Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

Riepilogo

Questo nuovo modello per il trapianto degli arti posteriori ortotopico nel topo, applicando una tecnica bracciale non sutura per anastomosi super-microvascolare, fornisce un potente strumento per la ricerca in vivo meccanicistica immunologica relative al allotrapianto composito vascolarizzato (VCA).

Abstract

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

Introduzione

The late nineties heralded the pioneering days of reconstructive transplantation with the first successful hand transplant performed in France in 1998. Since then, the use of VCAs for reconstruction of devastating tissue defects has been successfully employed in a wide spectrum of patients. To date, the world counts 76 recipients of 112 upper extremities as well as 31 faces ^1-3. In addition, several other types of VCAs such as abdominal wall ⁴, larynx ⁵, trachea ⁶, vascularized joints ⁷, and even penis ⁸ have been performed. Furthermore, the live birth of a baby was recently reported after uterus transplantation ⁹. This growing world experience is indicative for how reconstructive transplantation has become a valid therapeutic option for patients suffering of significant functional tissue defects not amendable to conventional reconstructive and restorative surgery and treatment.

While the idea of replacing "like with like" sparked clinical enthusiasm, initial skepticism still prevails with regards to side effects of conventional high-dose immunosuppression required to maintain allografts and their function ^10,11. However, as shown by seminal work of Lee et al., these composite grafts are less likely to reject than its individual components, and furthermore, some of the tissue components such as the vascularized bone compartment have fueled optimism as they might exert unique immunological effects onto the balance of immune acceptance and rejection ¹².

Our group pioneered several microsurgical animal models for solid organ transplantation, as well as vascularized composite allotransplantation ^13-19. Here we describe a novel surgical procedure using a non-suture cuff technique to perform super micro-vascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. This transplant model provides a useful tool for investigating immune acceptance and rejection mechanisms, as well as the role of individual tissue components, such as the vascularized bone marrow compartment, towards tolerance induction in the immunologically versatile setting of the mouse species. Additionally, the orthotopic placement of the limb opens the possibilities for nerve regeneration and functional outcome studies, which are critically important to the setting of VCA.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la MO13M108 protocollo ACUC approvato.

Operazione 1. donatore

1. Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via sottocutanea 1 ora prima della incisione cutanea.
2. Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare la profondità dell'anestesia prima dell'inizio della procedura.
3. Indossare maschere, abiti di isolamento monouso e guanti.
4. Radere l'ar chirurgicaEA, in particolare l'arto posteriore e l'inguine, e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
5. Utilizzare un drappo campo sterile, strumenti in autoclave e un microscopio ad alto ingrandimento (40X).
6. Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
7. Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo. Separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
8. Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato dividere i vasi a livello del legamento inguinale con le forbici micro.
9. Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e gruppi muscolari dorsali ²⁰ prossimalmente a livello della metà coscia per separare l'innesto dal donatore con le forbici.
10. Transect femore e tagliare a metà del femore con le forbici.
11. L'eutanasia degli animali da isoflurano fol overdoselowed da dislocazione cervicale. Confermare la cessazione del battito cardiaco e la respirazione.
12. Lavare l'arto con 2 ml eparinizzate (30 IE) fredda (4 ° C) saline utilizzando un 33 G lavaggio ago montato su una siringa (vedi Materiali Tabella).
13. Posizionare un bracciale in poliimmide la vena femorale e l'arteria, rispettivamente.
14. Avvolgere trapianto in garza di cotone bagnato, posto nella capsula di Petri e conservare a 4 ° C fino a quando nel riquadro.

2. Destinatario Funzionamento

1. La rimozione del dell'arto posteriore
   1. Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di Buprenorfina SC 1 ora prima della incisione cutanea.
   2. Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare il repartoh di anestesia prima dell'inizio del procedimento.
   3. Usare pomata veterinario gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   4. Radere l'area chirurgica, in particolare l'arto posteriore e l'inguine e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
   5. Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
   6. Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo e separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
   7. Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato, bloccare i vasi femorali a livello del legamento inguinale.
   8. Tagliare i vasi distale a livello dell'arteria epigastrica superficiale.
   9. Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e dorsali gruppi muscolari ²⁰ prossimalmente a livello della metà coscia per separare il hind li nativamb dagli animali destinatario utilizzando le forbici.
   10. Transect il femore nel mezzo della diafisi femorale con le forbici.
   11. Cauterize muscoli della coscia precedentemente sezionati per prevenire le emorragie del sito dissezione e, quindi, la perdita di sangue destinatario.
2. Impianto
   1. Minimizzare la perdita di fluido irrigando il campo operatorio con soluzione fisiologica tiepida (37 ° C) e l'iniezione di 0,3 ml di soluzione salina calda prima e dopo l'operazione.
   2. Inserire l'innesto in modo da riflettere la posizione anatomica accurata dell'arto posteriore nativa allineando dell'osso femore del destinatario e l'innesto e collegate con un ago spinale 20 G come un chiodo endomidollare.
   3. Coapt i gruppi muscolari ventrale e dorsale con materiale di sutura riassorbibile (6-0 Polysorb).
   4. Collegare vasi femorali con la tecnica bracciale non suture; in dettaglio, tirare il lato ricevente della nave sui polsini precedentemente montate sulla nave estremità del graft. Utilizzare una sutura in nylon 10-0 ed eseguire una cravatta circonferenziale per fissare la nave ricevente sul bracciale.
   5. Successivo rilasciare le fascette. In questa fase verificare visivamente la rotazione bracciale e un posizionamento ottimale per evitare errori di rotazione e piegamento dei vasi.
   6. Eseguire emostasi meticolosa con cauterizzazione electro con una particolare attenzione per l'interfaccia del donatore ricevente muscolare e le estremità delle ossa.
   7. Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon non assorbibili (6-0 ETHILON).
   8. Stabilire condizioni normotermici consentendo all'animale di recuperare nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante. Continuare monitoraggio regolare per almeno 4 ore prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
   9. Fornire analgesia post-operatoria con buprenorfina alla dose di 0,1 mg / kg SC ogni 6-8 ore per 3 giorni.

Risultati

Esecuzione vascolarizzato allotrapianto composito in un modello di topo usando una tecnica bracciale non sutura consente di ottenere eccellenti e lungo graft termine e animali sopravvivenza come mostrato in Figura 1. Inoltre, rappresenta un metodo affidabile per ottenere risultati riproducibili di graduale rifiuto allograft in composito vascolarizzata allotrapianto come documentato dalle immagini mostrate in figura 2. H & e istologic...

Discussione

Vascolarizzato Composite allotrapianto, come ad esempio arti superiori e il trapianto di faccia per la ricostruzione di difetti del tessuto devastanti, si è evoluto come opzione di trattamento valido per i pazienti non modificabili a procedure ricostruttive tradizionali. I progressi tecnici nel campo della microchirurgia ricostruttiva, nonché una vasta esperienza con immunosoppressori potenti e le terapie modulatori del sistema immunitario a trapianto di organo solido, ora permette la sopravvivenza del trapianto a lun...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy