향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

요약

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

초록

물질이 세포 접착 특성과 표면 부여하는 것은 생체 재료 연구와 조직 공학의 일반적인 전략이다. 이는이 물질이 잘 피할 수 새롭게 합성 된 고분자의 도입과 관련된 특성화 및 법적 문제 때문에 의학의 오랜 사용이 이미 승인 폴리머에 특히 흥미 롭다. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)은 혈관 이식편의 제조에 가장 자주 사용되는 물질 중 하나이지만, 중합체의 기능을 촉진하는 세포 접착 성이 부족하다. 에 내피 세포, 즉, 내피 세포의 융합 층과의 접목 내면 전체에 따르면 주로 인공 인터페이스 혈전을 감소시켜 최적의 성능 키를 간주한다.

본 연구는 펩티드 변성 PTFE에 내피 세포의 성장을 조사하고 변경되지 않은 기판 상에 얻은 결과를 비교한다. 와 커플 링내피 세포 접착 펩타이드의 Arg-Glu가-: ASP 발 (REDV)는 이후 접합 공정 다음에, 시약 나트륨 나프탈렌 나이드를 사용 fluorin 함유 중합체의 활성화를 통해 수행된다. 세포 배양액은 2 주 기간에 걸쳐 증명되는 펩티드를 고정화 재료에 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를) 우수한 세포 성장을 이용하여 달성된다.

서문

즉, 향상된 생체 적합성, 세포 접착 부족, 섬유 성 캡슐화 및 혈전 형성의 유도를 전시하지 않는 몇 시간 동안 승인 된 의학에서 사용되는 다양한 폴리머는 몇 가지를 언급합니다. 바이오 물질 및 생물학적 시스템 사이의 상호 작용은 주로 임플란트의 표면에서 발생한다. 결과적으로, 많은 연구가 영향을받지 않는 재료의 벌크 특성을 남기면서, 원하는 응용에 적합한 특성을 생성하기 위해 표면 개질에 집중하고있다. 생리 학적으로 불활성 중합체 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)의 탈장 등 외과 메쉬 ^한 가장 중요한 의학적 포트 ^(2), 혈관 이식편 ^3으로 많은 의료 분야에서 사용된다.

특히 피 접촉 상황에서 PTFE의 소수성은 종종 thromboti 결과 결과 혈소판 혈장 접착 성분 등의 비특이적 흡착을 야기C 이벤트 및 이식 ^4의 폐쇄. 또한, PTFE는 대부분의 중합체와 같은 바람직한 특징은 혈관 그래프트 ^(5)의 내면 (내강) 표면에서 혈관 내피 세포 (EC에)의 유용 층의 형성을 유도하는 것 세포 부착 및 커버리지를 지원하지 않는다. 생체 모방 내피는 특히 그 antithrombogenic 특성 ⁶ 자연 등가의 많은 기능을 수행 할 것으로 예상된다. 일반적인 생체 모방 변형 전략은 영향을받지 않는 물질 벌크 특성을 남기고 전적으로 세포 접착 성 재료를 부여하는 개념에 기초한다. 또한, 혈소판의 부착을 방지 접착제 (방오) ⁽⁷⁾ 특성을 도입함으로써 감소 될 수있다. 각종 펩티드 - 대부분의 세포 외 기질 단백질로부터 유래는 - 강하게 인테그린 ^(8)의 클래스에 속하는 세포 수용체에 결합하여 세포 부착을 향상시키는 것이 기재되어있다. 수이와 관련하여, 예를 세인트 알려진 대부분의 세포 유형과 상호 작용하는 펩타이드의 Arg-의 Gly-의 Asp (RGD)이다. 다른 아미노산 서열이 전적으로 특정 세포에 발현 인테그린에 의해 인식된다. 예를 들어,의 Arg-의 Glu-ASP를-발 (REDV)와 티르 - 일드-의 Gly-빼앗아, 인수 (YIGSR)는 특정 방식으로 ^9되는 EC에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 펩티드의 공유 고정화 금속 및 폴리머 ^{10, 11를} 포함한 본질적으로 비 - 접착 성 물질의 과다에 대해 수행되었다.

다공성 PTFE,보다 정확하게 PTFE (의 ePTFE) 확장 - 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)와 함께 - 혈관의 제조를위한 가장 중요한 물질 ¹² 접목이다. 플라즈마 개질 ⁽¹³⁾ 또는 광 화학적 방법 ^(14)에 의해 적절한 치료를위한 확립 된 물리적 기술은, 다공성 및 / 또는 튜브형 구조는 각각 구멍 또는 내강 안에 용이하게 치료할 수없는 사실에 의해 방해된다. 습식 화학PTFE에 있기 때문에 대부분의 화학 공격 ¹⁵ 견디는 fluorin 함유 중합체의 높은 불활성 자연의 어려운 작업입니다.

본 논문에서는 공유 수정 전략 비교적 손쉬운 방법을 설명합니다. PTFE의 본딩을 렌더링하는 과정에서 적응, 작용기는 생물학적 활성 분자의 추가 활용을위한 기준점 역할을 재료 표면에 만들어졌습니다.

프로토콜

나트륨 나프탈렌 나이드 활성화 솔루션 및 표면 활성화 1. 준비

참고 : 통풍이 잘되는 흄 후드에서 반응을 수행하십시오. 가연성 용제 및 금속 나트륨과 같은 부식성 금속을 처리하는 일반적인 규칙을 따르십시오. 나프탈​​렌은 매우 적은 양이라도 매우 불쾌한 냄새 (좀약)를 가지고! 달리 명시하지 않으면 반응은 실온에서 수행된다. 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다! THF 분 자체 (부피)를 통해 약 20 %를 저장했다 (99.9 %은, 재료의 목록 참조). 나트륨에 비해 눈에 띄는 수분 함량과 THF를 증류. 물에 미량 존재하는 경우 나트륨 나프탈렌 나이드의 형성이 발생하지 않는다.

1. (3 Å 분 자체상에서 건조 THF) 20 ㎖, 테트라 히드로 푸란, 나프탈렌 1.4 g (10.9 mmol)의 용액을 위해, PTFE- 구비 한 스크류 캡 100 ㎖ 유리 병에 0.25 g (10.9 mmol)의 나트륨 금속을 추가 코팅 된 자기 교반 막대.
   참고 : Dissolu을(- 40 ° C에서 35) 기 크게 작은 조각 적당한 가열로 나트륨을 절단함으로써 향상 될 수있다. 최종 용액을 어두운 약간 녹색 컬러를 가지며 엄격 건조 조건하에 저장 될 수있다.
2. 0.5 mm 두께의 박막 재료 12mm 직경의 PTFE 디스크를 펀칭. 마크 한면 (예를 들어, 편지 우표 펀치 사용) 이소프로판올와 청소를.
3. 2 분 사용 집게 - 1의 활성화 용액 (1.1 단계)에서 개별적으로 PTFE-샘플을 품어. 참고 : 어두운 갈색 흰색에서 색상 변화가 성공적인 치료를 나타냅니다.
4. 그 후 이소프로판올로 두 번 THF와 다음 씻어.
   참고 : 나프탈렌 나이드 용액이 소진 될 때 물 밝은 갈색으로 색상이 변경됩니다. (아마도 금속 나트륨을 포함하는) 미사용 나프탈렌 나이드 용액을 천천히 폐기 전에 이소프로판올을 첨가하여 분해한다.
5. 과산화수소 (30 %) 3 시간 동안 트리클로로 아세트산 (/ V W)의 20 %를 함유하는 샘플을 산화 처리. 빨래물과 건조와. 표면은 지금 약간의 갈색 외관을 가지고있다. 주 : 활성화 및 산화 결과를 표면의 대폭 증가 습윤성. 이 연구 결과는 이전에 ¹⁴ 자세히 조사 하였다.
6. 2 시간 동안 건조 THF 50 % (v / v)의 헥사 메틸렌 디 이소시아네이트 (HMDI)와 산화 디스크를 치료 THF로 씻어 건조 둡니다.
7. 3 시간 건조 - 2 물에 이소시아네이트 베어링 샘플을 가수 분해. 주 : 최종 아미노 - 작용 PTFE 표면 훨씬 안정 이소시아네이트 - 함유 샘플보다 더욱 많은 결합 가교제 표준과 호환된다.

2. 펩타이드 고정화

1. 탄산 완충액, pH가 9에서 50 mM의 20 % (v / v)의 디 에틸렌 글리콜 디 글리시 딜 에테르 (디 에폭시)의 용액을 준비한다.
2. 개별적으로 24 웰 플레이트에 표시된면이 위로와 민화 디스크를 놓고 에폭시 용액 1.5 ml를 추가합니다. 샘플의 전체 범위를 확인합니다. 2 시간 동안 품어 두 씻어시간 물에 한 번 탄산 버퍼.
3. 신선한 24 웰 플레이트의 각 우물의 바닥에, NaN가 ₃ 0.01 %를 포함하는 50 밀리미터에서 0.5 ㎎ / ㎖ 펩타이드 (예를 들어, REDV) 탄산 완충액, pH가 9의 50 μl를 추가 조심스럽게 에폭시 작용 디스크의 상승 여력이 배치 -down 펩타이드 솔루션의 드롭에 (즉, 아래 좌우로 표시). 우물의 바닥과 PTFE 디스크 사이의 공간이 완전히 모세관 현상으로 침수되어 있는지 확인합니다.
4. 습식 챔버에 품어 (예를 들어, 꽉 닫는 뚜껑있는 밀폐 플라스틱 상자) 가습 분위기 하룻밤 적어도 3 시간 또는 위해 (바닥에 젖은 티슈 페이퍼를 배치하여).
   주 : REDV 모티프뿐만 특성화 간주 될 수이기는하지만 스크램블링 또는 역방향 아미노산 서열은 부가적인 대조군으로서 포함 할 수있다.
5. 물로 3 회 세척하고 적어도 30 분 동안 50 % 이소프로판올 / 물에 소독. 시드, RINS 셀에 앞서멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에서 샘플을 전자.

3. 셀 시드

1. 표준 세포 배양 절차 ^{(17, 18)를} 사용하여 HUVECs를 성장.
2. 24 웰 플레이트에서 수정 된면이 위로와 펩티드 결합 된 샘플을 놓습니다. 대조군으로 치료 PTFE 디스크를 사용합니다.
3. 종자 5 × 10 ⁴ 웰 당 2 ml의 배지에서 HUVECs를하고 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간 5 % CO ₂ 품어.
4. 디스크를 제거하고 부착되지 않은 세포를 제거하고 신선한 24 웰 플레이트로 전송 조심스럽게 씻어냅니다. 원하는 기간 동안 새로운 배지 2 ㎖를 추가하고 배양 (예를 들어, 24 시간, w 1 등). 이틀 매체 변경합니다.
5. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 1 ㎎ / ㎖ 칼 세인 AM의 스톡 용액을 제조 하였다.
6. 성장 후, 세포 배지를 제거하고 PBS로 세척 한 PBS 함유 μL / mL의 칼 세인 AM 얼룩을 추가 (예컨대, PBS 용액 당 원액 1 μL). 부드럽게 교반과 incubat어둠 속에서 45 분 동안 37 ° C에서 전자.
7. 표준 FITC 필터가 장착 된 형광 현미경에 현미경을 (예 488 nm의, 엠 515 ㎚) 즉시 PBS로 세척합니다. 100 배의 배율을 사용합니다. 수정되지 않은에서 삼중뿐만 아니라 처리 된 샘플을 수행합니다.
8. ImageJ에 소프트웨어를 사용하면 세포에 의해 식민지 영역을 결정합니다. 또는 수동으로 세포를 계산 또는 ImageJ에 사용합니다. 두 방법 모두 각각의 표면에 부착 및 세포의 성장에 대한 유사한 정보를 제공합니다.

결과

중요한 화학 반응 공정의 결과는 IR 스펙트럼 (도 1)에 의해 모니터링 하였다. 나트륨 나프탈렌 나이드와 초기 활성화는 이중 결합을 생성 - 그리고 작은 범위 - OH-기능. 신호를 나타내는 C = C 결합은 거의 독점적으로 수산기 그룹 베어링 표면을 산출 산화에 사라집니다. 또한 표준 접합 단계의 분석은 여기에 표시되지 않습니다. 활성화 및 산화에 의한 색상 변?...

토론

PTFE 표면 개질 프로토콜의 상세한 설명은도 6에 도시 된 바와 같이 중합체 골격으로부터의 불소의 제거로 시작하는 연속적인 단계로 구성된다. 결과적으로, 층의 공액 탄소 - 탄소 이중 결합의 풍부한 양을 포함하는 형성되고 나프탈​​렌 나이드 치료에 개발 된 어두운 갈색 색상에 따라. 산성 과산화수소와 표준 산화는 옅은 갈색으로 밝게 동행 수산화면,이 이중 결합의 손실을 반?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE foil 0.5 mm	Cadillac Plastic	n/a
REDV peptide	Genecust	n/a	custom synthesis >95% purity
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tetrahydrofurane (THF)	Sigma Aldrich	401757
dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
molecular sieve 3 Å	Sigma Aldrich	208574
sodium metal	Sigma Aldrich	483745
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naphthalene	Sigma Aldrich	147141
hydrogen peroxide 30%	Sigma Aldrich	95321
trichloroacetic acid	Sigma Aldrich	T6399
diethylene glycol diglycidyl ether	Sigma Aldrich	17741
hexamethylene diisocyanate (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calcein-AM	Sigma Aldrich	56496
sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
sodium azide	Sigma Aldrich	71290
24 well plates	Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850	Nicolet	n/a
fluorescence microscope Olympus X-70	Olympus	n/a
humbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE vascular graft	Gore	n/a