Ортотопическая задних конечностей трансплантации у мышей

Резюме

Этот роман модель для ортотопическая задней трансплантации конечностей у мышей, применяя без шовный технику манжеты для супер-микрососудов анастомоза, представляет собой мощный инструмент для механистической иммунологические исследования в естественных условиях, связанных с васкуляризированных композитного аллотрансплантации (СВУ).

Аннотация

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

Введение

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья (NIH) и были одобрены Университета Уход за животными и использованию комитета Джона Хопкинса (JHUACUC) по. Конкретные процедуры были выполнены в соответствии с утвержденным MO13M108 протокола ACUC.

1. Донор Операция

1. Администрирование обезболивание в соответствующий момент времени для каждого фармакологического препарата до операции. В соответствии с использованием протокола утверждена по уходу за животными и использование 0,1 мг / кг массы тела бупренорфина подкожно 1 ч до кожного разреза.
2. Седативный донор с ИФ подается через камеру, прикрепленную к ИФ испаритель на 4%; поддерживать седации и анестезии в 2% через носовой обтекатель. Выполните ног снятие пинч отражение контролировать глубину анестезии до начала процедуры.
3. Носите маски, одноразовые халаты изоляции и перчатки.
4. Бритье хирургического ареа, в частности задней конечности и пах, и преп с 10% повидон - йода.
5. Используйте стерильной зоне драпировку, автоклавного инструментов и большом увеличении микроскопа (40X).
6. Сделать паха разрез кожи с помощью ножниц проксимальнее области середины бедра и по окружности соединить разрез разграничить задних конечностей от остальной части корпуса мыши.
7. Определить и анализировать бедренную артерию, вену и нервы. Отделить все три структуры с помощью щипцов и микро-ножницы.
8. После того, как сосудистая ножка рассекают разделить сосуды на уровне паховой связки с использованием микро ножницы.
9. Далее, по-прежнему, чтобы разделить отдельные брюшные (грацильного и медиальной мышцы бедра) и группы спинные мышцы ²⁰ в проксимальном направлении на уровне середины бедра, чтобы отделить трансплантат от животного-донора с помощью ножниц.
10. Трансекте бедренную кость и разрезать на середине бедренной кости с помощью ножниц.
11. Эвтаназии животное изофлурановым передозировки ВОЛСмычали смещением шейных позвонков. Подтверждение прекращения сердцебиения и дыхания.
12. Флеш конечность с 2 мл гепарином (30 IE) холодной (4 ° С) засоленных помощью 33 г промывки иглу, установленную на шприце (см Материалы таблицу).
13. Поместите один полиимидной манжету на бедренную вену и артерию, соответственно.
14. Оберните трансплантата в мокрой хлопковой марли, место в чашке Петри и хранить при температуре 4 ° С до вставке.

2. Получатель Операция

1. Удаление задней конечности
   1. Администрирование обезболивание в соответствующий момент времени для каждого фармакологического препарата до операции. В соответствии с использованием протокола утверждена по уходу за животными и использование 0,1 мг / кг веса тела бупренорфина SC 1 ч до кожного разреза.
   2. Седативный донор с ИФ подается через камеру, прикрепленную к ИФ испаритель на 4%; поддерживать седации и анестезии в 2% через носовой обтекатель. Выполните ног снятие пинч отражение контролировать отделомч анестезии до начала процедуры.
   3. Используйте ветеринарную мазь на глазах мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
   4. Бритье хирургическую область, в частности задней конечности и пах и преп с 10% повидон - йод.
   5. Сделать паха разрез кожи с помощью ножниц проксимальнее области середины бедра и по окружности соединить разрез разграничить задних конечностей от остальной части корпуса мыши.
   6. Определить и анализировать бедренную артерию, вену и нервы и отделить все три структуры с помощью щипцов и микро-ножницы.
   7. После того, как сосудистая ножка расчленена, зажать бедренных сосудов на уровне паховой связки.
   8. Нарезать сосуды дистальный на уровне поверхностного эпигастральной артерии.
   9. Затем продолжают делиться отдельные брюшные (Gracilis и медиальной мышцы бедра) и спинной группы мышц ²⁰ проксимально на уровне середины бедра, чтобы отделить родной заднюю Liмб у животных-реципиентов с помощью ножниц.
   10. Трансекте бедренную в середине бедренной кости с помощью ножниц.
   11. Cauterize ранее перерезают мышцы бедра, чтобы предотвратить кровотечение сайта рассечение и, таким образом получатель кровопотерю.
2. имплантация
   1. Минимизация потери жидкости путем полива операционное поле с теплой физиологического раствора (37 ° С) и 0,3 мл инъекционного теплый физиологический раствор до и после операции.
   2. Поместите трансплантат таким образом, что отражает точную анатомическую позицию родной задней конечности путем совмещения бедренной кости реципиента и трансплантата и соединить их с помощью спинальную иглу 20 G в качестве интрамедуллярной стержня.
   3. Coapt брюшной и спинной группы мышц с использованием рассасывающийся шовный материал (6-0 Полисорб).
   4. Подключите бедренных сосудов, используя технику манжеты без шовный; в деталях, тянуть стороне получателя судна над манжеты ранее установленный на судне концы Grafт. Используйте 10-0 нейлона шов и выполнить круговую связь, чтобы зафиксировать судно получатель на манжете.
   5. Следующая освободить зажимы. На этом этапе визуально проверить вращение манжеты и оптимальное позиционирование, чтобы предотвратить неправильное вращение и перекручивание сосудов.
   6. Выполните гемостаз с помощью электро прижигания с особым акцентом на интерфейсе доноров получателя мышцы и концы костей.
   7. Закройте кожу с помощью нерассасывающегося нейлоновые швы (6-0 Ethilon).
   8. Создание нормотермических условия, позволяя животным восстановить в клетке под нагревательным лампы. Продолжить регулярный мониторинг по крайней мере 4 часа до возвращения его в жилищном объекте.
   9. Послеоперационного обезболивания с бупренорфином в дозе 0,1 мг / кг SC каждые 6-8 ч в течение 3 дней.

Результаты

Выполнение васкуляризированных композитный Аллотрансплантация в мышиной модели с использованием метода без шва манжеты позволяет добиться отличного и долго выживание Термин трансплантата и животных, как показано на рисунке 1. Кроме того, он представляет с?...

Обсуждение

Васкуляризированных Композитный Аллотрансплантация, таких как верхней конечности и трансплантации лица для реконструкции дефектов разрушительных тканей, развилась в качестве действительного варианта лечения для пациентов, не исправимо с обычными реконструктивных операций. Технич...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy