Orthotopische Hind Gliedmaßen Transplantation in der Maus

Zusammenfassung

Dieses neuartige Modell für orthotoper hinteren Gliedmaßen Transplantation in der Maus, eine nicht-Naht Manschette Technik für supermikrovaskulären Anastomose Anwendung bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die in-vivo-mechanistisch zu vaskularisiert Verbund Allotransplantationen bezogene immunologische Forschung (VCA).

Zusammenfassung

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

Einleitung

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health (NIH) durchgeführt und wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee (JHUACUC) zugelassen. Die spezifischen Verfahren wurden im Rahmen der genehmigten ACUC Protokoll MO13M108 durchgeführt.

1. Spender Betrieb

1. Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin subkutan 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
2. Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen toe pinch Entzugs Reflexion der Narkosetiefe vor der Einleitung des Verfahrens zu überwachen.
3. Tragen Masken, Einweg-Isolation Kleider und Handschuhe.
4. Rasieren Sie die chirurgische area, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und die Vorbereitungs mit 10% Povidon - Jod.
5. Verwenden Sie einen sterilen Bereich drapieren, autoklaviert Instrumente und eine hohe Vergrößerung Mikroskop (40x).
6. Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
7. Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren. Trennen Sie alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
8. Sobald der Gefäßstiel seziert wird teilen die Schiffe auf dem Niveau des Leistenbandes mittels Micro-Schere.
9. Mit einer Schere nächstes weiterhin die einzelnen ventral (gracilis und mediale Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen ²⁰ proximal auf dem Niveau der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen, das Transplantat aus dem Spendertier zu trennen.
10. Durchschneiden den Oberschenkelknochen und schneiden in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
11. Euthanize Tier von Isofluran Überdosis followed durch Genickbruch. Bestätigen Einstellung von Herzschlag und Atmung.
12. Spülen Sie das Glied mit 2 ml Heparin (30 IE) Kälte (4 ° C) Kochsalzlösung unter Verwendung einer 33 G Spülung Nadel auf einer Spritze befestigt (siehe Materialien Tabelle).
13. Legen Sie eine Polyimid-Manschette auf die Oberschenkelvene und Arterie, respectively.
14. Wickeln Transplantat in nassen Baumwollgewebe, in Petrischale und lagern bei 4 ° C bis zum Einsatz.

2. Empfänger Betrieb

1. Entfernen des Hind Gliedmaßen
   1. Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin SC 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
   2. Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen Zehe Prise Rückzug Reflexion der Abteilung zu überwachenh der Anästhesie vor der Einleitung des Verfahrens.
   3. Verwenden Veterinär Salbe auf die Augen der Maus Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
   4. Rasieren Sie die OP-Bereich, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und prep mit 10% Povidon - Jod.
   5. Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
   6. Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren und trennen alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
   7. Sobald der Gefäßstiel seziert wird, klemmen die Oberschenkelgefäße auf der Ebene des Leistenbandes.
   8. Schneiden Sie die Gefäße distal auf der Ebene der oberflächlichen Oberbauchschlagader.
   9. Danach setzen die einzelnen ventralen (gracilis und medialen Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen ²⁰ proximal auf Höhe der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen die native Hinter li zu trennenmb aus den Empfängertieren mit einer Schere.
   10. Durchschneiden den Oberschenkelknochen in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
   11. Cauterize zuvor durchtrennten Oberschenkelmuskulatur Entlüften der Präparation Website zu verhindern und somit Verlust Empfängerblut.
2. Implantation
   1. Minimieren des Flüssigkeitsverlusts durch das Operationsfeld mit warmer Kochsalzlösung Bewässerung (37 ° C) und 0,3 ml warmer Kochsalzlösung Injektion vor und nach der Operation.
   2. Legen Sie das Transplantat auf eine Weise, die genaue anatomische Lage des Mutter hinteren Gliedmaßen reflektiert durch den Oberschenkelknochen des Empfängers ausgerichtet und das Transplantat und verbinden sie eine 20 G Spinalnadel als Markstab verwenden.
   3. Coapt die ventralen und dorsalen Muskelgruppen resorbierbares Nahtmaterial (6-0 Polysorb).
   4. Schließen Sie die Oberschenkelgefäße die nicht-Naht Manschette Technik; im Detail, die Empfängerseite des Schiffes ziehen über vorher die Handschellen an der Gefäßenden der graf montiertt. Verwenden Sie einen 10-0 Nylonfaden und führen eine umlaufende Bindung der übernehmenden Schiff auf der Manschette zu befestigen.
   5. Release im nächsten die Klammern. In diesem Stadium visuell Manschette Rotation und optimale Positionierung überprüfen mis-Rotation und Abknicken der Gefäße zu verhindern.
   6. Führen sorgfältige Blutstillung mittels Elektrokauter mit einem besonderen Fokus auf den Muskel Empfänger Geberschnittstelle und den Knochenenden.
   7. Schließen Sie die Haut mit nicht-resorbierbaren Nylonnähten (6-0 Ethilon).
   8. Stellen normothermic Bedingungen, indem man das Tier in seinem Käfig unter einer Wärmelampe zu erholen. Weiter regelmäßige Überwachung für mindestens 4 Stunden, bevor es mit dem Gehäuse Anlage zurück.
   9. Geben postoperative Analgesie mit Buprenorphin in einer Dosis von 0,1 mg / kg SC alle 6-8 Stunden für 3 Tage.

Ergebnisse

Darstellende vaskularisierten Verbund Allotransplantation in einem Maus-Modell eine nicht-Nahtmanschette Technik ermöglicht eine ausgezeichnete und langfristige Transplantat und das Überleben der Tiere zu erzielen, wie in 1 gezeigt ist. Darüber hinaus ist es, ein zuverlässiges Verfahren zum Erhalten reproduzierbarer Ergebnisse der schrittweisen Transplantatabstoßung in vaskularisierten Verbund darstellt Allotransplantation wie durch die Bilder dokumentiert in

Diskussion

Vaskularisierte Verbund Allotransplantation, wie der oberen Extremitäten und im Gesicht Transplantation für den Wiederaufbau der verheerenden Gewebedefekten hat sich als eine gültige Behandlungsmöglichkeit entwickelt für Patienten, die nicht abänderbar zu herkömmlichen rekonstruktive Eingriffe. Der technische Fortschritt im Bereich der rekonstruktiven Mikrochirurgie sowie eine langjährige Erfahrung mit immunsuppressiven und immunmodulatorischen Therapien im Bereich der Organtransplantation, ermöglicht jetzt lan...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy