 이식 동물의 생존을 달성 할 수있다. 또한,이 혈관 복합 점진적 동종 이식 거부 반응의 재현 가능한 결과를 수득하는 신뢰할 수있는 방법을 나타낸다 동종 이식도 2에 도시 이미지에 의해 설명 된대로. 거절 더이 쥐 모델에서 동...

토론

혈관 복합 동종 이식은 이러한 파괴적인 조직 결손의 재건을위한 상지 및 얼굴 이식으로, 기존의 재건 절차를 수정할 수있는없는 환자에 대한 올바른 치료 옵션으로 진화하고있다. 재건 미세 분야의 기술 발전뿐만 아니라 강력한 면역 억제 및 고체 장기 이식에서 면역 조절 성 치료와 광대 한 경험은 지금이 독특한 환자 인구 ^3,21에서 장기 이식 생존 할 수 있습니다. 그러나, 동종 이식 유?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy