Nasschemie und Peptid Immobilisation auf Polytetrafluoroethylen für verbesserte Zellhaftung

Zusammenfassung

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Zusammenfassung

Stiften Materialien Oberfläche mit zellKlebeEigenschaften ist eine gemeinsame Strategie in Biomaterial Forschung und Tissue Engineering. Dies ist besonders interessant für bereits zugelassene Polymere, die eine langjährige Verwendung in der Medizin haben, weil diese Materialien sind gut charakterisiert und rechtliche Fragen bei der Einführung im Zusammenhang von neu synthetisierten Polymere vermieden werden können. Polytetrafluorethylen (PTFE) ist eine der am häufigsten verwendeten Materialien für die Herstellung von Gefäßprothesen, aber das Polymer fehlt Förderung Merkmale Zelladhäsion. Endothelialisierung, dh eine vollständige Abdeckung der Transplantate Innenfläche mit einer konfluenten Schicht von Endothelzellen ist der Schlüssel für eine optimale Leistung angesehen, vor allem durch Thrombogenität der künstlichen Schnittstelle reduziert wird .

Diese Studie untersucht, das Wachstum von Endothelzellen auf Peptid-modifiziertem PTFE und vergleicht diese Ergebnisse mit denen auf unmodifizierte Substrat erhalten. Kupplung mit demendotheliale Zellen-Haftungs-Peptid Arg-Glu-Asp-Val (REDV) über die Aktivierung des fluorin enthaltenden Polymers unter Verwendung des Reagenzes Natriumnaphthalenid, gefolgt durch nachfolgende Konjugation Schritten durchgeführt. Zellkulturen Zellen (HUVECs) und eine hervorragende Zellwachstum auf Peptid-immobilisierte Material unter Verwendung von humanen Umbilical Vein Endothelial erreicht wird, ein Zeitraum von zwei Wochen gezeigt über.

Einleitung

Verschiedene Polymere in der Medizin eingesetzt , die seit einiger Zeit zugelassen wurden keine verbesserte Biokompatibilität aufweisen, das heißt, der Mangel an Zell-Haft, Induktion von fibrotischen Verkapselung und Thrombogenität, um nur einige zu nennen. Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und dem biologischen System erfolgt hauptsächlich an der Oberfläche des Implantats. Als Folge hat sich die Forschung auf die Oberflächenmodifikation konzentriert, um geeignete Eigenschaften für eine gewünschte Anwendung zu schaffen, während die Volumeneigenschaften des Materials unbeeinflusst bleibt. Polytetrafluorethylen (PTFE) als ein physiologisch inertes Polymer wird in vielen medizinischen Gebieten, wie Hernie chirurgisches Netz ^1, medizinische Anschlüsse ² verwendet und, am wichtigsten, vaskuläre Transplantate ^3.

Insbesondere in Blut in Kontakt Situationen die hydrophobe Natur von PTFE verursacht unspezifische Adsorption von Plasmabestandteilen und als Folge Thrombozytenadhäsion, oft in thromboti ergebc Ereignisse und Okklusion des Transplantats ^4. Weiterhin PTFE, wie die meisten Polymere nicht unterstützt Zelladhäsion und Abdeckung , die ein wünschenswertes Merkmal ⁵ wäre die Bildung einer nützlichen Schicht von Endothelzellen (ECs) auf der inneren (luminale) Oberfläche des vaskulären Transplantats zu induzieren. Eine biomimetische Endothel wird erwartet , dass viele der Funktionen seiner natürlichen Äquivalent zu erfüllen, vor allem seine antithrombogenen Eigenschaften ^6. Eine allgemeine biomimetischen Modifikationsstrategie basiert auf dem Konzept der ausschließlich das Material mit Zellhaftfähigkeit verleihen, während die Eigenschaften Materialien bulk verlassen unberührt. Zusätzlich kann Thrombozytenadhäsion durch Einarbeiten antiadhäsive (anti-fouling) Attribute ⁷ reduziert werden. Verschiedene Peptide - meist aus Proteinen der extrazellulären Matrix abgeleitet ist - wurden beschrieben , die stark durch die Bindung an zelluläre Rezeptoren gehört zu der Klasse von Integrinen ⁸ Zelladhäsion verbessern. Das Seinst bekanntes Beispiel in dieser Hinsicht ist das Peptid Arg-Gly-Asp (RGD), die mit den meisten Zelltypen interagiert. Andere Aminosäuresequenzen werden durch Integrine exprimiert ausschließlich auf spezifische Zellen erkannt. Zum Beispiel Arg-Glu-Asp-Val (REDV-) und Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR-) wurden ECs zu binden , in einer bestimmten Art und Weise ⁹ gefunden. Kovalente Immobilisierung solcher Peptide wurde auch von Natur aus nicht klebenden Materialien durchgeführt auf einer Vielzahl von Metallen und Polymeren ^10,11.

Poröse PTFE, genauer aus expandiertem PTFE (ePTFE) - zusammen mit Polyethylenterephthalat (PET) - ist das wichtigste Material für die Herstellung von vaskulären Transplantaten ^12. Etablierte physikalische Techniken für entsprechende Behandlungen, wie Plasmamodifizierung ¹³ oder durch photochemische Verfahren ¹⁴ werden durch die Tatsache behindert , daß poröse und / oder röhrenförmige Strukturen sind nicht leicht behandelbar in den Poren oder dem Lumen verbunden. naßchemischenauf PTFE ist eine schwierige Aufgabe aufgrund der stark inert Natur des fluorin enthaltenden Polymer , das die meisten chemischen Angriffen ¹⁵ widersteht .

In diesem Papier beschreiben wir ein vergleichsweise einfaches Verfahren für eine kovalente Modifikation Strategie. Angepasst von einem Verfahren PTFE bindungsfähig zu machen, funktionelle Gruppen wurden auf der Materialoberfläche geschaffen, die für eine weitere Konjugation von biologisch aktiven Molekülen als Ankerpunkte dienen.

Protokoll

1. Herstellung von Natriumnaphthalenid Aktivierungslösung und Oberflächenaktivierung

Hinweis: Führen Sie die Reaktionen in einem gut belüfteten Abzug durchführen. Die allgemeinen Regeln für den Umgang mit hoch brennbaren Lösungsmitteln und korrosiven Metalle wie metallisches Natrium. Naphtalin hat einen sehr unangenehmen Geruch (mothball), auch in sehr kleinen Mengen! Wenn nicht anders angegeben Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Natriumazid ist hochgiftig! THF (99,9%, siehe Materialliste) wurde über etwa 20% (bezogen auf das Volumen) Molekularsieb gelagert. Destillieren THF mit einem merklichen Wassergehalt über Natrium. Die Bildung von Natriumnaphthalenid tritt nicht auf, wenn Spurenmengen von Wasser vorhanden sind.

1. Zu einer Lösung von 1,4 g (10,9 mmol) Naphthalin in 20 ml Tetrahydrofuran (THF, getrocknet über 3 Å Molekularsieb), Zugabe von 0,25 g (10,9 mmol) Natriummetall in einem Schraubverschluss 100 ml Glasflasche mit einem PTFE- ausgestattet beschichteten magnetischen Rührstab.
   Hinweis: dissolu(- 40 ° C 35) tion kann durch Schneiden des Natrium in kleine Stücke und bescheiden Erwärmung stark verbessert werden. Die endgültige Lösung hat eine dunkle, leicht grünliche Farbe und kann unter streng trocken gelagert werden.
2. Punch-Out-PTFE-Scheiben von 12 mm Durchmesser von 0,5 mm dicken Folienmaterial. Markieren Sie eine Seite (zB mit einem Brief Stempel Stempel) und sauber und mit iso-Propanol.
3. Inkubieren PTFE-Proben einzeln in der Aktivierungslösung (Schritt 1.1) mit 1 - 2 Minuten mit einer Pinzette. Hinweis: Der Farbumschlag von weiß bis dunkelbraun erfolgreiche Behandlung zeigt.
4. Anschließend spülen zweimal mit THF und dann mit Isopropanol.
   Hinweis: Die Naphthalenid ist erschöpft, wenn seine Farbe ändert sich zu einem wässrig hellbraun. Nicht verwendete Naphthalenid Lösung (möglicherweise metallisches Natrium enthält) muss durch langsam zerlegt werden, indem Isopropanol vor der Entsorgung.
5. Oxidieren behandelten Proben in Wasserstoffperoxid (30%) 20% (w / v) Trichloressigsäure für 3 Stunden. Waschenmit Wasser und trocken. Die Oberfläche hat jetzt eine leichte bräunliche Aussehen. Hinweis: Die Aktivierung und Oxidation führt zu einer drastisch erhöhten Benetzbarkeit der Oberfläche. Diese Feststellung wurde im Detail zuvor ¹⁴ untersucht.
6. Behandeln Sie oxidierte Scheiben mit 50% (v / v) Hexamethylendiisocyanat (HMDI) in trockenem THF 2 h gründlich mit THF und trocknen lassen.
7. Hydrolysieren Isocyanat Lagerproben in Wasser für 2 - 3 Stunden und trocken. Anmerkung: Die endgültige aminofunktionalisierte PTFE-Oberfläche als die Isocyanat-tragenden Proben wesentlich stabiler ist und ist kompatibel mit vielen Standard-Vernetzer für die weitere Kupplung.

2. Peptide Immobilisation

1. Eine Lösung aus 20% (v / v) Diethylenglycol-diglycidylether (Diepoxid) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9.
2. Legen Sie die aminierte Scheiben mit der markierten Seite nach oben einzeln in eine 24-Well-Platte und fügen Sie 1,5 ml der Epoxid-Lösung. Achten Sie darauf, eine vollständige Abdeckung der Proben. Inkubieren für 2 Stunden und waschen zweimals mit Wasser und einmal mit Carbonatpuffer.
3. Zugabe von 50 ul einer 0,5 mg / ml Peptid (zB REDV) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9 , enthaltend 0,01% NaN _3, auf den Boden der einzelnen Vertiefungen einer frischen 24 - Well - Platte und legen sorgfältig die epoxy-funktionalisierten Scheiben upside -down (dh markierte Seite nach unten) auf den Abfall der Peptidlösung. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Boden des Bohrlochs und der PTFE Scheibe Kapillarwirkung aufgrund vollständig benetzt wird.
4. Inkubieren in einer feuchten Kammer (zB jede verschließbaren Plastikkasten mit einem dicht schließendem Deckel) mit befeuchteten Atmosphäre (durch nasse Seidenpapier auf dem Boden platzieren) für mindestens 3 Stunden oder über Nacht.
   Hinweis: Wenn auch das REDV- Motiv als gut charakterisiert, kann ein Rühr- oder Reverse Aminosäuresequenz angesehen werden kann als zusätzliche Negativkontrolle einbezogen werden.
5. Waschen dreimal mit Wasser und Sterilisieren in 50% iso-Propanol / Wasser für mindestens 30 min. Vor der Aussaat zu Zelle, rinse die Proben in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).

3. Zell Seeding

1. Wachsen HUVECs unter Verwendung von Standardzellkulturverfahren ^17,18.
2. Legen Sie die Peptid-konjugierten Proben mit der modifizierten Seite nach oben in einer 24-Well-Platten. Verwenden Sie unbehandelten PTFE-Discs als Kontrolle.
3. Seed 5 x 10 ⁴ HUVECs in 2 ml Medium pro Vertiefung und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ in einem Inkubator.
4. Entfernen Sie die Scheiben gründlich sorgfältig ungebunden Zellen zu entfernen und in ein frisches 24-Well-Platte. 2 ml frisches Medium und Inkubation für den gewünschten Zeitraum (zB 24 Stunden, 1 w, etc.). Ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
5. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg / ml Calcein-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO).
6. Nach dem Züchten der Zellen des Mediums, Waschen mit PBS entfernen und PBS , das 1 & mgr; l / ml Calcein-AM - Färbung (beispielsweise 1 & mgr; l einer Stammlösung pro ml PBS) hinzuzufügen. Vorsichtig geschwenkt und INCUBATe bei 37 ° C für 45 min im Dunkeln.
7. Waschen mit PBS und sofort nehmen mikroskopische Aufnahmen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit Standard-FITC-Filter ausgestattet (Ex 488 nm, Em 515 nm). Verwenden Sie das 100-fache Vergrößerung. Führen Sie Triplikaten von unmodifizierten sowie behandelten Proben.
8. Mit ImageJ Software bestimmen den Bereich von den Zellen besiedelt. zählen Alternativ können die Zellen manuell oder ImageJ verwenden. Beide Verfahren geben ähnliche Informationen über die Anhaftung und das Wachstum von Zellen auf den jeweiligen Oberflächen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der entscheidenden chemischen Reaktionsschritte wurden durch IR - Spektroskopie (Figur 1) überwacht. Die anfängliche Aktivierung mit Natriumnaphthalenid erzeugt Doppelbindungen - und in geringerem Umfang - OH-Funktionalitäten. Das Signal, das anzeigt C = C-Bindungen verschwinden bei der Oxidation, eine Oberfläche ergibt sich fast ausschließlich Hydroxyl-Gruppen tragen. Analyse weiterer Standard Konjugation Schritte sind hier nicht dargestellt. Die Far...

Diskussion

Die detaillierte Beschreibung der Oberflächenmodifikationsprotokoll PTFE besteht aus aufeinanderfolgenden Stufen unter Abspaltung von Fluor aus dem Polymergerüst in 6 als dargestellt zu starten. Als Ergebnis wird eine Schicht gebildet, die eine reichliche Menge an konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff - Doppelbindungen enthält , in gemäß der dunkelbraune Farbe, die auf Naphthalenid Behandlung entwickelt. Standard Oxidation mit sauren Wasserstoffperoxid ergibt eine hydroxylierte Oberfläche durch Auf...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE foil 0.5 mm	Cadillac Plastic	n/a
REDV peptide	Genecust	n/a	custom synthesis >95% purity
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tetrahydrofurane (THF)	Sigma Aldrich	401757
dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
molecular sieve 3 Å	Sigma Aldrich	208574
sodium metal	Sigma Aldrich	483745
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naphthalene	Sigma Aldrich	147141
hydrogen peroxide 30%	Sigma Aldrich	95321
trichloroacetic acid	Sigma Aldrich	T6399
diethylene glycol diglycidyl ether	Sigma Aldrich	17741
hexamethylene diisocyanate (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calcein-AM	Sigma Aldrich	56496
sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
sodium azide	Sigma Aldrich	71290
24 well plates	Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850	Nicolet	n/a
fluorescence microscope Olympus X-70	Olympus	n/a
humbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE vascular graft	Gore	n/a