כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

Summary

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Abstract

להנחיל חומרי משטח עם מאפייני תא-דבק הוא אסטרטגיה משותפת במחקר ביולוגי והנדסת רקמות. זה מעניין במיוחד עבור פולימרים שכבר אושרו שיש להם שימוש ארוך ברפואה כי חומרים אלה הם גם בעיות מאופיינות ומשפטיות הקשורים עם ההקדמה של פולימרים מסונתזים חדש ניתן להימנע. Polytetrafluoroethylene (PTFE) הוא אחד החומרים מועסקים לעתים קרובות ביותר עבור הייצור של שתלי כלי דם אך הפולימר חסר הידבקות תא בקידום תכונות. Endothelialization, כלומר, כיסוי מלא של שתלי המשטח פנימי בשכבה ומחוברת של בתאי האנדותל נחשב מפתח לביצועים אופטימליים, בעיקר על ידי הקטנת thrombogenicity של הממשק המלאכותי.

מחקר זה בוחן את הצמיחה של תאי האנדותל על PTFE פפטיד שונה ומשווה את התוצאות הללו לאלה שהושגו על מצע ללא שינוי. צימוד עםArg-Glu-Asp-Val פפטיד תא הדבק אנדותל (REDV) מבוצע באמצעות הפעלה של הפולימר המכיל fluorin באמצעות naphthalenide נתרן מגיב, ואחריו צעדי נטייה שלאחר מכן. תרבית תאים מושגת באמצעות אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) וצמיחה הסלולר מעולה על חומר משותק פפטיד מודגם על פני תקופה של שבועות.

Introduction

פולימרים שונים בשימוש ברפואה אשר אושרו במשך זמן מה אינו מציג התאמה ביולוגית משופרת, כלומר, חוסר-דביקות תא, אינדוקציה של אנקפסולציה fibrotic ו thrombogenicity, כדי להזכיר כמה. אינטראקציות בין הביולוגי והמערכת הביולוגית מתרחשות בעיקר על פני השטח של השתל. כתוצאה מכך, מחקר התמקד שינוי פני שטח כדי ליצור מאפיינים מתאימים יישום רצוי תוך השארה בכמויות הגדולות המאפיינים של החומר מעושה. Polytetrafluoroethylene (PTFE) כמו פולימר אינרטי מבחינה פיזיולוגית משמש בתחומים רפואיים רבים כגון רשת ¹ כירורגית בקע, יציאות רפואיות ^2, והכי חשוב, שתל כלי דם ^3.

במיוחד במצבי פניית דם האופי הידרופובי של PTFE גורם ספיחה נוקבת של רכיבי פלזמה וכתוצאה הידבקות טסיות מכך, ופעמים רבות תוצאה היא thrombotiאירועי ג ו חסימה של השתל ^4. יתר על כן, PTFE, כמו רוב הפולימרים, אינו תומך הידבקות הסלולר וכיסוי אשר תהיה תכונה רצויה לגרום להיווצרות שכבה שביושר בתאי האנדותל (EC) על הפנימי (לומינל) השטח של השתל וסקולרית ^5. האנדותל biomimetic צפוי למלא רב מהפונקציות של המקבילה הטבעית שלה, נכסי antithrombogenic שלה בעיקר ^6. אסטרטגית שינוי biomimetic כללית מבוססת על הרעיון של והוריש חומר בלעדי עם-דביקות תא תוך השארת הנכסים חומר תפזורת מעושה. בנוסף, הדבקה טסיות עשוי להיות מופחת על ידי שילוב-דבק ​​אנטי (אנטי עכירות) מייחס ^7. פפטידים שונים - שמקורה בעיקר חלבונים של תאי מטריקס - תוארו כי בתוקף לשפר-הידבקות התא באמצעות קשירה לקולטנים הסלולר, השתייכות למעמד של integrins ^8. את להיותst-ידוע למשל בעניין זה הוא פפטיד Arg-גלאי-ASP (RGD) כי אינטראקציה עם סוגי תאים ביותר. רצפי החומצות האמיניות אחרים מוכרים על ידי integrins לידי ביטוי אך ורק על תאים ספציפיים. לדוגמה, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) ו Tyr-Ile-גלאי-שירו-Arg (YIGSR) נמצאו להיקשר ECS באופן ספציפי ^9. קוולנטיים וקיבוע של פפטידים כאלה בוצע על שפע של חומרים שאינם דבקים מטבעו כולל מתכות ופולימרים ^10,11.

PTFE נקבובי, ליתר דיוק מורחבת PTFE (ePTFE) - יחד עם terephthalate פוליאתילן (PET) - הוא החומר החשוב ביותר לייצור כלי הדם שתלי ^12. טכניקות פיסיות הוקמו עבור טיפולים מתאימים, כגון שינוי הפלזמה ¹³ או בשיטות פוטו ^14, הם הקשו על ידי העובדה כי מבנים נקבוביים / או הצינור שלא ניתן לטפל בקלות בתוך נקבובי או לומן בהתאמה. כימיה רטובהעל PTFE היא משימה קשה בשל אופיו אינרטי מאוד של הפולימר המכילים fluorin שמתנגד התקפות כימיות ביותר ^15.

במאמר זה אנו מתארים שיטה קלילה יחסית עבור אסטרטגית שינוי קוולנטי. מעובד מתוך הליך כדי להבהיר bondable PTFE, קבוצות פונקציונליות נוצרו על פני שטח החומרים המשמשים כנקודות עוגנות נטייה נוספת של מולקולות ביולוגיות אקטיביות.

Protocol

1. הכנת נתרן Naphthalenide הפעלת הפתרון והפעלת Surface

הערה: ביצוע תגובות במנדף מאוורר היטב. בצע כללים מקובלים לטיפול ממסים דליקים מאוד ומתכות מאכלות כמו נתרן מתכתי. יש נפטלין ריח מאוד לא נעים (נפטלין), אפילו בכמויות קטנות מאוד! אם לא צוין אחרת תגובות מבוצעות בטמפרטורת חדר. נתרן יזיד הוא רעיל ביותר! THF (99.9%, רואים רשימה של חומרים) אוחסן על כ 20% (לפי נפח) מסננת מולקולרית. זקק THF עם תכולת מים בולט מעל נתרן. ההיווצרות של נתרן naphthalenide אינה מתרחשת אם כמויות זעירות של מים נוכחות.

1. כדי פתרון של 1.4 גר '(10.9 mmol) של נפטלין ב 20 מ"ל tetrahydrofuran (THF, מיובשים במשך 3 מסננת מולקולרית), להוסיף 0.25 גר' (10.9 mmol) מתכת נתרן בתוך בקבוק זכוכית בורג הכתיר 100 מ"ל מצויד PTFE- בר בחישה מגנטי מצופה.
   הערה: Dissolution יכול להיות מאוד משופר על ידי חיתוך נתרן לחתיכות קטנות וחימום צנוע (35 - 40 מעלות צלזיוס). הפתרון הסופי יש צבע כהה, ירקרק מעט ועשוי להיות מאוחסן בתנאים יבשים לחלוטין.
2. אגרוף החוצה דיסקים PTFE בקוטר 12 מ"מ 0.5 מ"מ חומר רדיד עבה. מארק צד אחד (למשל, באמצעות מכתב חותם אגרוף) ונקי עם iso-propanol.
3. דגירה בנפרד-דגימות PTFE בפתרון ההפעלה (שלב 1.1) עבור 1 - באמצעות מלקחי 2 דקות. הערה: שינוי הצבע לבן עד חום כהה מצביע טיפול מוצלח.
4. בהמשך ולשטוף פעמיים עם THF ולאחר מכן עם-propanol iso.
   הערה: פתרון naphthalenide הוא מותש כאשר משנה את צבעו כדי חום בהיר דומע. פתרון naphthalenide בשימוש (ואולי המכיל נתרן מתכתי) צריך להיות מפורק על ידי הוספה לאט iso-propanol לפני הסילוק.
5. לחמצן דגימות מטופלים מי חמצן (30%) המכילים 20% (w / v) חומצת trichloroacetic עבור 3 שעות. לִשְׁטוֹףעם מים ויבשים. המשטח עכשיו יש מראה חום קל. הערה: הפעלה ותוצאת חמצון בתוך יכולת רטיבות מוגברת מאוד של פני השטח. ממצא זה נבדק בפירוט ¹⁴ בעבר.
6. פנקו את הדיסקים חמצון עם 50% (v / v) diisocyanate hexamethylene (HMDI) ב THF יבש עבור שעה 2, לשטוף עם THF ולהשאיר לייבוש.
7. Hydrolyze דגימות נושאות isocyanate במים למשך 2 - 3 שעות ויבשות. הערה: משטח PTFE הסופי פונקציונלי אמין הוא הרבה יותר יציבה מאשר דגימות נושאות isocyanate והוא תואם crosslinkers הסטנדרטי רב עבור צימוד נוסף.

2. קיבוע פפטיד

1. הכן תמיסה של 20% (v / v) אתר די אתילן גליקול diglycidyl (diepoxide) ב 50 מ"מ חיץ קרבונט, pH 9.
2. מניחים את הדיסקים aminated עם הצד המסומן בנפרד לתוך צלחת 24 היטב ומוסיפים 1.5 מ"ל של הפתרון epoxide. להבטיח כיסוי מלא של הדגימות. דגירה עבור שעה 2 ולשטוף שניפעמים עם מים ופעם עם חיץ קרבונט.
3. הוסף 50 μl של פפטיד 0.5 מ"ג / מ"ל (למשל, REDV) ב 50 מ"מ חיץ קרבונט, pH 9 המכיל 0.01% ₃ נאן, אל החלק התחתון של בארות בודדים של צלחת טרי 24 היטב בזהירות במקום הפוך דיסקים פונקציונליות אפוקסי -down (כלומר, מסומן בצד למטה) על ירידה של הפתרון פפטיד. ודא כי הרווח בין תחתית הבאר ודיסק PTFE הוא רטוב לחלוטין בשל פעולת נימים.
4. דגירה בתא רטוב (למשל, כל קופסת פלסטיק סגר עם מכסה הסגירה חזק) עם אווירה humidified (על ידי הצבת נייר טישו רטוב על הקרקעית) במשך 3 שעות לפחות או לילה.
   הערה: אם כי מוטיב REDV יכול להיחשב היטב מאופיין, רצף חומצות האמיניות מקושקש או להפוך עשוי להיכלל כפקד שלילי נוסף.
5. לשטוף שלוש פעמים עם מים לעקר ב 50% iso-propanol / מים 30 דקות לפחות. לפני תא זריעה, rinsדואר הדגימות בופר פוספט סטרילית (PBS).

3. זריעת תאים

1. לגדול HUVECs באמצעות נהלי תרבית תאים סטנדרטיים ^17,18.
2. מניח את הדגימות מצומדות-פפטיד עם הצד השונה עד בתוך 24 צלחות היטב. להשתמש בתקליטורי PTFE מטופל כביקורת.
3. זרע 5 X 10 ⁴ HUVECs במדיום 2 מ"ל לכל היטב דגירה במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור.
4. הסר את הדיסקים, לשטוף בזהירות כדי להסיר תאים פנויים ולהעביר לצלחת גם 24 טרי. הוסף 2 מ"ל של מדיום חדש דגירה לתקופה הרצויה (למשל, 24 שעות, 1 w, וכו '). שנה בינונית כל יומיים.
5. הכן פתרון המניות של 1 מ"ג / מ"ל ​​Calcein-AM ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
6. לאחר גידול התאים להסיר את המדיום, לשטוף עם PBS ולהוסיף PBS המכיל 1 μl / מ"ל כתם Calcein-AM (למשל, 1 μl של פתרון המניות לכל PBS מ"ל). בעדינות להתסיס incubatדואר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בחושך.
7. לשטוף עם PBS ומיד לקחת micrographs על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים FITC סטנדרטי (ננומטר 488 Ex, ננומטר Em 515). השתמש בהגדלה של פי 100. בצע triplicates מ ללא שינוי כמו גם דגימות מטופל.
8. באמצעות תוכנת ImageJ לקבוע את האזור מאוכלס על ידי התאים. לחלופין לספור את התאים באופן ידני או להשתמש ImageJ. שני השיטות תיתנה מידע דומה על התקשרות הצמיחה של תאים על פני השטח בהתאמה.

תוצאות

התוצאות של צעדי תגובה הכימיים המכריע נוטרו ידי ספקטרוסקופיה IR (איור 1). ההפעלה הראשונית עם נתרן naphthalenide יוצרת קשרים כפולים - ובמידה קטין - OH-פונקציות. האות המציינת C = אג"ח ג להיעלם בסיום חמצון, מניב משטח ועליו כמעט באופן בלעדי הידרוקסיל-ק...

Discussion

התיאור המפורט של פרוטוקול שינוי פני השטח של PTFE מורכב צעדים רצופים החל חיסול פלואור מן השדרה פולימר כמתואר באיור 6. כתוצאה מכך, שכבה נוצר המכיל כמות בשפע של קשרים כפולים פחמן-פחמן מצומדות בהתאם לצבע החום הכהה שהתפתח על טיפול naphthalenide. חמצון רגיל עם מי חמצן חומצי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE foil 0.5 mm	Cadillac Plastic	n/a
REDV peptide	Genecust	n/a	custom synthesis >95% purity
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tetrahydrofurane (THF)	Sigma Aldrich	401757
dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
molecular sieve 3 Å	Sigma Aldrich	208574
sodium metal	Sigma Aldrich	483745
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naphthalene	Sigma Aldrich	147141
hydrogen peroxide 30%	Sigma Aldrich	95321
trichloroacetic acid	Sigma Aldrich	T6399
diethylene glycol diglycidyl ether	Sigma Aldrich	17741
hexamethylene diisocyanate (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calcein-AM	Sigma Aldrich	56496
sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
sodium azide	Sigma Aldrich	71290
24 well plates	Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850	Nicolet	n/a
fluorescence microscope Olympus X-70	Olympus	n/a
humbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE vascular graft	Gore	n/a