マウスで同所後肢移植

要約

超微小血管吻合のための非縫合カフ技術を適用したマウスにおける同所後肢移植のためのこの新規モデルは、血管新生複合同種移植（VCA）に関連したin vivoでのメカニズムの免疫学的研究のための強力なツールを提供します。

要約

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

概要

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

プロトコル

全ての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M108下で行いました。

1.ドナー操作

1. 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の世話のとおりと前皮膚切開にブプレノルフィン皮下に1時間の0.1ミリグラム/キログラムBWプロトコルの使用を使用します。
2. イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。手続きの開始に先立って麻酔深度を監視するためにつま先ピンチ撤退反射を実行します。
3. マスク、使い捨ての分離ガウンと手袋を着用してください。
4. 外科的ARを剃りますEA、特に後肢と鼠径部、および10％のポビドンで準備を - ヨウ素。
5. 滅菌野ドレープ、オートクレーブ処理機器や高倍率顕微鏡（40X）を使用します。
6. 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
7. 大腿動脈、静脈や神経を特定し、解剖。鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を分離します。
8. 血管茎を解剖したら、マイクロはさみを使用して、鼠径靱帯のレベルで血管を分割します。
9. 次に、はさみを使用して、ドナー動物からの移植片を分離するために半ば腿のレベルで近位個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群^20を分割し続けます。
10. 大腿骨を横断し、はさみを使用して大腿骨シャフトの中間で切断。
11. イソフルラン過剰摂取FOLにより動物を安楽死させます頚椎脱臼が続き。心拍や呼吸の停止を確認してください。
12. 注射器に取り付けられた33のGフラッシング針を使用してヘパリン化2ミリリットル（30 IE）の冷（4℃）生理食塩水で手足をフラッシュ（材料表を参照してください）​​。
13. それぞれ、大腿静脈と動脈に1ポリイミドカフを配置します。
14. インセットまで湿った綿ガーゼ、4℃でペトリ皿や店舗内の所定の場所に移植片をラップします。

2.受信者の操作

1. 後肢の除去
   1. 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の管理と使用プロトコルを使用ブプレノルフィンSC 1時間前に皮膚切開の0.1ミリグラム/ kg体重あたりとして。
   2. イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。 DEPTを監視するために、つま先のピンチ撤退の反射を行います手続きの開始に先立って麻酔の時間。
   3. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を使用してください。
   4. 特に、10％ポビドンと後肢と脚の付け根と準備を手術領域を剃る - ヨウ素。
   5. 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
   6. 鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を特定し、大腿動脈、静脈や神経を解剖し、分離します。
   7. 血管茎を解剖したら、鼠径靱帯のレベルで大腿血管をクランプします。
   8. 浅腹壁動脈のレベルで遠位血管をカットします。
   9. 次に、ネイティブ後肢リチウムを分離するために、近位に半ば腿のレベルで個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群^20を分割し続けますはさみを使用して、レシピエント動物からMB。
   10. はさみを使用して大腿骨シャフトの中央に大腿骨を横断。
   11. 切開部位の出血、したがってレシピエントの血液損失を防止するために、以前に離断大腿部の筋肉を焼灼。
2. 移植
   1. 温かい生理食塩水（37°C）で術野を灌漑し、操作の前と後の0.3ミリリットル暖かい生理食塩水を注入することにより、流体の損失を最小限に抑えます。
   2. 受信者の大腿骨と移植片を整列させることによって、ネイティブ後肢の正確な解剖学的位置を反映し、髄内ロッドとして20 G脊髄針を使用してそれらを接続する方法で、移植片を置きます。
   3. 吸収性縫合糸材料（6-0ポリソーブ）を使用して癒合腹側と背側の筋肉群。
   4. 非縫合カフ技術を用いて大腿血管を接続します。詳細に、以前グラーフの容器端部に取り付けられたカフの上に容器の受信者側を引っ張りますトン。 10-0ナイロン縫合糸を使用し、袖口に受信者の容器を固定するために、円周ネクタイを行います。
   5. 次のクランプを解放します。この段階で視覚的にカフ回転および血管の誤回転やねじれを防止するための最適な位置を確認します。
   6. 筋肉の受信者ドナーインターフェースと骨の両端を中心とした電気メスを使用して細心の止血を行います。
   7. 非吸収性ナイロン縫合糸（6-0 Ethilon）を用いて皮膚を閉じます。
   8. 動物は加熱ランプの下で、そのケージに回復できるようにすることで、正常体温条件を確立します。住宅施設に戻す前に、少なくとも4時間、定期的なモニタリングを続けます。
   9. 3日間は0.1mg / kgをSC毎に6-8時間の用量でブプレノルフィンと術後鎮痛を提供します。

結果

非縫合カフ技術を用いて、マウスモデルにおいて血管新生複合同種移植を行うと、 図1に示すように優れ、長期間の移植および動物の生存を達成することができる。また、血管新生合成の緩やかな同種移植片拒絶反応の再現可能な結果を得るための信頼できる方法を表します。などの同種移植は、 図2に示されている画像によって文書化。拒?...

ディスカッション

このような壊滅的な組織欠損の再建のための上肢と顔面移植などの血管新生したコンポジット同種移植は、従来の再建手続きに修正可能ではない患者に対する有効な治療法の選択肢として発展してきました。マイクロサージャリーの分野における技術の進歩だけでなく、強力な免疫抑制および固形臓器移植における免疫調節療法と豊富な経験は、今、このユニークな患者集団^3,21の長?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy