בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

Summary

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Abstract

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Introduction

תאי גזע בוגרים (גיל) הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות על ידי החלפת תאים מתים ותיקון רקמות שנפגעו על פציעה. גיל אלה מוגדרים על ידי היכולת שלהם לעבור התחדשות עצמית מתמדת להתמיין שושלות תאים שונות ^1-3. המערכות למדו הטוב ביותר, אשר תלוי גיל מבוגר עבור החידוש שלהם, כוללות את מערכת hematopoietic, במעי ^1,2,4 העור.

במהלך עובר, העור מתחיל כמו שכבה אחת של תאי אפידרמיס. המורפוגנזה של זקיק השיער (HF) מתחילה כאשר תאי mesenchymal לאכלס את העור ומהווה הדרמיס collagenous בסיסי ^5. מתמחה תאים mesenchymal, כי מאוחר יותר מהווים את עורי פטמית (העקורים), לארגן ישירות מתחת לשכבת האפידרמיס וממריץ האפיתל כדי ליצור placodes השיער מתחיל לצמוח כלפי מטה ^6. מאוד מתרבים תאי מטריקס, ממוקם בחלק התחתון של HF,מעטפת תאי mesenchymal אלה ויוצרים את השיער הנורה, בעוד השכבה הפנימית מתחילה להתמיין גלילים קונצנטריים לגבש השערה (HS) ואת נדן השורש הפנימי שמסביב (IRS) ^2,3.

לאחר הינקות האפידרמיס בעור מורכב משלושה תאים: האפידרמיס interfollicular (IFE), בלוטת החלב (SG) ואת HF. בניגוד IFE ו SG אשר נמצא במצב מתמיד של הומאוסטזיס, את HF הוא איבר מיני דינמי אשר עובר מחזורים רצופים של צמיחה (anagen), הרס (קטגן) ומנוחה (telogen) ^4,7. תאי גזע זקיק שיער (HFSCs) דלק כי במחזוריות בלתי פוסקת זו, הנמצאים ליד גומחה בתוך HF המכונית הבליטה ^4. במהלך Anagen HFSCs לצאת הבליטה, העוקבים אחר איתות הפעלה מן העקורים, להתחיל מתרבה ויורד כלפי מטה ובכך ליצור שובל ליניארי ארוך של תאים המכונים נדן השורש החיצוני (ORS) ^8-10. תאי מטריקס, כימקיפים את העקורים בבסיס של HF, מחזור במהירות ולהעביר שעברו התמיינות מסוף כלפי מעלה ובכך יצירת HS ואת ¹⁰ IRS (איור 1). משך anagen קובע את אורך השיער תלויה יכולת שגשוג והתמיינות של תאי מטריקס ^6. כאשר HF נכנס קטגן, התאים מטריקס הגברה במעבר בהפסקת הנורה להתרבות, עוברים אפופטוזיס ו לסגת לחלוטין תוך משיכת העקורים כלפי מעלה עד שהוא מגיע אל החלק הלא-אופניים של ^8,11 HF. במהלך הכחשה זו HF יוצרת מבנה זמני הידוע כאפיק אפיתל, אופייני קטגן, ומכילה הרבה תאים אפופטוטיים. בעכברים, קטגן נמשך בין 3-4 ימים, והוא מסונכרן מאוד במחזור השיער הראשון. כאשר HF מגיע telogen כל HFSCs להיות שקט. השלבים ברורים של מחזור HF גם מאופיינים שינויים בצבע העור העכבר של בשל מייצור elanin. השינויים העור משחור במהלך anagen כדי אפור כהה במהלך קטגן לוורוד במהלך telogen ^6,7,12,13.

איור 1: מחזור זקיק השיער. HF מורכב בחלקו העליון קבע וחלק שיפוץ נמוך כל הזמן, רכיבה על אופניים, אשר עוברת מחזורים רצוף של צמיחה מהירה (anagen), הרס (קטגן) ושלב קפאון קרוב משפחה או שאר (telogen). אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.

ה- SCS שמירה על HF זוהה בתחילה באמצעות ניסויי מרדף, עם thymidine tritiated, שחשפו אוכלוסייה של תאי שומרי תווית רכיבה איטית (LRC) ששכנו באזור הקבע של HF ממש מתחת SG ^14. התקדמות HFSCאפיון חשף מספר קטן של סמנים כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולבודד גיל ספציפי מן הנישה HF ^15. אולי הסמן הטוב ביותר להעשרת HFSCs הוא CD34, סמן פני התא מזוהה גם כסמן SC hematopoietic בבני אדם ^16. בתוך CD34 זה ⁺ אוכלוסיות שתי אוכלוסיות נפרדות גם בודדו מבוסס על integrin α6 ביטוי ^2. סמן נוסף הוא קרטין 15 (K15) אשר מבוטא בכמות גבוהה באזור הבליטה, שיתוף לוקליזציה עם ביטוי CD34 ו אמרגן K15 משמש למיקוד ולבודד HFSCs בחיות מהונדסות ^15,17-19. בעשור האחרון מספר אוכלוסיות נפרדות אחרות של HFSCs ו ובתאים גם דווחו להתגורר בתוך HF ^17,20-27.

תכונה מרגשת נוספת של HFSCs תרומתם תיקון עור. בתנאים רגילים HFSCs לחדש את HF ואינו לוקח חלק הומאוסטזיס IFE. HoweVer, בתגובה פציעה, תאים אלה לצאת נישה SC שלהם וסיוע repopulating IFE ^9. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי עכברים שנמחקו עבור תצוגת הגן הפר-אפופטוטיים Sept4 / ARTS למספר גדל והולך של CD34, K15 ו Sox9 ⁺ HFSCs, מה שמראה על התנגדות אפופטוזיס. HFSCs בודד Sept4 / ARTS ^{- / -} עורות מגבים ניצול התא מופעל קרינת מיון (FACS) והיה יותר שני גידול של פי מספר CD34 ⁺ ו- K15 ⁺ HFSCs. ARTS Sept4 / אלה ^{- / -} HFSCs הורחב במבחנה ולא הוליד רק מושב יותר אבל היו גם מסוגל לעמוד בתנאים קשים בהשוואה לקבוצת ביקורת ^28.

כתוצאה מכך שיש מספר גדל של HFSCs, Sept4 / ARTS ^{- / -} עכברים נרפאו מהר יותר באופן משמעותי בתגובת פציעות כריתת עור. באופן מפתיע, Sept4 / ARTS ^{- / -} עכברים displayeדה מספר רב של HFS מחדש ממיטת הפצע, וצלקות קטנות באופן משמעותי. יתר על כן, העכברים שנמחקו עבור XIAP (X-linked מעכב אפופטוזיס), ליעד ביוכימיים של ARTS, הפגינו ריפוי לקוי ^28.

תוצאות העבודה שלנו בצעה במעבדות אחרות הראו כי HFSCs לשמש מודל אידיאלי עבור מחקר על הביולוגיה והתפקוד של גיל מבוגר. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה של העשרה ובידוד של HFSCs ו קרטינוציטים אפידרמיס מבוסס על הביטוי של ארבעה סמנים: α6 integrin; β1 integrin; SCA-1 (סמן קרטינוציטים אפידרמיס) ו CD34. בידוד דומה K15 ⁺ HFSCs יכול גם להתבצע באמצעות עכבר כתב K15-GFP ^19.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדנית עם המלצות שהותוו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של משרד הבריאות הישראלי. כל החיות טופלו על פי פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מוסדי המאושר IL-02302-2015 של הטכניון טכנולוגי.

1. הכנה ניסויית

1. הכין בסרום שור העוברי chelated
   הערה: תאי אפיתל רגישים מאוד סידן ולכן חשוב לשלוט על החשיפה של תאים אלה סידן. על מנת להבטיח כי התאים אינם חשופים סידן במהלך קלאציה תהליך הבידוד משמש כדי להסיר כל סידן שיורית מן בסרום שור עוברית המשמש להכנת חיץ מכתים ^29. הפרוטוקול הבא מכין כ 1 ליטר של החופשי סידן עוברי שור סרום הנדרש למאגר מכתים הכנת FACS.
   1. להוסיף 400 גרם של חומר chelating יבש, למשל., Chelex, לתוך מבחנה 4 L ולהוסיף מזוקקים H ₂ O ל בהיקף כולל 4 ל כיסוי ומתמשך מוקפצים באמצעות בוחש מגנטי.
   2. התאם ל- pH 7.4 באמצעות 10 N פתרון HCl תוך ערבוב. המשך ערבוב במשך 20 דקות מחדש ולהתאים את ה- pH לפי הצורך עד pH נשאר יציב במשך יותר מ -20 דקות.
   3. דגירת כוס לני 4 ° C. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H ₂ O ולהוסיף מזוקקים טריים H ₂ O ל בהיקף כולל של 4 ל '
   4. חזור על התאמת pH כמו בשלב 1.1.2.
   5. מניח את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את חומר chelating לגבש גלולה קומפקטית. בזהירות לשאוב H ₂ O.
   6. לאט לאט מוסיפים שתי 500 מ"ל בקבוקי בסרום שור העובר לחומר chelating. מערבבים לאט על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להבטיח כי הגדרת המהירות אינה מייצרת בועות.
   7. מניחים את הכוס על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. כדי לאפשר את החומר chelating להקים חינמוןלפעול גלולה.
   8. להעביר בזהירות את הנוזל לתוך בקבוק 1 ליטר זכוכית לסנן אותה דרך פילטר עליון בקבוק בתנאים סטריליים. אחסן את בסרום chelated ב -20 ° C או להשתמש מיד.
2. הכנת מאגר מכתים
   1. הכן 100 מ"ל של 3% chelated FBS ב PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ ולשמור על הקרח.

בידוד 2. של זקיקי השיער למבוגרים אפידרמיס

1. להרדים עכברים באמצעות isoflurane 5% באמצעות תיבת אינדוקציה. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם באמצעות עכברים ישנים 50-80 יום נמצאים בשלב telogen של מחזור HF.
2. להרדים עכברים על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים. הנה, להרדים עכברים באמצעות מנת יתר CO ₂ בתא המתת חסד.
3. לגלח את כל השיער מן העור הגבה באמצעות קוצץ חשמלי. הימנע ראש וגפיים. שמור את הקוצץ קרוב ככל האפשר לעור. למנוע נזק לעור השכבה התת עורית.
4. כאשר כל השיער מוסר, להשתמש 70% אתנול כדי להסיר שאריות שיער כדי לחטא את עור הגב.
5. מניחים את העכבר על כרית לנתח, מלקחיים באמצעות להרים את העור ליד הזנב ולעשות ניק קטן בעזרת מספריים. חותך את עור הגב כולו בכיוון אחורי-קדמי על ידי חיתוך בזהירות את העור ומפריד בינה לבין fascia. למנוע נזק השכבה התת עורית.
6. מניחים את העור על מחצלת לנתח, בצד השיער כלפי מטה, להצמיד שני הקצוות הסמוכים של העור לתקן במקום. בעדינות לגרד את השומן, באמצעות אזמל בוטה עד הדרמיס ברור ומסודר.
   הערה: כאשר מגרדים את השומן, להשתמש במלקחיים מעוקל כדי להפעיל לחץ עדין על העור. החל לחץ על העור באמצעות הצד המעוגל של מלקחיים. פעולה זו תמנע את העור מקריעה.
7. מניחים את העור, הדרמיס בצד למטה, ב 100 מ"מ צלחת תרבות סטרילי, ויישר את העור על מנת להבטיח כי אין קפלים. הוסף 10 מ"ל של PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ (PBS ^-) כדי בצלחת תרבות וליישר את העור במידת הצורך.
8. לשאוב PBS ולהוסיף 10 מ"ל של טריפסין 0.25%. ודא כי העור הוא פרש והוא צף בחופשיות. דגירה פיסת עור אחד לכל 10 מ"ל של טריפסין 0.25%.
9. דגירת דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-120 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. הכנת תרחיף תא בודד מ'שיער' זקיקים

1. גרד את כל השיער מעל העור באמצעות מלקחיים מעוקלים אזמל, ב קדמי לכיוון אחורי. מתחי את העור במקום באמצעות צדו הקמור של מלקחיים ולהשתמש אזמל כדי לגרד את השיער.
   הערה: אל תגרד את השיער לתוך התמיסה טריפסין הוסיף בשלב 2.8. התחל הזנב ופעל בכיוון צמיחת השיער. מגרדים נגד כיוון צמיחת שיער יגרום לאובדן משמעותי של HFS ו ירידה בתשואת תא. HFS נוטה לדבוק זה יחד ויוצר גושים קטנים; על מנת לצמצם הגודל דואר של גושי HF לנסות לגרד שטח קטן בכל פעם.
2. מעבירים את העור ללא שיער כדי בצלחת תרבות חדשה ולהוסיף 10 מ"ל של PBS ^- כדי למנוע התייבשות. בדוק את העור לגרד כל שיער נותר.
3. לשבור את HFS באמצעות אזמל מלקחיים עד השעית HF יחידה מתקבלת. במרץ triturate השעית HF באמצעות פיפטה 10 מיליליטר במשך כמה דקות כדי לשבור את כל גושי השיער.
   הערה: בצע את כל השלבים הבאים על קרח.
4. מעבירים את ההשעיה HF בצינור 50 מ"ל מראש שכותרתו.
5. לשאוב PBS ^- מן העור ולהשתמש בו כדי לשטוף את צלחת תרבית תאים שהכילה השעית HF; להעביר את הצינור 50 מ"ל.
6. כְּבָסִים
   1. סנן את ההשעיה על ידי עובר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מ"ל. שטפו את שפופרת 50 מ"ל הראשונית ואת מסננת עם 10 מ"ל של חיץ מכתים (PBS ^- עם 3% chelated FBS).
   2. סנן את ההשעיה על ידי העברהתא מסנן דרך 40 מיקרומטר מצויד על צינור 50 מיליליטר. לשטוף את הצינור עם 5-10 מ"ל של חיץ מכתים על מנת להבטיח כי כל התאים הועברו אל צינור חדש. שמור את ההשעיה על הקרח עד שכל החיות עובדו.
   3. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. supernatant לשאוב בזהירות מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ מכתים.
   4. צנטריפוגה במשך 5 דקות XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים.
      הערה: הכרכים המפורטים לעיל מספיק תאים מכתימים נגזרים משני עכברים בוגרים.
7. השעיה העביר לתוך צינורות FACS שכותרתו קדם.
   1. עבור צינורות שולטים, לקחת 25-50 μl של השעית תא (או כל שמאל שיורית מן השעית התא) ולעשות עד בהיקף כולל של 300 μl עם חיץ מכתים.
      הערה: הכין צינורות מלאים (μl נפח הכולל 300) עבור בלא כתם (לא נוגדןואין DAPI); DAPI בלבד; Integrin β1; Integrin α6; SCA-1; CD34.
8. מוסיף את הנוגדנים הראשוניים DAPI (ראה טבלת חומרי דילולים מתאימים) בריכוזים הרצויים אל הצינור המתאים. בעדינות קפיצית את הצינורות כדי לערבב את השעית התא. חזור על קרח מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.
9. דגירה במשך 30 דקות על קרח בעדינות קפיץ הצינורות כל 10 דקות כדי להבטיח תאים נשמרים השעיה.
10. שטפו תאים על ידי מילוי כל צינור FACS עם חיץ מכתים (כ 4 מ"ל לכל צינור); צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
11. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 800 μl של חיץ מכתים.
12. להעביר את השעית תא לתוך צינור FACS עם כובעים מסננים תא כדי להבטיח השעית תא בודדת.

4. ניתוח cytometry זרימה

1. המשך מיון תאים באמצעות מיד cytometer זרימה עם מסננים מתאימים עבור סיגנהאיתור l. השתמש 405 סגול ננומטר (למדידות DAPI), 488 ננומטר כחול (למדידות FSC, SSC, PE, PE-Cy7 ו FITC) ו 633 לייזרים אדומים ננומטר (עירור של APC)
   הערה: ודא כי מכשיר הקלטה מ גלאי עבור כל שלושת ערוצי הניאון.
2. שערי קרינה מוגדרת על סמך דגימות בלא כתם ופיצוי עבור חפיפה ספקטרלית באמצעות פקדים מוכתמים יחידים.
   הערה: השתמש בפקדים צבעוניים אחת להתאמת הפיצוי בין ערוצים על מנת לחסל כל חפיפת אותות הניאון. התאמת התגמול יהיה תלוי סדרן FACS בשימוש.
3. הגדרת שערים העיקרי מבוסס על DAPI להוציא תאים מתים.
4. התאם את עלילת הפיזור (SSC-A vs-A FSC) כדי לבחור לאירועי גופייה.
5. הגדרת FSC וגובה SSC ופרמטרים רוחב לחסל עבור כפילויות ולהפלות לאירועים גופיה.
6. תאי שער עם α6 גבוה והבעה β1 ומתוך אוכלוסייה זו תאי שער גם עם CD34 ביטוי גבוה או ביטוי גבוה Sca1.
7. תאים מיין לתוך צינור FACS מראש שכותרתו.
   הערה: שתי אוכלוסיות של תאים יכול להיות מבודד; α6 ⁺ / β1 ⁺ / CD34 ⁺ / SCA-1 ^- ו α6 ⁺ / β1 ⁺ / SCA-1 ⁺ / CD34 ^-. תאים ממוינים צריכים להישמר על קרח בכל העת עד שהם משמשים ביישומים במורד כגון תרבית תאים או בידוד RNA

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ההעשרה ובידוד של שני סוגים של אוכלוסיות:. בליטת SCS ו קרטינוציטים אפידרמיס איור 2 מדגימים את השלבים העיקריים של הפרוטוקול. ניצול העור הוסר הגבי האחורי של עכברים בן 8 שבוע, אנו מועשרים גיל בליטה באמצעות סמן CD34, אשר באה...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מבוסס היטב לבידוד HFSCs מהעור הגבי של עכברים בוגרים אבל יכול להיות מיושם באופן שווה לבידוד של אוכלוסיות אחרות בתוך מבנה HF, בהתבסס על הבחירה של סמנים ^{2,16,23,28,29.} שיטה זו היא יתרון במיוחד על פני שיטות אחרות של בידוד תא, כגון דיסוציאציה רקמות, בכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Primal Critical Care	66794-017-10
Carbon dioxide	-	-
Electro Shaver	Oster	Golden A5	Shaver from any other company could be used
70% ethanol	Gadot Lab	830000051	96% ehtanol diluted with distilled water
Dissection mat			Dissection tools from any provider can be used
Forceps	Dumont	11251-10	Foreceps from any other company could be used
Scissors	Dumont	14094-11	Scissors from any other company could be used
Needles/Pins	-	-
Scalpel	Albion	10	Ensure that the scalpel has a blunt end
Tissue culture dish 60mm x 15mm	Sigma-Aldrich	CLS430166
PBS	-		In-house PBS without Calcium and Magnesium
0.25% Trypsin/EDTA	Biological Industries	03-050-1A	Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly
Pipettes 10ml	Sigma-Aldrich	Corning, 4488
Ice	-	-
50 ml sterie centrifuge tubes	Minplast Ein-shemer	35050-43
70µM Cell strainer	Fisher	22362548
40µM Cell strainer	Fisher	22362549
Staining buffer	-
Centrifuge	Eppendorf 5804 R	5805 000.017
FACS tubes with Cell strainer caps	Falcon	352235
FACS tubes	Falcon	352063
Integrin β1	eBioscience	25-0291	1:400
Integrin α6	eBioscience	15-0495	1:600
Sca I	eBioscience	11-5981	1:200
CD34	eBioscience	9011-0349	1:300
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	50ng/ml
Dry Chelex	BioRad	142-2842
Beaker	Pyrex	-
Distilled H2O	-	-
Stir bar	-	-
NHCl	BioLab	1903059
Fetal bovine serum (FBS)	Beit Haemek Biological Industries	400718	FBS obtained from a different company can be used
1L glass bottle	Ilmabor	Boro 3.3
Bottle top filter	Autofil	1102-RLS